枯草芽孢桿菌發(fā)酵紫菜制備一種α-葡萄糖苷酶抑制劑

許育銜,程慧敏,韓貴新,毛相朝,姜宏*

1(中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266003)2(晶葉(青島)生物科技有限公司,山東 青島,266109)

糖尿病是一種由飲食及生活習(xí)慣所引起的以高血糖為特征的疾病,在過(guò)去十年間,我國(guó)的糖尿病人口快速上升,宋瑩倩等[1]在2021年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)成年樣本中具有高血糖癥狀的比例高達(dá)22.09%,若發(fā)展為糖尿病及其并發(fā)癥,將對(duì)我國(guó)公共健康帶來(lái)極為重大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。

目前治療糖尿病藥物如噻唑烷二酮類、二甲雙胍類等藥物等雖然能有效干預(yù)血糖水平,但是長(zhǎng)期服用容易增加肝腎負(fù)擔(dān),并且會(huì)提高病人患心血管疾病的幾率[2-3]。因此,亟需一種副作用低且能夠有效控制血糖水平的方法。KOJIMA等[4]研究表明,在餐前服用α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,GTase)等多糖降解酶的抑制劑是控制血糖水平的有效策略。這些抑制劑通過(guò)占據(jù)消化酶的催化位點(diǎn),延緩大分子碳水化合物的降解速率,以減少糖分?jǐn)z入,從而達(dá)到從源頭控制血糖水平的效果,與噻唑烷二酮等降糖藥物相比,這種代謝酶抑制劑的副作用相對(duì)較低[3]。

紫菜為紅藻門、原紅藻綱、紅毛菜目、紅毛菜科、紫菜屬(Porphyra)的海洋藻類,含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,如糖類、氨基酸、維生素及微量元素等,是一種高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食品原料[5]。許多研究表明,紫菜可作為多糖降解酶抑制劑的來(lái)源。ZENG等[6]通過(guò)化學(xué)法制備的紫菜多糖具有α-淀粉酶抑制活性;周鋒[7]以蛋白酶酶解法制備獲得了GTase抑制肽;董玉婷等[8]以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)發(fā)酵紫菜提高了上清液對(duì)GTase的抑制活性。但是,由于生產(chǎn)成本、產(chǎn)物得率等因素,紫菜相關(guān)產(chǎn)業(yè)的加工利用仍處于初級(jí)階段,產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)效益較低且高度仰賴國(guó)外市場(chǎng)。因此,紫菜的精深加工是市場(chǎng)亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)酵被廣泛用于多種功能食品的工業(yè)化生產(chǎn)中[9]。與酶解法相比,發(fā)酵的成本相對(duì)較低,其簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的特性適合用來(lái)生產(chǎn)大量具有一定功效的食品[10]。如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)被廣泛應(yīng)用于功能食品的工業(yè)化生產(chǎn),其發(fā)酵代謝物中含有多種對(duì)人體有益的活性成分[11-12]。但目前使用枯草芽孢桿菌發(fā)酵紫菜制備GTase抑制劑仍未見相關(guān)報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株,優(yōu)化條斑紫菜的發(fā)酵工藝,探究紫菜發(fā)酵產(chǎn)物的有效成分及對(duì)GTase的作用機(jī)制,以期為工業(yè)化生產(chǎn)具有GTase 抑制性的紫菜功能食品提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)使用菌株分離自威海市靖海灣的紫菜養(yǎng)殖網(wǎng),經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),由中國(guó)海洋大學(xué)海洋食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 材料與試劑

頭水紫菜(Porphyrayezoensis),威海市科藍(lán)海洋科技有限公司;GTase、葡聚糖凝膠G-15,北京索萊寶科技有限公司;對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,pNPG,BR,99%)、阿卡波糖(BR,95%),上海源葉生物科技有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。所有實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

5425R高速離心機(jī),德國(guó)艾本德股份公司;BCM-1000超凈臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;WD-9405B水平搖床,北京市六一儀器廠;PHS-3C精密酸度計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;HH-3A水浴鍋,常州智博瑞儀器制造有限公司;MULTISKAN FC酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技公司;HVE-50立式高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;全自動(dòng)紫外分析儀和自動(dòng)收樣器,上海滬西儀器廠;Smart1002-DI超純水機(jī),青島萊伯瑞科技有限公司;Kjeltec 2300凱氏定氮儀,福斯分析儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紫菜發(fā)酵液的制備流程

