殼聚糖基碳點紙芯片檢測槐米中蘆丁含量

樂 薇，蒙利秀，王 源，覃永薇

（武漢工商學院環(huán)境與生物工程學院，湖北 武漢 430065）

蘆丁是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在植物中，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、清除自由基、降血糖、促進血管舒張等多種藥理作用，同時也可用作食品抗氧化劑和色素等，在藥物和食品中的應用越來越廣泛[1-3]?；泵资嵌箍浦参锘睒洌⊿ophora japonicaL.）的干燥花蕾，有涼血止血、清肝瀉火等功效，是一種藥食同源的藥材[4]。槐米是提取蘆丁的主要原料，槐米中蘆丁含量的高低成為決定槐米品質的重要指標[5-6]。由于蘆丁含量受品種、產地、栽培過程和槐米加工技術等多種因素影響[7-9]，因此開發(fā)一種簡便快捷、低廉、現(xiàn)場化的蘆丁檢測方法很有必要。

蘆丁含量的測定方法主要有高效液相色譜法[10-11]、熒光法[12-13]和電化學法[14-15]等。隨著新技術的發(fā)展，碳點因其具有出色的熒光特性、光穩(wěn)定性、制備原料來源廣泛、制備過程簡單多樣等優(yōu)點[16]，在熒光法高效快速測定蘆丁含量中的應用已引起不少學者關注，如Li Huiyu等[17]使用多壁碳納米管作為載體，嗎啉乙磺酸為前體，通過固態(tài)熱裂解法合成了碳點，以此碳點的熒光響應檢測了蘆丁片劑、人尿和人血清樣品中的蘆?。籗induja等[18]利用非必需氨基酸天冬酰胺合成碳點，計算了該碳點與蘆丁的猝滅常數(shù)和結合常數(shù)，并應用于蘆丁片中蘆丁含量測定；丁志杰[19]和王靖原[20]等分別以生物質銀杏葉、紅棗為碳源采用水熱法制備了能用于蘆丁熒光檢測的碳點；此外Xie Xiaoqian等[6]以反蛋白石光子晶體為骨架，以碳點為熒光響應材料，制備了一種對蘆丁有特定識別能力的碳點包埋的分子印跡光子晶體水凝膠，并應用于槐花中蘆丁含量的測定。

紙芯片具有成本低、便攜、操作簡便等優(yōu)點，與智能手機聯(lián)用的微流控紙芯片分析傳感方法被廣泛認為是快速檢測發(fā)展的主流方向[21-22]。目前已有將碳點和紙芯片結合制備碳點紙芯片的報道，如Rossini等[23]采用蠟印并加熱熔化蠟的方法在濾紙上形成疏水屏障，熒光碳點溶液滴加在親水區(qū)，制備出檢測血清和尿液的葡萄糖碳點紙芯片；Liu Cui等[24]用碳點溶液做油墨，通過噴墨打印制備碳點紙芯片；Yen-Linh[25]和Du Xiaoyan[26]等則將剪切法獲得的圓形濾紙片直接滴加或浸泡于碳點溶液制備碳點紙芯片。上述蠟印法和噴墨法需要特殊的儀器，剪切法得到的紙芯片每片僅能測試一個樣品，且蠟印法和剪切法中碳點溶液直接滴加于紙基材料上，碳點與紙基材料的作用力不強，有可能有碳點不耐受樣品液的沖洗出現(xiàn)顯色不均的情況?；诖?，本研究開發(fā)一種殼聚糖基碳點紙芯片，選擇對蘆丁有高選擇性的熒光碳點，利用殼聚糖的成膜性，于濾紙表面形成碳點殼聚糖薄膜，使碳點均勻的固定于紙芯片中，點樣后樣品斑點由于殼聚糖膜適宜的疏水作用可限制在一定區(qū)域內均勻顯色，可同步實現(xiàn)蘆丁標準溶液和多個樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槐米 廣齊生物科技有限公司；D-天冬酰胺（純度98%）、殼聚糖（脫乙酰度≥95%）上海麥克林生化科技有限公司；蘆丁、槲皮素、山柰酚（純度≥99%）天津一方科技有限公司；異鼠李素、綠原酸（純度≥99%）金測分析（天津）有限公司；甲醇（色譜純）天津市凱通化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

