缺氧誘導(dǎo)因子-1α 基因G1790A 多態(tài)性與慢性牙周炎易感性分析

田 麗，梁國輝，廖志宏

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是由牙周病原菌群失衡所引起牙周組織的一種慢性炎癥[1，2]，是一種乏氧性疾病。 乏氧環(huán)境在CP 發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[3~5]，其中乏氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)高度特異性核轉(zhuǎn)錄因子，其基因突變與多種乏氧性疾病有關(guān)[3~7]，但與CP 發(fā)病的易感性未見報道， 且多態(tài)性分布存在地域性和種族性差異。 血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelial growth factor，VEGF） 是HIF-1α 調(diào)節(jié)的一種主要下游靶基因[8]。 25-羥基維生素D[25-hydroxyvitamin D，25-（OH）VitD] 是骨代謝調(diào)節(jié)的一種重要激素，具有多種生物效應(yīng)[9]。 為此，筆者對深圳地區(qū)CP 患者和健康人群HIF-1α、VEGF、25-（OH）VitD 水平與CP臨床指標的相關(guān)性及HIF-1α 基因（hypoxia inducible factor-1α gene，HIF-1α）G1790A 位點多態(tài)性進行分析，探討其在CP 發(fā)病中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 臨床材料與儀器

1.1.1 臨床材料

選擇2020 年3 月至2022 年5 月CP 確診者137例（CP 組），其中男性81 例，年齡16 ～58 歲，平均年齡31.89 歲（標準差15.67 歲）；女性56 例，年齡17 ～56 歲，平均年齡32.04 歲（標準差14.72 歲）；疾病程度，輕度79 例，中度31 例，重度27 例。 同期非CP 健康體檢人群115 例（對照組），其中男性69 例，年齡15 ～57 歲，平均年齡30.28（標準差13.95 歲）；女性46 例，年齡16 ～59 歲，平均年齡32.86（標準差15.03歲）。 該研究對象及家屬知情，并簽定知曉同意書，同時已通過單位倫理委員會批準。

選擇標準：①所有患者均符合《牙周病學》[10]中的診斷標準；②CP 初診者，并根據(jù)牙周袋探診深度、附著喪失（attachment loss，AL）及骨吸收程度分為輕度[牙齦有炎癥和探診出血，牙周袋深度（probing depth，PD）≤4 mm，1 ≤AL ＜3 mm，X 射線片顯示牙槽骨吸收不超過根長的1/3，可有口腔異味]、中度（牙齦有炎癥和探診出血， 也可有膿，PD ≤6 mm，3 ≤AL ＜5 mm，根長1/3< 牙槽骨水平或角型吸收< 根長1/2， 牙齒可有輕度松動，多根牙根分叉區(qū)可有輕度病變）及重度（炎癥較明顯或發(fā)生牙周膿腫，PD>6 mm，AL ≥5 mm，牙槽骨吸收>根長1/2，多根牙有根分叉，多數(shù)牙齒有松動）；③AL ＞1 mm，牙槽骨有垂直或水平型吸收；④PD ＞3 mm，牙周袋伴有炎癥，且探診后出血；⑤自愿參與配合者。

排除標準：①近3 個月內(nèi)服過抗生素、類固醇類及維生素D 等藥物者；②有牙周基礎(chǔ)治療史者；③伴有高血壓、 糖尿病及心腦血管等全身系統(tǒng)性疾病者；④伴有家族遺傳史者；⑤有吸煙史者；⑥月經(jīng)、妊娠及哺乳期者；⑦伴有腫瘤、血液性疾病者；⑦伴有其它乏氧性疾病者。

兩組年齡、性別比例等臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.1.2 主要試劑與儀器

HIF-1α、VEGF 試劑盒（上海科順， 中國）；DNA試劑盒（深圳亞能，中國）。

ABI7500 PCR 儀（ABI，美國）；AE275 酶免儀（深圳愛康， 中國）；C8000 化學發(fā)光分析儀及25-（OH）VitD 試劑盒（雅培，美國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗室檢查

取靜脈血2.0 ～3.0 mL，分離血清；采用酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測HIF-1α 和VEGF 水平。

取靜脈血2.0 ～3.0 mL，分離血清，采用C8000 化學發(fā)光分析儀對25-（OH）VitD 水平進行檢測， 操作依規(guī)程進行。

1.2.2 聚合酶鏈式反應(yīng)

DNA 提?。?取乙二胺四乙酸二鉀（dipotassium ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA-K2）抗凝全血，采用DNA 提取盒提取全血組DNA，并將提取到符合實驗要求的DNA 于-20 ℃冰柜內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