將條斑紫菜粉碎至178 μm(80目)以下粉末烘干備用。稱取適量紫菜粉末于錐形瓶中,按一定比例添加純水,115 ℃滅菌30 min,冷卻后將一定量的枯草芽孢桿菌懸浮液接種到發(fā)酵基底中,攪拌均勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵一定時(shí)間,經(jīng)離心取上清液即得。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

分別考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比(紫菜與發(fā)酵液質(zhì)量比)、接種量對(duì)GTase抑制率的影響,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下。

陰性對(duì)照:將種子液預(yù)先滅菌后進(jìn)行接種,于30 ℃靜置48 h。

發(fā)酵溫度:分別設(shè)定為20、30、40、50 ℃,固定料液比為200 g/kg,接種量為5%(體積分?jǐn)?shù)),發(fā)酵時(shí)間48 h。并在30 ℃組設(shè)置陰性對(duì)照,將種子液預(yù)先滅菌后進(jìn)行接種。

發(fā)酵時(shí)間:分別設(shè)定為24、48、72、96、120、144、168 h,固定料液比為200 g/kg,接種量為5%(體積分?jǐn)?shù)),發(fā)酵溫度為30 ℃。

料液比:分別設(shè)定為200、150、100、50 g/kg,固定發(fā)酵溫度為30 ℃,發(fā)酵時(shí)間為96 h,接種量為5%(體積分?jǐn)?shù))。

接種量:分別設(shè)定為0.1%(體積分?jǐn)?shù))、0.3%、0.5%、1%、3%、5%,固定料液比為150 g/kg,發(fā)酵時(shí)間為96 h,發(fā)酵溫度30 ℃。

1.3.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,確定發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和料液比3個(gè)因素的水平,設(shè)置三因素四水平正交試驗(yàn),以GTase抑制率為指標(biāo),獲得最佳發(fā)酵條件。實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

1.3.4 IC50值的測(cè)定

將發(fā)酵液干粉(PFPOB)以PBS(pH 7.2)稀釋至終質(zhì)量濃度分別為1、0.6、0.5、0.4、0.3、0.24、0.18、0.12、0.05 mg/mL。依據(jù)1.3.9方法對(duì)抑制率進(jìn)行測(cè)量。分別以PFPOB質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)和GTase抑制率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定IC50值。

1.3.5 PFPOB抑制動(dòng)力學(xué)分析

參考董玉婷等[8]的方法略作修改,配制10 mmol/LpNPG,并分別稀釋為2、4、6、8 mmol/L等不同底物濃度,加入孵育好的GTase(262.5 U/mL)與PFPOB(0.25 mg/mL),測(cè)定反應(yīng)初速度。Lineweaver-Burk做雙倒數(shù)曲線,對(duì)抑制類型進(jìn)行分析。

1.3.6 PFPOB成分的分離純化

參考白露[13]的方法稍作修改,將PFPOB使用超純水復(fù)溶,使用離心過(guò)濾裝置Amicon?Ultra-15獲得分子質(zhì)量<3 kDa的組分后迅速冷凍干燥,將凍干后樣品配制成質(zhì)量濃度為75 mg/mL的溶液[14],經(jīng)0.22 μm濾膜除去雜質(zhì)后備用。將溶脹好的Sephadex G-15介質(zhì)填充至750 mm×14 mm的層析柱,用去離子水進(jìn)行平衡。樣品進(jìn)樣量為3 mL,洗脫劑為超純水,洗脫流速0.45 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。

1.3.7 肽鑒定

1.3.7.1 樣品處理

取抑制峰樣品,冷凍干燥后進(jìn)行LC-MS/MS鑒定分析。

1.3.7.2 LC-MS/MS條件

參考ZHAO等[15]的方法稍作修改,使用納升流速Easy nLC 1200色譜系統(tǒng)(Thermo Scientific)從樣品中提取1～2 μg肽并分離。緩沖液:溶液A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液,溶液B為0.1%甲酸、乙腈和水溶液(其中80%為乙腈)的混合物。用100%溶液A平衡色譜柱。將樣品注入Trap Colum(100 μm×20 mm,5 μm,C18,Dr.Maisch GmbH),然后通過(guò)色譜柱(75 μm×150 mm,3 μm,C18,Dr.Maisch GmbH),流速為300 nl/min;梯度洗脫:0～2 min:2%～5% B相;2～44 min:5%～28% B相;44～51 min,28%～40% B相;51～53 min,40%～100% B相;53～60 min,100% B相。