JYO2S型紫外分析儀 北京君意東方電泳設備有限公司；721型分光光光度計 上海光譜儀器有限公司；F97Pro熒光分光光度計 上海棱光技術有限公司；小米12智能手機 北京小米科技有限責任公司；定性濾紙（中速）杭州通用電氣生物有限公司；LC-201A高效液相色譜儀 美國英特矽爾公司。

1.3 方法

1.3.1 碳點溶液的制備

根據(jù)文獻[18]，稍作修改。稱取天冬酰胺0.5 g，加熱至200 ℃保溫10 min，冷卻后得到棕色固體粉末，加適量水溶解后10000 r/min離心，取上清液用0.22 μm濾膜過濾，干燥后用0.1 mol/L NaOH溶液溶解配制成一定濃度的碳點溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 碳點-蘆丁二元熒光光譜及碳點-殼聚糖-蘆丁三元熒光光譜

準確移取5 mg/mL的碳點溶液0.2 mL，一定濃度的殼聚糖溶液（1% HAc溶液為溶劑）0.1 mL和一定濃度的蘆丁溶液（50%乙醇溶液為溶劑）1.0 mL，加水稀釋至10 mL，10 min后于激發(fā)波長365 nm處掃描各體系的熒光發(fā)射光譜。

1.3.3 殼聚糖基碳點紙芯片的制備

量取16 mL一定質量濃度的殼聚糖溶液（1% HAc溶液為溶劑）和4 mL不同質量濃度的碳點溶液，磁力攪拌30 min，得含一定濃度的殼聚糖和碳點的鑄膜液。將裁剪好的濾紙條浸入鑄膜液1 min，取出，均勻地刮去濾紙條兩面多余的鑄膜液，平鋪于已洗凈并干燥的玻璃板上，晾干即得殼聚糖基碳點紙芯片。

1.3.4 殼聚糖基碳點紙芯片法的可行性分析

蘆丁標準溶液的制備：準確稱取20 mg蘆丁，加30%乙醇溶液溶解并定容50 mL，得0.4 mg/mL蘆丁溶液。準確移取0.4 mg/mL蘆丁溶液0、0.5、1 mL，加30%乙醇溶液補充體積至1 mL，再加水定容至10 mL，得到0、20、40 μg/mL蘆丁溶液。

按1.3.3節(jié)制備殼聚糖基碳點紙芯，其中殼聚糖質量濃度25 mg/mL、碳點質量濃度10 mg/mL。另將濾紙浸入2 mg/mL碳點溶液中后取出，晾干，即得不含殼聚糖的碳點紙芯片。在不含殼聚糖的碳點紙芯片和殼聚糖基碳點紙芯片上各點樣0、20、40 μg/mL蘆丁標準溶液4 μL，30 min后在波長365 nm處紫外燈照射下觀察顯色斑點情況。

1.3.5 單因素試驗優(yōu)化

為提高碳點紙芯片測定蘆丁的靈敏度，以配制蘆丁溶液的溶劑（即蘆丁質量濃度為0 μg/mL）為空白，考察蘆丁點樣后顯色斑點的紅（R）、綠（G）、藍（B）值的差值（ΔR、ΔB、ΔG），以其為評價指標進行單因素優(yōu)化試驗。

1.3.5.1 殼聚糖濃度的優(yōu)化

按1.3.3節(jié)制備殼聚糖基碳點紙芯片，殼聚糖終質量濃度分別為5、10、15、20 mg/mL，碳點的終質量濃度為5 mg/mL。在紙芯片上加入4 μL 20 μg/mL蘆丁溶液（配制方法同1.3.4節(jié)），顯色30 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片。

1.3.5.2 碳點質量濃度的優(yōu)化

按1.3.3節(jié)制備殼聚糖基碳點紙芯片，殼聚糖終質量濃度為20 mg/mL，碳點終質量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL。在紙芯片上各加入4 μL 10、20 μg/mL蘆丁溶液（配制方法同1.3.4節(jié)），顯色30 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片，并分析顯色斑點的ΔR、ΔG、ΔB值。

