中東亞不同地區(qū)酸馬奶中乳酸菌分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選

娜日蘇,如意,劉文俊,孟和畢力格

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特, 010018)

酸馬奶是一種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品,在吉爾吉斯斯坦、烏茲別克斯坦、哈薩克斯坦等中亞各國和東亞的蒙古國以及我國內(nèi)蒙古和新疆等地區(qū)備受游牧民族歡迎,其具有悠久的歷史,且在一些地區(qū)常常作為功能性發(fā)酵乳飲料用于輔助治療一些慢性疾病[1]。已有研究表明乳酸菌在發(fā)酵和益生功效方面發(fā)揮著非常重要的作用[2],因此分離鑒定酸馬奶的乳酸菌具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

近些年來,隨著酸馬奶來源益生菌研究的深入和酸馬奶在傳統(tǒng)飲食療法中的應(yīng)用,國內(nèi)外對酸馬奶中乳酸菌的研究正成為傳統(tǒng)乳制品研究的熱點(diǎn)。早在1997年,ISHII[3]使用純培養(yǎng)方法分離出蒙古國部分地區(qū)酸馬奶中優(yōu)勢菌為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。2004年,孟和畢力格等[4]分別從我國錫林浩特和蒙古國采集了21份酸馬奶樣品進(jìn)行分離鑒定,優(yōu)勢菌種分別為高溫性的瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)和中溫性的干酪乳桿菌(Lacticaseibacilluscasei)。莫藍(lán)馨[5]通過Pacbio SMRT平臺對內(nèi)蒙古錫林郭勒盟的酸馬奶中細(xì)菌菌種進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)其中優(yōu)勢菌種為副乳房鏈球菌(Streptococcusparauberis,62.82%)和L.helveticus,德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)、高加索酸奶乳桿菌(Lentilactobacilluskefiri)、馬乳酒樣乳桿菌(Lactobacilluskefiranofaciens)次之。ZHOU等[6]從新疆傳統(tǒng)酸馬奶中分離獲得6株乳酸菌,分別為腸球菌(Enterococcus)、溶膽鏈球菌(Streptococcusgallolyticus)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、杜蘭腸球菌(Enterococcusdurans)。RAKHMANOVA等[7]自哈薩克斯坦的酸馬奶中采集分離獲得了52株乳酸菌和20株酵母菌。篩選出KZLAB13和KZY10兩株優(yōu)良菌株菌可用于發(fā)酵牛奶。也有研究報(bào)道對內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸馬奶的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,結(jié)果表明,在11份酸馬奶樣品中共檢出6個(gè)細(xì)菌門126屬49種,乳桿菌屬為優(yōu)勢菌屬[8]。ISPIRLI等[9]從哈薩克斯坦和吉爾吉斯斯坦傳統(tǒng)酸馬奶樣品中分離出L.fermentum、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、屎腸球菌(Enterococcusfeces)和L.helveticus等。以上結(jié)果表明,不同的研究者所得結(jié)果存在一定的差異,不同國家或同一國家不同地區(qū)和時(shí)間的酸馬奶中乳酸菌的組成也存在異同。

本研究對國內(nèi)外不同地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定,并從中篩選具有潛在益生菌特性和良好發(fā)酵特性的乳酸菌,以期為酸馬奶等發(fā)酵乳制品的工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良的菌種。

1 材料與方法

1.1 樣品及其來源

本研究中用于乳酸菌分離鑒定的酸馬奶樣品共44份。其中,8份樣品采集自中亞的吉爾吉斯斯坦、烏茲別克斯坦的部分地區(qū);4份樣品采集于蒙古國烏蘭巴托郊區(qū);11份樣品為我國錫林郭勒盟巴音錫勒地區(qū);21份樣品采集自新疆昭蘇縣和尼勒克縣。以上樣品均為牧民家庭以傳統(tǒng)工藝自然發(fā)酵酸馬奶樣品,發(fā)酵溫度隨環(huán)境溫度而變化但均低于25 ℃室溫。

樣品采集時(shí),用無菌吸管吸取2～5 mL酸馬奶于加有保護(hù)劑(淀粉∶CaCO3=50∶1,質(zhì)量比)的無菌采樣管中,用冰袋降溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,立即進(jìn)行乳酸菌的分離和鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離與鑒定