質(zhì)譜條件:一級(jí),分辨率 60 000,自動(dòng)增益控制目標(biāo)值 3e6,最大離子傳輸時(shí)間 50 ms,掃描范圍350～1 800m/z;二級(jí),分辨率 15 000,自動(dòng)增益控制目標(biāo)值 1e5,最大離子傳輸時(shí)間 50 ms,最高信號(hào)離子數(shù)量 20,NCE/steppedNCE 28。

1.3.7.3 氨基酸序列分析

分析軟件為Max Quant 1.6.17.;蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)為uniprot-Neopyropia yezoensis (Susabi-nori) (Pyropiayezoensis) [2788]-764-20220530,網(wǎng)址https://www.uniprot.org/uniprot/?query=taxonomy:2788。

參數(shù)設(shè)定如下:酶:Unspecific;可變修飾:oxidation (M), Acetyl (Protein N-term);遺漏酶切位點(diǎn):0;一級(jí)質(zhì)譜誤差:20×10-6;二級(jí)質(zhì)譜誤差:20×10-6;顯著性閾值:0.01。

1.3.8 虛擬篩選與分子對(duì)接

參考ZHAO等[15]的方法進(jìn)行操作,首先使用Chemdraw 2019和Chem3D Pro 14.0繪制多肽三維結(jié)構(gòu),以PDBQT格式保存。GTase晶體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)(https://www.rcsb.org/structure/2QMJ)中獲得,用PyMOL去除2QMJ中的阿卡波糖配體,使用Autodock進(jìn)行脫水和氫化,計(jì)算gasteiger電荷并將所有原子分類為AD4類型,以PDBQT格式存儲(chǔ)以備將來(lái)使用。

對(duì)接過(guò)程使用PyRx軟件中的Vina分?jǐn)?shù),參考阿卡波糖在2QMJ中的位置設(shè)置對(duì)接盒,其他參數(shù)為默認(rèn)值,將活性肽與GTase進(jìn)行分子對(duì)接,并使用PyMOL軟件演示配體和受體之間的相互作用。

1.3.9 紫菜發(fā)酵液對(duì)GTase活性抑制率的測(cè)定

參考董玉婷等[8]的方法略作修改,采用pNPG法進(jìn)行測(cè)定。首先用超純水將待測(cè)定樣品稀釋10倍,8 000 r/min離心10 min后取40 μL上清液加入120 μL PBS(0.1 mol/L,pH 7.3)與40 μL GTase溶液(262.5 U/mL)混合均勻,于酶標(biāo)儀中40 ℃孵育10 min,隨后加入40 μLpNPG(10 mmol/L)溶液,40 ℃反應(yīng)15 min,立即加入40 μL Na2CO3(1 mol/L)溶液終止反應(yīng),于405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)溶液吸光度。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中:Ac,對(duì)照組吸光度;Ab,空白組吸光度;As,樣品組吸光度;An,樣品空白組吸光度。

1.3.10 水解度的測(cè)定

參考余筱潔等[16]的方法以甲醛滴定法進(jìn)行測(cè)定游離氨基態(tài)氮,以凱氏定氮法測(cè)定總氮含量。水解度按公式(2)計(jì)算:

DH/%=游離氨基態(tài)氮/樣品總氮含量×100

(2)

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS ver.28軟件進(jìn)行分析;采用Origin 18軟件作圖。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Duncan’s multiple range檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析,以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,不同字母表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種的選擇

從紫菜養(yǎng)殖網(wǎng)中初步篩選了5株枯草芽孢桿菌,分別命名為3、12、14、15和16號(hào)菌株,以GTase活性抑制率為主要指標(biāo),水解度為輔助指標(biāo),探究不同枯草芽孢桿菌菌株對(duì)紫菜的發(fā)酵情況。從圖1可以看出,紫菜在不同枯草芽孢桿菌作用下,出現(xiàn)了不同程度的水解現(xiàn)象,其中3號(hào)與15號(hào)菌株的水解作用最大。同時(shí),3號(hào)菌株產(chǎn)生了更高的GTase抑制率(13.64±4.32)%。因此選取3號(hào)枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種。

2.2 發(fā)酵工藝的單因素試驗(yàn)