1.3.5.3 溶劑優(yōu)化

按1.3.3節(jié)制備殼聚糖基碳點紙芯片，殼聚糖終質量濃度為20 mg/mL，碳點終質量濃度為1.0 mg/mL。在紙芯片上各加入4 μL 10、20 μg/mL蘆丁溶液，蘆丁的溶劑分別為0%、30%、50%、70%乙醇溶液，顯色30 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片，并分析顯色斑點的ΔR、ΔG、ΔB值。

1.3.5.4 點樣體積優(yōu)化

按1.3.3節(jié)制備殼聚糖基碳點紙芯片，殼聚糖終質量濃度為20 mg/mL，碳點終質量濃度為1.0 mg/mL。在紙芯片上滴加不同體積（2、3、4、5、6、7 μL）20 μg/mL蘆丁溶液（溶劑為50%乙醇溶液），顯色30 min后拍攝365 nm波長處的熒光圖片，并分析顯色斑點的ΔR、ΔG、ΔB值。

1.3.5.5 顯色時間優(yōu)化

按1.3.3節(jié)制備殼聚糖基碳點紙芯片，殼聚糖終質量濃度為20 mg/mL，碳點終質量濃度為1.0 mg/mL。在紙芯片上滴加4 μL 20 μg/mL蘆丁溶液（溶劑為50%乙醇），在不同顯色時間（10、15、20、25、30、40、60 min）下拍攝365 nm波長處的熒光圖片，并分析顯色斑點的ΔR、ΔG、ΔB值。

1.3.6 殼聚糖基碳點紙芯片測定槐米中蘆丁的含量

1.3.6.1 蘆丁待測液制備

采取超聲波法[27]制備蘆丁待測液，略有修改?；被ǚ鬯楹鬁蚀_稱取0.1 g，加60%乙醇溶液10 mL，提取溫度45 ℃，超聲時間60 min，提取后，自然冷卻至室溫，過濾后取上清液0.5 mL，加50%乙醇溶液定容至25 mL。

1.3.6.2 蘆丁含量測定

在殼聚糖基紙芯片上，依次滴加4 μL 0、4、10、20、40、60、80、100 μg/mL的蘆丁標準溶液（50%乙醇溶液為溶劑）和供試液，20 min后，將待測紙芯片水平置于紫外分析儀的暗箱中，于365 nm波長處將智能手機鏡頭置于紫外分析儀的相機拍照口，每次拍攝均采用2 倍焦距拍照模式。用Adobe Photoshop CS5.1軟件處理得到整個顯色區(qū)域的R、G、B平均值，然后再將計算得到的對應差值，代入最優(yōu)濃度的擬合方程中，得到供試液中蘆丁質量濃度，按下式計算槐米樣品中蘆丁含量：

式中：V為槐米待測液體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為槐米樣品質量/mg；C為槐米待測液中蘆丁質量濃度/（mg/mL）。

1.3.7 高效液相色譜法測定槐米中蘆丁的含量

1.3.7.1 蘆丁標準溶液及槐米待測液配制

蘆丁標準溶液：精密稱取蘆丁對照品10 mg，加甲醇定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的蘆丁溶液。再分別取2、4、6、8 mL上述溶液，加甲醇稀釋至10mL，得0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL的蘆丁溶液。

槐米待測液：將槐米研碎，用100 目篩子過篩，稱取50 mg，加甲醇50 mL，超聲60 min，冷卻，用甲醇定容至100 mL，搖勻。經0.45 μm濾膜過濾即得槐米待測液。

1.3.7.2 高效液相色譜條件[28]

Inertsil ODS-SP色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-1%冰醋酸（32∶68，V/V）；檢測波長257 nm；室溫；流速1 mL/min；進樣體積10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗至少重復3 次，用Excel 2019軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，結果表示為，采用Origin Pro 2015軟件進行譜圖繪制。