采用10倍梯度稀釋法[10]對酸馬奶樣品進(jìn)行稀釋。待菌落形成后經(jīng)革蘭氏染色鏡檢呈陽性、H2O2陰性的分離株視為疑似乳酸菌,于MRS液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng),離心收集菌體分裝于2 mL凍存管中置-80 ℃冷藏備用[11]。乳酸菌基因組DNA的提取使用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。濃度和純度的檢測使用紫外分光光度計(jì),若OD260/OD280范圍保持在1.8～2.0即視為純DNA樣品。PCR擴(kuò)增參照史迪等[12]等的操作,將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物進(jìn)行16S rRNA基因測序,用于菌種鑒定。

1.2.2 乳酸菌在牛乳中的生長及其凝乳特性初步篩選

用MRS液體培養(yǎng)基活化乳酸菌分離株,待活菌數(shù)達(dá)到108CFU/mL以上后按體積分?jǐn)?shù)2%的量接種至10%脫脂乳中,置于37 ℃培養(yǎng)至凝乳,期間觀察并記錄凝乳時(shí)間,測定記錄其pH值和滴定酸度。

1.2.3 乳酸菌人工胃腸液耐受性及耐酸特性分析

將獲得的分離株接種于MRS液體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)20 h,進(jìn)行3次傳代后,離心收集菌體細(xì)胞加入40 mL PBS制備供試菌液。人工胃腸液的制備及其耐受性試驗(yàn)參照LIU等[13]所用方法進(jìn)行。

0 h原菌液活菌數(shù):將供試菌液10倍梯度稀釋,選取10-4、10-5、10-6梯度進(jìn)行計(jì)數(shù)即為0 h原菌液活菌數(shù)。將500 μL供試菌液與4.5 mL的人工胃液均勻混合后置于37 ℃、厭氧培養(yǎng)3 h,記錄其活菌數(shù)。再將500 μL已培養(yǎng)3 h的含菌人工胃液與4.5 mL人工腸液混合,37 ℃厭氧培養(yǎng),分別在4和8 h記錄活菌數(shù),隨后計(jì)算存活率[14-15]。

1.2.4 乳酸菌發(fā)酵溫度適應(yīng)性分析

將乳酸菌菌株培養(yǎng)至活菌數(shù)達(dá)108CFU/mL以上后以體積分?jǐn)?shù)2%的量接種至MRS液體培養(yǎng)基中,分別在4、15、20、25、28、30 ℃培養(yǎng)24 h,并測定OD600nm。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel、Origin、Mega 6.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸馬奶中乳酸菌的分離鑒定

2.1.1 乳酸菌的分離、DNA的提取及PCR擴(kuò)增結(jié)果

從44份酸馬奶樣品中共分離獲得264株革蘭氏陽性、H2O2陰性的疑似乳酸菌菌株,其基因組DNA提取后質(zhì)量濃度均在100～300 ng/μL,DNA純度值在1.8～2.0;瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明,在bp 1 500處可見清晰、完整性好的條帶且無拖尾現(xiàn)象,說明264株乳酸菌分離株成功獲得16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物,滿足基因測序的要求。

2.1.2 乳酸菌16S rRNA序列同源性比較及其鑒定結(jié)果

分離獲得的264株乳酸菌經(jīng)16S rRNA序列分析比對后歸屬于5個(gè)屬16個(gè)種,其每個(gè)乳酸菌種及其數(shù)量如表1所示。

表1 不同地區(qū)乳酸菌分離鑒定結(jié)果Table 1 Results of isolation and identification of LABs from different regions

其中,分離得到最多的為L.helveticus,占總分離株的43%,L.kefiranofaciens次之,占總分離株的20%,其余菌種占37%。而L.helveticus同時(shí)也是蒙古國和新疆的優(yōu)勢菌種,分別占樣品分離菌株數(shù)量的87%和59%。L.kefiranofaciens是中亞和錫林郭勒的優(yōu)勢菌種,分別占樣品分離菌株數(shù)量的39%和63%。