由圖2-a可知,隨著溫度升高,抑制率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),表明合適的生長(zhǎng)溫度有助于促進(jìn)GTase抑制劑的生成[12]。當(dāng)發(fā)酵溫度30 ℃時(shí)GTase抑制率達(dá)到最高(12.01±0.80)%,但當(dāng)溫度繼續(xù)升高,雖然有助于酶解反應(yīng)促進(jìn)肽的生成,但不利于菌種生長(zhǎng)代謝,抑制率下降。因此30 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

a-發(fā)酵溫度;b-發(fā)酵時(shí)間;c-料液比;d-接種量圖2 不同發(fā)酵條件對(duì)GTase抑制率的影響Fig.2 Effect of different fermentation conditions on inhibition rate of GTase注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

如圖2-b所示,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),GTase抑制率逐漸增加,并在發(fā)酵72 h時(shí)大幅度上升,到96 h后趨于平穩(wěn),抑制率為(53.15±2.36)%。在發(fā)酵96～144 h期間,抑制率差異不顯著(P>0.05),這可能如同KIERS等[17]的研究中所述,在發(fā)酵72 h后,幾乎所有蛋白質(zhì)都已轉(zhuǎn)化為肽類,更長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間并不導(dǎo)致更多的抑制劑產(chǎn)生。因此從時(shí)間成本角度考慮,選取96 h為最佳的發(fā)酵時(shí)間。

由圖2-c可知,高料液比組的抑制率較高,隨著料液比的下降,抑制率也隨之下降,這是由于水分含量過(guò)多,營(yíng)養(yǎng)濃度下降的同時(shí)也影響了發(fā)酵氣體的交換,導(dǎo)致低料液比組的發(fā)酵速率較慢。由于200 g/kg組與150 g/kg組無(wú)顯著性差異(P>0.05),考慮到生產(chǎn)成本,最終選擇150 g/kg組為最佳料液比。

如圖2-d所示,隨著枯草芽孢桿菌接種量的升高,GTase抑制率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),在接種量為1%時(shí)發(fā)酵液的GTase抑制率最高(59.26±3.81)%,當(dāng)接種量繼續(xù)增大時(shí),抑制率反而降低,這可能是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌在接種量4%時(shí)生長(zhǎng)最佳[18],而發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限,過(guò)多生物量會(huì)導(dǎo)致紫菜蛋白快速消耗,無(wú)法生成足夠的功能肽,因此選擇1%為最佳接種量。

綜上所述,單因素優(yōu)化的結(jié)果得到最佳發(fā)酵條件為30 ℃、料液比150 g/L、1%接種量、發(fā)酵96 h,在此條件下制作的紫菜發(fā)酵液的GTase抑制率為(59.26±3.81)%。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

考慮到各個(gè)因素之間交互影響,為了進(jìn)一步確認(rèn)最佳發(fā)酵條件,固定接種量為1%,以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、料液比進(jìn)行三因素四水平的正交試驗(yàn),以提高發(fā)酵液的GTase抑制率,結(jié)果如表2所示。根據(jù)GTase抑制率均值判斷最優(yōu)化組合為A2B4C2,即發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間144 h、料液比150 g/kg。根據(jù)極差判斷影響GTase抑制率主次因素順序依次為A>C>B,即發(fā)酵溫度>料液比>發(fā)酵時(shí)間。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

方差分析結(jié)果如表3所示,發(fā)酵溫度對(duì)于GTase抑制率有顯著性影響(P<0.05),這與表2得到的結(jié)果相同,即發(fā)酵溫度是該工藝的關(guān)鍵控制點(diǎn)。最終確定枯草芽孢桿菌發(fā)酵紫菜產(chǎn)GTase抑制劑的條件為:150 g紫菜加入850 mL超純水,接種量為1%(體積分?jǐn)?shù)),在30 ℃發(fā)酵144 h,離心后上清液對(duì)GTase抑制率為(70.91±1.96)%,將本工藝生產(chǎn)的發(fā)酵液進(jìn)行噴霧干燥后命名為PFPOB并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Result of analysis of variance

2.4 PFPOB對(duì)GTase的抑制類型分析

過(guò)高的濃度會(huì)使抑制率達(dá)到飽和,使劑量-反應(yīng)曲線趨緩,不呈現(xiàn)線性關(guān)系,因此選擇合適的線性部份作為標(biāo)曲計(jì)算IC50值。如圖3-a所示,在質(zhì)量濃度0.3 mg/mL以下,PFPOB濃度與抑制率呈現(xiàn)顯著正相關(guān),IC50值約為0.21 mg/mL,其對(duì)GTase活性抑制優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖(IC50=0.88 mg/mL)。

a-劑量-反應(yīng)曲線;b-V-S圖;c-Lineweaver-Buck雙倒數(shù)圖圖3 PFPOB的IC50測(cè)定與抑制類型分析Fig.3 IC50 determination and inhibition type analysis of PFPOB