2 結果與分析

2.1 可行性分析

2.1.1 碳點-蘆丁二元熒光光譜及碳點-殼聚糖-蘆丁三元熒光光譜

紙芯片點樣后在365 nm紫外燈照射下觀察熒光顯色斑點，考察存在或不存在殼聚糖時，蘆丁對碳點的熒光猝滅情況。由圖1A可知，蘆丁對碳點有明顯的熒光猝滅現(xiàn)象，質量濃度遠高于蘆丁的殼聚糖也表現(xiàn)出較弱的猝滅作用，蘆丁和殼聚糖的加入均不改變碳點的發(fā)射峰位置。當向碳點-蘆丁體系加入殼聚糖時，發(fā)現(xiàn)碳點的熒光強度繼續(xù)下降，而進一步增加殼聚糖濃度時，碳點熒光強度下降程度減弱。當殼聚糖質量濃度不小于0.1 mg/mL時，體系的熒光強度不再隨殼聚糖質量濃度的變化而變化，且和無殼聚糖體系的熒光強度相差不大，說明在較高殼聚糖質量濃度下，碳點-蘆丁體系的熒光強度幾乎不受殼聚糖質量濃度影響。推測殼聚糖上的氨基和羥基可能與碳點表面的羥基、氨基發(fā)生作用，但殼聚糖空間構型龐大、其自身的氨基和羥基會形成分子內及分子間氫鍵作用，造成其與碳點發(fā)生作用的位點數(shù)量少，從而對碳點有猝滅作用但不明顯；進一步增加殼聚糖質量濃度時，由于殼聚糖的自聚合作用，其表面自由的氨基和羥基進一步減少、空間構型更大，與碳點發(fā)生作用的位點極少，因而對碳點-蘆丁體系的影響可忽略。

圖1 各體系下的熒光光譜（A、B、C）和標準曲線（D）Fig.1 Fluorescence spectra (A,B,C) and standard curves (D) of each system

比較不同蘆丁質量濃度下的碳點-蘆丁熒光發(fā)射光譜（圖1B）和碳點-殼聚糖-蘆丁熒光發(fā)射光譜（圖1C），兩體系的最大發(fā)射波長一致，曲線形狀相似。進一步測定各體系在最大發(fā)射波長450 nm處的熒光強度，以蘆丁質量濃度為0的體系為對照，計算熒光強度改變值ΔF，以ΔF為縱坐標、蘆丁質量濃度C為橫坐標繪制標準曲線（圖1D），發(fā)現(xiàn)殼聚糖存在時，標準曲線線性仍較好，僅斜率略微下降（即檢測靈敏度略下降）。綜上可知，殼聚糖（≥0.1 mg/mL）存在對蘆丁猝滅碳點熒光的影響較小，可將殼聚糖作為載體固定碳點進行紙芯片的制備。

2.1.2 殼聚糖基紙芯片測定蘆丁含量的可行性

如圖2所示，發(fā)現(xiàn)當殼聚糖與碳點混合制成鑄膜液并干燥后，在濾紙上形成了含有碳點的殼聚糖薄膜，碳點可均勻固定在殼聚糖薄膜中，能有效承受沖洗。相比碳點紙芯片，殼聚糖基碳點紙芯片背景更明亮，斑點擴散不明顯，呈現(xiàn)出很好的顯色均勻性，且斑點顏色隨著蘆丁質量濃度的增加呈現(xiàn)梯度變化。

圖2 蘆丁在碳點紙芯片（A）和殼聚糖基紙芯片（B）上的顯色情況Fig.2 Chromogenic reaction of rutin on CD paper chip (A) and nonimprinted paper chip (B)

2.2 檢測機理探討

天冬酰胺含有氨基和羧基，以它為單一原料經熱裂解后可形成表面富含氨基和羧基的碳點[18]。當加入蘆丁時，蘆丁上的羥基能與碳點的氨基和羧基產生氫鍵，由于蘆丁的紫外吸收光譜和碳點的熒光發(fā)射光譜（λEx=365 nm）有重合（圖3），推測蘆丁與碳點發(fā)生了內源性熒光猝滅。

圖3 蘆丁的紫外吸收光譜（a）和碳點的熒光發(fā)射光譜（b）Fig.3 UV absorption spectrum of rutin (a) and fluorescence emission spectrum of CDs (b)