經(jīng)拼接和整理測序得到16S rRNA基因序列并進(jìn)行同源性比對[16],在每個(gè)菌種中選取1～2株與模式株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖1所示。菌株SL2-5與模式株LactobacillusparacaseiATCC 25302(TD79212)聚為一類,相似性為99%,故鑒定為L.paracasei。菌株Q15-6、Q11-6與模式株LactobacilluscaseiATCC 393(NR 041893.1)聚為一類,相似性為99%,故鑒定為L.casei。菌株KG17-9與模式株LactobacillusdiolivoransJKD6(NR 037004.1)聚為一類,相似性為100%,故鑒定為L.diolivorans。菌株KG18-6與模式株LactobacillusharbinensisNBRC100982(AB681318)聚為一類,相似性為100%,故鑒定為L.harbinensis。菌株Z5-8與模式株P(guān)ediococcusacidilacticiNGRI 0510Q(NR 041640.1)聚為一類,相似性為100%,故鑒定為P.acidilactici。菌株Z5-3與模式株L.plantarumDK022(AJ640078)聚為一類,相似性為100%,故鑒定為L.plantarum。菌株Q24-5與模式株LactobacilluspontisLTH 2587(NR 036788.2)聚為一類,相似性為99%,故鑒定為L.pontis。菌株C7-1與模式株L.fermentumCIP 102980(NR 104927.1)聚為一類,相似性為100%,故鑒定為L.fermentum。菌株MGR1-9、14-7與模式株LeuconostocpseudomesenteroidesNRIC 1777(NR 040814.1) 聚為一類,相似性為99%,故鑒定為L.pseudomesenteroides。菌株MGR10-6-2與模式株LeuconostocmesenteroidesATCC 8393T(CP000414)聚為一類,相似性為100%,故鑒定為L.mesenteroides。菌株Q1-1與模式株StreptococcusthermophilusDSMZ 20617(X68418)聚為一類,相似性為100%,故鑒定為S.thermophilus。Z7-1與模式株LactococcuslactisATCC 19435T(AB100803)聚為一類,相似性為100%,故鑒定為L.lactis。菌株Q11-4與模式株LactococcusgarvieaeBSN(KM261818)聚為一類,相似性為100%,故鑒定為L.garvieae;菌株UZ22-4與模式株L.delbrueckiiYIT 11221(AB641833)聚為一類,相似性為99%,故鑒定為L.delbrueckii;菌株MGR1-44、SL2-6、Z3-1與模式株L.kefiranofaciensATCC 43761(AJ575259)聚為一類,相似性為100%,故鑒定為L.kefiranofaciens;菌株MGR9-6、UZ29-9、Q6-2與模式株L.helveticusATCC 15009(FR683085)聚為一類,且同源性為100%,故鑒定為L.helveticus。

圖1 部分乳酸菌分離株16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic relationship of 16S rRNA gene sequence of some LABs

2.2 酸馬奶源乳酸菌在脫脂乳中的生長及凝乳特性

為了解分離乳酸菌菌株在乳基料中的生長發(fā)酵性能,將分離獲得的264株菌接種于10%的脫脂乳培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)觀察其12～24 h期間的凝乳狀態(tài)。結(jié)果如圖2所示,所測試的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)(12、15、18、21、24 h)共有148株菌凝乳,剩余116株乳酸菌生長緩慢,在24 h時(shí)仍未能使脫脂乳凝乳。

圖2 不同時(shí)間凝乳的乳酸菌數(shù)量Fig.2 Number of LABs of curd at different time

將凝乳情況良好的148株乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵,測定pH和滴定酸度,結(jié)果如圖3所示。148株乳酸菌發(fā)酵終點(diǎn)pH在3.74～6.47,滴定酸度在22.05～153.45,其中44%的菌株pH集中在5.01～5.50、滴定酸度集中在35～65。有9株菌的pH<4.0、滴定酸度>120。通過測定發(fā)現(xiàn)菌株Q16-3、Q16-4、Q18-3、Q18-5、Q20-6、Q27-5、Q27-6、C7-4、C7-6產(chǎn)酸能力較強(qiáng),菌株MGR1-9產(chǎn)酸能力最弱,因此,將產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的9株乳酸菌進(jìn)行后續(xù)研究。