HIF-1α G1790A 位點多態(tài)性分析：運用限制性片段長度多態(tài)性-聚合酶鏈式反應(yīng)法對HIF-1α G1790A位點多態(tài)性進行分析，具體操作參照文獻[11]。

1.2.3 牙周臨床指標檢查

對CP 患者進行牙周檢查，并記錄PD、AL、出血指數(shù)（bleed index，BI）及菌斑指數(shù)（plague index，PLI）。

1.2.4 評價指標

包括HIF-1α、VEGF、25-（OH）VitD、HIF-1aG1790A位點多態(tài)性、PD、AL、BI 及PLI。

1.3 統(tǒng)計學方法

運用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 以均值±標準差和率（%）分別表示計量和計數(shù)資料，運用t/χ2檢驗比較組間差異； 運用Hardy-Weinberg 檢驗遺傳平衡。 P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平比較

CP 組HIF-1α 和VEGF 水平明顯高于對照組，而25-（OH）VitD 水平明顯低于對照組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 見表1。

表1 兩組血清HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平比較Tab.1 Comparison of levels of HIF-1α,VEGF and 25-(OH)VitD between 2 groups

2.2 慢性牙周炎組不同病情程度患者HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平比較

HIF-1α 和VEGF 水平重度> 中度> 輕度，而25-（OH）VitD 水平重度< 中度< 輕度， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 見表2。

表2 CP 組不同病情程度患者HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平比較Tab.2 Comparison of HIF-1α,VEGF and 25-(OH)VitD levels in CP patients with different severity

2.3 慢性牙周炎組不同病情程度患者牙周臨床指標比較

PD、AL、BI 及PLI 值重度> 中度> 輕度， 不同病情程度之間差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 見表3。

表3 CP 組不同病情程度CP 患者牙周臨床指標比較Tab.3 Comparison of periodontal clinical indexes of CP patients with different severity

2.4 慢性牙周炎組HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平與牙周臨床指標的相關(guān)性

經(jīng)Pearson 相關(guān)分析， 結(jié)果顯示，CP 組HIF-1α、VEGF 水平與PD、BI、AL、PLI 呈正相關(guān)，而25-（OH）VitD 水平呈負相關(guān)（P ＜0.05）。 見表4。

表4 CP 組HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平與牙周臨床指標的相關(guān)性Tab.4 Correlation between HIF-1α,VEGF and 25-(OH)VitD levels and periodontal clinical indexes in CP group

2.5 兩組HIF-1α 基因G1790A 位點多態(tài)性

CP 組和對照組HIF-1αG1790A 位點均檢出3 種基因型（GG、GA 和AA），經(jīng)Hardy-Weinberg 檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.3014，P>0.05）。取樣具有代表性（圖1）。

圖1 HIF-1α G1790A 位點測序圖Fig.1 Sequencing map of HIF-1α G1790A

與對照組對比，CP 組AA 基因型及A 等位基因頻率明顯升高，而GG 基因型及G 等位基因頻率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；但GA 基因型頻率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 見表5。

表5 兩組HIF-1α G1790A 位點多態(tài)性比較Tab.5 Comparison of HIF-1α G1790A polymorphism between 2 groups

2.6 慢性牙周炎組不同病情程度患者HIF-1α G1790A 位點多態(tài)性

HIF-1α G1790A 位點基因型和等位基因頻率在CP 組不同病情程度患者中差異無統(tǒng)計學意義 （P>0.05）。 見表6。

表6 不同病情程度CP 患者HIF-1α G1790A 位點多態(tài)性比較Tab.6 Comparison of HIF-1α G1790A polymorphism in CP patients with different severity

2.7 慢性牙周炎組不同基因型患者HIF-1α 水平比較

與GA 和GG 基因型患者HIF-1α 水平（24.03pg/mL和22.74 pg/mL）對比，AA 基因型（37.82 pg/mL）升高尤為突出，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.2689、5.0261，P<0.05）； 但GA 和GG 基因型差異無統(tǒng)計學意義 （t=1.3025，P>0.05）。

3 討論

CP 是由牙周病原菌群失衡引發(fā)牙周軟、 硬組織的一種慢性炎癥性的破壞性病變，常由菌斑性牙齦炎緩慢發(fā)展而成，可導(dǎo)致牙齦萎縮、牙槽骨吸收，甚至牙齒脫落，且CP 發(fā)病率高，約占牙周炎的95%，嚴重影響人身健康和生存質(zhì)量[12，13]。 但CP 發(fā)病機制十分復(fù)雜，給CP 的預(yù)防帶來一定困難。 因此，加強CP 患者發(fā)病機制研究對CP 診斷、病情評估及預(yù)防具有重要的意義。