在紙芯片法中，當將殼聚糖和碳點混合后，基于殼聚糖自身的氫鍵作用和其大分子的空間位阻作用，高質量濃度的殼聚糖可在碳點分子周圍產生分子間的堆砌，成膜后即使碳點被固定于殼聚糖膜的縫隙間，碳點表面的氨基和羧基僅有少量與殼聚糖發(fā)生作用，其他大量的氨基和羧基仍裸露于碳點表面，可與蘆丁發(fā)生熒光猝滅。

2.3 殼聚糖基碳點紙芯片的制備優(yōu)化

2.3.1 殼聚糖質量濃度的影響

殼聚糖可改變紙芯片的親水程度，考察鑄膜液中殼聚糖質量濃度對蘆丁顯色的影響（圖4），發(fā)現(xiàn)隨著殼聚糖質量濃度的增加，斑點擴散程度減緩。殼聚糖質量濃度在5、10 mg/mL時顯色斑點擴散明顯，質量濃度15 mg/mL時斑點有部分擴散且顯色圖形不規(guī)則，在20 mg/mL時斑點小且顯色均勻。這是因為殼聚糖低質量濃度時黏度低，能進入濾紙間隙無法成膜，高質量濃度時黏度高，部分殼聚糖未能進入濾紙間隙[29]，可在濾紙表面成膜，殼聚糖分子中豐富的羥基和氨基使殼聚糖分子內和分子間的氫鍵作用較強，分子間堆砌緊密，使膜具有一定的疏水性，從而表現(xiàn)出紙芯片的親水性變弱，由于樣品溶劑為醇-水體系，親水性強，因此樣品溶液點樣后顯色斑點限定在一定的區(qū)域。因此后續(xù)實驗選擇殼聚糖質量濃度為20 mg/mL。

2.3.2 鑄膜液中碳點質量濃度的影響

如圖5所示，隨著碳點質量濃度的增加，ΔR值略有增加而后趨于穩(wěn)定，ΔG值和ΔB值呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在碳點質量濃度為1.0 mg/mL時出現(xiàn)最大值。這是因為碳點質量濃度較大時，背景熒光強度大，造成蘆丁點樣后熒光強度變化不明顯，而添加量較小時，背景熒光強度減弱，且與蘆丁作用的碳點位點變少而造成變化不明顯。故預聚液中碳點的最優(yōu)質量濃度為1.0 mg/mL。

2.4 紙芯片顯色條件的優(yōu)化

如圖6A所示，發(fā)現(xiàn)隨著乙醇體積分數(shù)的增加，由于乙醇的蒸發(fā)作用顯色斑點干燥時間明顯變短，同時溶液的極性減弱、疏水性增強，也造成顯色斑點的面積增大、ΔR、ΔG、ΔB下降，亦即靈敏度減小。綜合考慮干燥時間和靈敏度，選擇乙醇體積分數(shù)為50%。

如圖6B所示，發(fā)現(xiàn)隨著點樣體積的增加，顯色斑點面積略有增加，但干燥所需時間增加明顯。點樣體積過小或過大也造成平行實驗結果的標準偏差變大，重復性下降。綜合考慮干燥時間、靈敏度及重復性，選擇點樣體積為4 μL。

斑點在點樣10 min內由于溶劑的蒸發(fā)作用逐步干燥，可見光下其斑點面積無變化，干燥后立即在365 nm紫外燈下觀察并分析ΔR、ΔG、ΔB值。由圖6C可知，ΔR、ΔG、ΔB值在顯色時間15 min以內時出現(xiàn)波動，20 min達到穩(wěn)定。實驗也發(fā)現(xiàn)顯色時間90、120 min時ΔR、ΔG、ΔB值仍較穩(wěn)定，可以推斷該體系熒光能夠較長時間穩(wěn)定存在，長時間放置結果變化較小。選擇顯色時間為20 min。