GTase的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)結(jié)果如圖3-b所示,加入PFPOB后Km增加,Vmax降低,根據(jù)圖3-c中直線的斜率與截距計(jì)算可知沒(méi)有PFPOB時(shí)Km為3.17 mmol/L,Vmax為0.335 μg/(mL·min),加入PFPOB后Km增加到了7.21 mmol/L,Vmax降至0.276 μg/(mL·min)。此外,如圖3-c所示,在加入PFPOB后,直線斜率增加且兩線交點(diǎn)靠近原點(diǎn)(-0.038,2.62),表明PFPOB主要是采用競(jìng)爭(zhēng)性抑制方式來(lái)抑制GTase活性[19]。因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)性抑制劑在開放系統(tǒng)中僅表現(xiàn)出短暫的影響,不影響人體正常機(jī)能[20],所以PFPOB是一種有一定潛力的降血糖食品原料。

2.5 PFPOB抑制成分分析

2.5.1 凝膠過(guò)濾層析分離

為了進(jìn)一步探究PFPOB的功能成分,將PFPOB使用Amicon?Ultra-15進(jìn)行超濾分級(jí),迅速冷凍干燥備用,其中<3 kDa的成分(3 mg/mL)對(duì)GTase的抑制率為(90.11±2.05)%,為主要抑制成分。使用Sephadex G-15分級(jí)為5個(gè)吸收峰(圖4-a),其中GTase抑制活性最佳的是P3,抑制率為(50.07±3.42)%(圖4-b)。

a-凝膠色譜圖;b-各個(gè)峰的GTase抑制活性圖4 Sephadex G-15凝膠層析結(jié)果Fig.4 Sephadex G-15 gel chromatography results

Sephadex G-15分級(jí)范圍于100～1 500 Da,適合分離小分子肽、寡糖等成分。將PFPOB組分使用葡聚糖凝膠進(jìn)行分離后,測(cè)量各層析管的GTase抑制率及肽含量的相關(guān)性,并使用SPSS進(jìn)行相關(guān)性分析,計(jì)算肽含量與GTase抑制率的皮爾森相關(guān)系數(shù)。經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)分離產(chǎn)物中肽含量與GTase抑制率呈顯著或極緊密正相關(guān)。表明PFBOB中肽對(duì)GTase抑制率的影響起至關(guān)重要作用。

2.5.2 具有GTase抑制活性的肽片段篩選

為了表征具有GTase抑制活性的肽,通過(guò)LC-MS/MS(圖5-a)鑒定了PFPOB中的肽序列(<1 kDa)。用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)與紫菜全蛋白進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì),共檢測(cè)到29條肽,將這些肽進(jìn)一步的軟件模擬,以篩選具有最高抑制活性的肽片段。

a-總離子譜圖;b-GPGDFL的MS/MS譜圖;c-SPPPPPA的MS/MS譜圖圖5 肽譜鑒定結(jié)果Fig.5 Peptide spectrum identification results

阿卡波糖與人源GTase(PDB:2QMJ)對(duì)接結(jié)果表明Asp203、Arg526、Thr205、Asp542、His600和Asp327活性位點(diǎn)中的氨基酸殘基在形成活性口袋和穩(wěn)定原始配體中起重要作用[21]。使用對(duì)接工具將篩選肽取代阿卡波糖進(jìn)行分子對(duì)接,將低于-8.0 kcal/mol的結(jié)合能設(shè)置為篩選條件。篩選得出2種有潛力的肽,其MS/MS譜圖如圖5-b和圖5-c所示。GPGDFL和SPPPPPA結(jié)合能皆為-8.2 kcal/mol,與GTase有一定結(jié)合力,具有抑制其活性的潛力。