如圖4所示,4個(gè)地區(qū)所分離獲得的乳酸菌持有不同范圍的pH和滴定酸度。新疆分離獲得的乳酸菌pH值和滴定酸度分別主要集中在4.30～5.30、45～90,錫林郭勒分離獲得的乳酸菌pH和滴定酸度分別主要集中在4.47～5.88、30～70,蒙古國分離獲得的乳酸菌pH值和滴定酸度分別主要集中在5.11～5.40、50.96～54.00,中亞分離獲得的乳酸菌pH值和滴定酸度分別主要集中在4.90～5.85、39～75,其中新疆地區(qū)乳酸菌的pH值相比于蒙古國和中亞差異顯著(P<0.05),滴定酸度在新疆和中亞之間差異顯著(P<0.05),表明在不同地點(diǎn)和不同時(shí)期采集的樣品中乳酸菌特性有一定的差異。

2.3 酸馬奶源乳酸菌的耐酸性分析結(jié)果

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌的另一個(gè)重要特征是其在胃腸道通道中的生存能力,通過產(chǎn)酸性能分析結(jié)果,篩選出9株產(chǎn)酸性能良好的菌株,進(jìn)行人工胃腸液耐受性試驗(yàn),人工胃液耐受性分析結(jié)果可知(表2),菌株C7-4、C7-6在人工胃液(pH 2.5)培養(yǎng)3 h后存活率低于10%,菌株Q16-3、Q16-4、Q20-6、Q27-5存活率在10%～40%,耐受能力較弱。而菌株Q18-3、Q18-5、Q27-6存活率分別為89.26%、86.94%、71.43%,在人工胃液中表現(xiàn)出較高的存活能力,耐受能力較強(qiáng)。

表2 篩選菌株對人工胃液耐受力Table 2 Tolerance to artificial gastric juice of selected strains

在人工腸液中活菌數(shù)變化如表3所示,菌株Q18-3、Q18-5和Q27-6在人工腸液消化8 h后的存活率分別為52.18%、32.02%和8.15%。還有其他6株菌Q16-3、Q16-4、Q20-6、Q27-5、C7-4和C7-6在人工腸液的存活率低于1%,基本上不耐受人工腸液。益生菌在胃腸道通道中的存活率會受胃液的pH值、在胃液中停留的時(shí)間以及菌株本身的一些優(yōu)異特性。

表3 篩選菌株對人工腸液耐受力Table 3 Tolerance to artificial intestinal juice of selected strains

綜上分析,通過產(chǎn)酸能力獲得的9株乳酸菌中有2株(22.2%)對人工胃腸液均不耐受,占總分離株的0.8%,不適合于進(jìn)行下一步分析。9株乳酸菌在人工胃腸液條件下有不同程度的存活率,其中有3株(33.3%)L.plantarumQ18-3、L.paracaseiQ18-5、L.helveticusQ27-6在人工胃腸液中表現(xiàn)出較強(qiáng)的存活能力,占總分離株的1.1%,適合于進(jìn)行下一步的發(fā)酵溫度適應(yīng)性分析。

2.4 乳酸菌發(fā)酵溫度適應(yīng)性分析結(jié)果

由于傳統(tǒng)酸馬奶通常在較低溫度條件下進(jìn)行自然發(fā)酵,因此發(fā)酵溫度對乳酸菌的增殖有一定的影響力。經(jīng)過人工胃腸液耐受性分析,獲得的3株乳酸菌在不同溫度下生長情況見圖5,4 ℃條件下基本上不生長,而在15、20、25、28、30 ℃的條件下生長良好。Q18-5在30 ℃發(fā)酵的菌體密度相比其他溫度差異顯著。3株乳酸菌30 ℃下的菌體密度均高于其他溫度,表明30 ℃條件下生長速度快,促進(jìn)菌株生長。說明30 ℃適合低溫發(fā)酵,而4 ℃保藏時(shí)抑制3株乳酸菌的生長。