2.5 標準曲線的繪制

在最佳的紙芯片制備條件和顯色條件下，滴加不同質量濃度蘆丁標準溶液進行拍照（圖7），并讀取顯色斑點的ΔR、ΔG、ΔB值，代入不同的數(shù)學模型中進行線性擬合，通過決定系數(shù)R2的判斷，本實驗建立的標準曲線方程為ΔG=-0.869C+27.274（R2=0.9944）。繼續(xù)呈梯度增加蘆丁標準溶液質量濃度，發(fā)現(xiàn)當蘆丁質量濃度為4～120 μg/mL時，熒光斑點的ΔG值與蘆丁質量濃度依舊呈線性關系。對空白溶液進行11 次重復實驗，按照檢出限=空白測定值標準差3 倍/標準曲線斜率，得到檢出限為2.8 μg/mL。

圖7 蘆丁標準溶液的熒光顯色圖片F(xiàn)ig.7 Fluorescent color photos of rutin standard solution

2.6 方法的選擇性

為評價方法的選擇性，在蘆丁質量濃度為20 μg/mL下，測定了常見離子、葡萄糖、蛋白質、氨基酸和酚酸類及槐米中存在的黃酮類化合物對蘆丁熒光顯色斑點的影響。以標準曲線縱坐標ΔG值的變化量為考察目標，結果如表1所示。

表1 共存物質的顯色斑點ΔG值Table 1 ΔG value of colored spots of coexisting substances

以ΔG值的變化量在5%以內為指標，可見常見離子（Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、F-、SO42-）、蛋白質（牛血清白蛋白）、氨基酸（酪氨酸、甘氨酸）、糖（蔗糖、葡萄糖）等大量存在時對測定無影響；與蘆丁能產生配位作用的金屬離子Zn2+、與蘆丁結構相似的酚酸類物質（綠原酸）在該測定體系中也能允許較大量存在；黃酮類物質（槲皮素、異鼠李素、山柰酚），其濃度為蘆丁濃度數(shù)倍以內時，對測定的影響可忽略，由于槐米蘆丁含量很高，槲皮素、異鼠李素、山柰酚等的含量遠低于蘆丁濃度[30]，上述共存物質的影響可忽略。因此該紙芯片測定體系有較強的選擇性，能適用于槐米等復雜體系中蘆丁含量的測定。

2.7 實際樣品測定

按1.3.6節(jié)，對3 批次的槐米樣品平行測定3 次，計算測定值的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果如表2所示，測出槐米中蘆丁的相對含量平均值為23.85%、22.83%、20.30%，RSD分別為6.1%、5.6%、6.7%，其測定結果與高效液相色譜法測定結果相近。對其中一批次樣品進行的加標回收分析如表3所示，可知碳點紙芯片法的樣品回收率在91.27%～107.5%之間，RSD為6.7%。

表2 碳點紙芯片法和高效液相色譜法測定槐米中蘆丁含量Table 2 Results of detection of rutin in flower buds of S.japonica by CD paper chip and HPLC

表3 碳點紙芯片法測定蘆丁的加標回收實驗結果Table 3 Spiked recoveries of CD paper chip

3 結論

制備了一種殼聚糖基碳點紙芯片并將其成功用于槐米中蘆丁含量的測定，蘆丁質量濃度在4～120 μg/mL時與其熒光顯色斑點的ΔG值呈良好的線性關系，R2=0.9944，測定結果與高效液相色譜法相近。由于碳點的熒光穩(wěn)定性，實驗發(fā)現(xiàn)制備好的碳點紙芯片在干燥條件下保存3 個月后仍可獲得良好的測定結果。紙芯片制備無繁瑣步驟，僅需將碳點與殼聚糖混合，于濾紙上鑄膜即可得到，紙芯片大小可根據(jù)待分析樣品個數(shù)自由裁剪，成本低廉，可快速批量制備；樣品液點樣后在紫外燈下即可檢測，可直接通過標準溶液和樣品溶液顯色斑點的顏色深淺進行半定量分析，也可以采用photoshop軟件或手機顏色識別器應用軟件讀取斑點顏色G值進行定量分析。該法簡便快捷，能滿足復雜體系中蘆丁含量的現(xiàn)場快速測定，后續(xù)可進一步開發(fā)對蘆丁有高選擇性、自然光下即可顯色的傳感器。