2.5.3 GTase抑制肽的分子對(duì)接與抑制機(jī)理解析

從分子對(duì)接示意圖(圖6)中可以看到2條肽均可嵌入GTase活性口袋,阻止底物的進(jìn)入。GPGDFL與GTase對(duì)接結(jié)果如圖6-a所示,其Phe與Leu殘基與GTase活性口袋中的Asp542、Arg526、His600共形成5個(gè)傳統(tǒng)氫鍵相互作用,平均距離為2.34 ?。SPPPPPA對(duì)接結(jié)果如圖6-b所示,其Ser、Pro、Ala 殘基分別與GTase活性口袋中的Asp443、Ser448、Arg526、Trp539、Asp542、Asp571共形成8個(gè)傳統(tǒng)氫鍵相互作用,平均距離為2.58 ?。兩者氫鍵相互作用平均距離皆短于傳統(tǒng)的3.5 ?,有助于活性肽與GTase活性位點(diǎn)形成緊密且穩(wěn)定的結(jié)合[21],其中Trp539、Asp542、His600、Asp443和Arg526是反應(yīng)底物與GTase活性口袋結(jié)合的關(guān)鍵活性位點(diǎn)[22],通過(guò)與關(guān)鍵位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,可以阻止GTase對(duì)底物的作用。

a-GPGDFL;b-SPPPPPA圖6 肽與GTase的對(duì)接結(jié)果Fig.6 Docking results of peptides with GTase注:左至右分別為整體3D圖,對(duì)接位點(diǎn)3D圖(不同顏色表示不同氨基酸),與對(duì)接位點(diǎn)2D圖。

此外,一些文獻(xiàn)報(bào)道認(rèn)為,降血糖肽中的Pro和Leu這2種疏水性氨基酸是對(duì)GTase分別或協(xié)同具有抑制作用的重要氨基酸[23],這2種氨基酸在紫菜蛋白中含量豐富[7],本研究從肽譜鑒定得到的29條肽均存在這2種氨基酸,表明了紫菜是一種優(yōu)質(zhì)的降血糖肽來(lái)源。這與GPGDFL和SPPPPPA的對(duì)接結(jié)果相符,如圖6所示,SPPPPPA上的Pro環(huán)狀結(jié)構(gòu)與Trp406、Phe575形成π-烷基作用,而GPGDFL的Pro與Ala576,Leu與Tyr299、Ile328、Ile364與Trp406共形成7個(gè)π-烷基作用,同時(shí)Tyr299上的苯環(huán)與Phe殘基上的苯環(huán)會(huì)形成π-π堆積作用,這些疏水性胺基酸的疏水相互作用可能改變GTase活性口袋構(gòu)象[24],使活性位點(diǎn)與肽結(jié)合的更緊密,并阻止了底物的進(jìn)入。

分子對(duì)接結(jié)果表示GPGDFL與SPPPPPA能夠與GTase活性位點(diǎn)中的關(guān)鍵氨基酸殘基形成傳統(tǒng)氫鍵、疏水相互作用、范德華力和靜電相互作用力。其中分別是Leu、Phe與Pro、Ala殘基起到了重要的作用,并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)及改變酶的構(gòu)型來(lái)抑制GTase活性,與PFPOB對(duì)GTase活性抑制類型實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。此外,有大量鑒定肽段的N端第一個(gè)或第二個(gè)氨基酸為Pro或Ala,與報(bào)道的二肽激肽酶抑制肽一致[25],這些肽有可能對(duì)血糖的調(diào)控起到協(xié)同作用,這方面的研究將在進(jìn)一步的功效研究中闡明。

3 結(jié)論

本研究以紫菜為基質(zhì)使用枯草芽孢桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,制備了具有GTase抑制活性的紫菜發(fā)酵液。經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化后的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30 ℃、料液比150 g/kg、接種量1%(體積分?jǐn)?shù))、發(fā)酵時(shí)間144 h,制備的PFPOB的IC50為0.21 mg/mL,優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物阿卡波糖。PFPOB抑制方式為競(jìng)爭(zhēng)性抑制,其中的肽含量與GTase抑制率呈極顯著正相關(guān),將PFPOB進(jìn)行肽譜鑒定后得到了肽GPGDFL與SPPPPPA。與人來(lái)源的GTase的分子對(duì)接結(jié)果表明其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)GTase與底物的結(jié)合位點(diǎn)來(lái)抑制GTase活性,是一種有效的潛在降血糖成分。PFPOB具有生產(chǎn)成本低,設(shè)備要求低,不使用化學(xué)藥劑等優(yōu)勢(shì)?？傊狙芯繛樽喜嗽碐Tase抑制劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論指導(dǎo),并為紫菜的高值化開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。