有研究表明，慢性炎癥可引起牙周組織微循環(huán)障礙及低血流灌注， 從而導(dǎo)致牙周組織乏氧微環(huán)境，而機體在乏氧環(huán)境下可通過多種生物學效應(yīng)促進血管新生、改善細胞代謝及細胞活性調(diào)控相關(guān)分子表達等細胞氧合及存活率[14，15]。 HIF-1α 是介導(dǎo)炎癥、腫瘤等多種乏氧性疾病的一種調(diào)節(jié)蛋白關(guān)鍵因子，與多種乏氧性疾病發(fā)生有關(guān)[16~18]。 VEGF 是一種能促進血管新生，并能維持血管完整性和通透性的特異性有絲分裂原，但最近研究表明，乏氧環(huán)境是血管生成的有利刺激，血管生成與乏氧有密切關(guān)系[19]。 25-（OH）VitD 通過調(diào)節(jié)維生素D（vitamin D，VitD）靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)成骨、破骨及軟骨等細胞分化、增殖及免疫炎癥反應(yīng)，對宿主免疫調(diào)節(jié)和骨密度產(chǎn)生影響，與多種疾病的發(fā)生和進展有關(guān)[20，21]。 以上各指標單獨檢測在CP 中的作用目前已見報道，但聯(lián)合檢測及與牙周臨床指標的相關(guān)性未見報道。 筆者研究結(jié)果顯示，CP 患者HIF-1α、VEGF 水平明顯升高，而25-（OH）VitD 水平明顯降低，且不同病情嚴重程度之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）， 這除了可能與機體在乏氧微環(huán)境下細胞核大量產(chǎn)生和分泌HIF-1α，且HIF-1α 降解途徑受阻于細胞核內(nèi)并聚集，導(dǎo)致其水平增加，而HIF-1α 與HIF-1β 結(jié)合形成HIF-1， 轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)， 并結(jié)合于VEGF 和VEGF 受體編碼基因調(diào)控區(qū)低氧反應(yīng)元件的結(jié)合點上，促進VEGF 水平增加，從而導(dǎo)致VEGF轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)外， 還可能與25-（OH）VitD 水平降低導(dǎo)致其對機體免疫炎癥及骨代謝調(diào)節(jié)能力減弱有關(guān)。結(jié)果還顯示，牙周臨床指標隨著CP 患者病情加重而升高， 而HIF-1α、VEGF 及25-（OH）VitD 水平與CP臨床指標密切相關(guān)，表明上述指標在CP 的發(fā)生和進程中發(fā)揮著重要的作用。

有研究表明，不同地區(qū)、不同人群對CP 的易感性可能存在很大差異， 這種差異主要由遺傳決定，而多種遺傳基因位點多態(tài)性與CP 發(fā)病有關(guān)[22]。 HIF-1由α 和β 亞基構(gòu)成，其生理活性主要由α 亞基決定，而HIF-1α存在多個單核苷酸多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism，SNP）位點，其中G1790A 位點是目前研究最多的位點之一， 與多種疾病發(fā)生有關(guān)[23，24]，但與CP 發(fā)病的相關(guān)性未見報道。 筆者研究結(jié)果顯示，深圳地區(qū)CP 患者HIF-1α G1790A 位點基因突變呈SNP，以AA 基因型和A 等位基因頻率升高尤為明顯， 這表明HIF-1α G1790A 位點SNP 可能與深圳地區(qū)CP 發(fā)病有關(guān)。 同時攜帶AA 基因型CP 患者HIF-1α 水平明顯高于其他基因型（P<0.05），但與病情嚴重程度無關(guān) （P > 0.05）， 這可能與HIF-1α G1790A 位點SNP 通過影響其蛋白質(zhì)水平、結(jié)構(gòu)或生物學活性而在CP 發(fā)病中發(fā)揮作用的。

綜上所述，CP 患者與健康人群HIF-1α、VEGF及25-（OH）VitD 水平存在很大差異， 且與牙周臨床指標密切相關(guān)。 同時HIF-1α G1790A 位點基因突變呈SNP， 可能與深圳地區(qū)CP 發(fā)病存在一定易感性。因此， 加強HIF-1α、VEGF、25-（OH）VitD 水平及HIF-1α G1790A 位點SNP 分析，對CP 診斷、病情評估及發(fā)病機制研究具有重要意義。