圖5 不同溫度對乳酸菌菌體密度的影響Fig.5 Effect of different temperatures on the density of LABs注:“*”表示與4 ℃相比,P<0.05,“#”表示與15 ℃相比,P<0.05,“△”表示與20 ℃相比,P<0.05,“◇”表示與25 ℃相比,P<0.05,“☆”表示與28 ℃相比,P<0.05。

3 討論與結(jié)論

從中亞的吉爾吉斯斯坦和烏茲別克斯坦的部分地區(qū)以及蒙古國和我國新疆、錫林郭勒盟采集的酸馬奶樣品中共分離和鑒定出264株乳酸菌菌株,其中L.helveticus占分離率較高,其次為L.kefiranofaciens。乳桿菌屬的菌株是通常自然發(fā)酵酸馬奶中的優(yōu)勢菌株,這與酸馬奶在發(fā)酵后酸度和貯藏時(shí)間有著一定的關(guān)系[17]。布仁其其格等[18]使用454焦磷酸測序方法對不同發(fā)酵時(shí)期的酸馬奶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵時(shí)段以乳桿菌屬為優(yōu)勢細(xì)菌屬,乳球菌屬次之。酸馬奶隨著發(fā)酵的延續(xù)酸度逐漸增加,耐酸性的乳桿菌屬菌株占據(jù)優(yōu)勢,但是有時(shí)隨地點(diǎn)和采集樣品時(shí)間的原因樣品中優(yōu)勢菌種也會有所變化,例如戊糖乳桿菌呈優(yōu)勢菌種[19]。我們首次從中亞地區(qū)采集酸馬奶樣品與我國和蒙古國樣品一起分析,中亞和蒙古的樣品中沒有分離到L.plantarum,而L.casei只出現(xiàn)我國新疆和中亞的酸馬奶樣品中。這與SUN等[20]報(bào)道的酸馬奶中乳酸菌分離鑒定結(jié)果有相似之處。凌空等[21]對新疆酸馬奶樣品分析認(rèn)為L.helveticus是其優(yōu)勢菌種。

乳酸菌能否在乳基質(zhì)中良好的生長,取決于其在乳中的產(chǎn)酸能力和凝乳特性。具有良好產(chǎn)酸能力和凝乳特性的乳酸菌比較適合于發(fā)酵乳的生產(chǎn)。本研究通過脫脂乳中的產(chǎn)酸發(fā)酵試驗(yàn)、脫脂乳中pH和滴定酸度測定以及體外人工胃腸液耐受性和生長溫度測定試驗(yàn)篩選出3株乳酸菌,即L.plantarumQ18-3、L.paracaseiQ18-5和L.helveticusQ27-6等,它們在pH 2.5人工胃液中的存活率分別為89.26%、86.94%和71.43%,在pH 8.0的人工腸液中活菌數(shù)達(dá)到108CFU/mL以上,具有足夠的耐酸、耐膽鹽性,具備益生菌特性,但其益生特性還需要進(jìn)一步的比較分析并評定適合應(yīng)用于哪些發(fā)酵乳制品。目前,類似的益生菌篩選研究比較多[22],有些菌株被研究的比較深入和已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用[23]。酸馬奶是一種特種發(fā)酵乳制品,雖然具有明顯的區(qū)域性特點(diǎn),但消費(fèi)群體也比較多,為滿足大眾化消費(fèi)需求,產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和發(fā)酵品質(zhì)日益提高,從酸馬奶中分離并篩選具有一定益生特性和良好發(fā)酵性能的乳酸菌菌株作為發(fā)酵劑應(yīng)用于酸馬奶的集中工業(yè)化生產(chǎn)意義重大。

本研究從中亞的吉爾吉斯斯坦和烏茲別克斯坦、蒙古國,以及我國錫林郭勒盟的西烏旗和巴音郭勒牧場、新疆的尼勒克縣和昭蘇縣等不同地點(diǎn)、不同時(shí)間采集的酸馬奶樣品中共分離獲得264株乳酸菌,而且多數(shù)酸馬奶源乳酸菌可以在牛乳基料中發(fā)酵,且有一定的益生性能,在15～30 ℃下生長良好,可應(yīng)用于酸馬奶等地方特色的發(fā)酵乳制品。