基于UPLC法的甘參復(fù)方指紋圖譜研究

洪 博, 李美謙, 劉 軍, 郭麗娜, 王艷萍,李文靜*

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,哈爾濱 150000;2. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,齊齊哈爾 161006

肝纖維化是由多種原因引起的慢性肝損傷所致的病理改變,在中醫(yī)學(xué)中屬“臌脹”“脅痛”“積聚”“黃疸”等病證范疇,是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段,也是導(dǎo)致肝癌的重要原因[1-2]。肝纖維化無法自行痊愈,肝纖維化患者預(yù)后的差別很大,主要取決于發(fā)病初期是否得到有效控制。若經(jīng)過規(guī)范治療,如脂肪肝逆轉(zhuǎn)、病毒被根除和停用肝毒性藥物等,病因被去除,肝纖維化病情可長(zhǎng)期保持穩(wěn)定,甚至逆轉(zhuǎn)[3-4]。若患者慢性肝損傷持續(xù)存在,病情逐漸進(jìn)展,數(shù)年至數(shù)十年后可進(jìn)展為肝硬化,最終導(dǎo)致死亡。目前對(duì)肝纖維化的診治雖然取得了一些進(jìn)展,但是抗肝纖維化的藥物仍處于缺乏狀態(tài)。因此,找到能逆轉(zhuǎn)肝纖維化且毒性和不良反應(yīng)小的藥物是目前科研工作者的重要研究方向,中醫(yī)藥在逆轉(zhuǎn)肝纖維化及抑制肝纖維化進(jìn)展方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)[5-8]。甘參復(fù)方(GSC)[9-10]是由甘草和丹參配伍組成的方劑,以丹酚酸與甘草酸為主要藥效指標(biāo)[10],該方具有多成分、多靶點(diǎn)和多通路的特征,臨床應(yīng)用較為廣泛,目前研究已證實(shí)GSC可用于治療肝纖維化,且治療效果明顯,能很好地將中藥復(fù)方傳統(tǒng)藥理學(xué)與現(xiàn)代藥理學(xué)相結(jié)合[11]。近年來,對(duì)于GSC的質(zhì)量控制研究主要集中于對(duì)各個(gè)藥材活性成分的檢測(cè),較多集中在對(duì)其藥理作用機(jī)制、提取工藝的研究和含量測(cè)定等方面[12],尚未見有關(guān)建立GSC指紋圖譜的研究報(bào)道。由于中藥復(fù)方的化學(xué)成分復(fù)雜,且復(fù)方質(zhì)量與各味藥材的產(chǎn)地、批次等因素有關(guān),故需要建立能反映GSC化學(xué)成分整體性、系統(tǒng)性的質(zhì)量控制方法。因此,本文用超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography,UPLC),建立12批GSC的指紋圖譜以評(píng)價(jià)其整體質(zhì)量,為GSC的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SHIMADZU LC-30AD型超高效液相色譜儀(日本島津公司);METTLER TOLEDO精密天平(0.01 mg,瑞士蘇黎世的梅特勒-托利多集團(tuán));KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);TGL-18C-C型臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);SCT型數(shù)顯攪拌電熱套(菏澤市精科儀器有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品:丹參素(批號(hào)180328,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、芍藥內(nèi)酯苷(批號(hào)160516,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、芍藥苷(批號(hào)160524,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、芹糖甘草苷(批號(hào)160916,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、甘草苷(批號(hào)161201,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、迷迭香酸(批號(hào)181018,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、丹酚酸B(批號(hào)181008,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、苯甲酰芍藥苷(批號(hào)160517,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、甘草酸(批號(hào)160602,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、二氫丹參酮Ⅰ(批號(hào)181019,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%),均購(gòu)自北京萊耀生物科技有限公司;隱丹參酮(批號(hào)110852-201807,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、丹參酮Ⅰ(批號(hào)110867-201607,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、丹參酮ⅡA(批號(hào)110766-201721,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈(色譜純,瑞典Oceanpak公司);磷酸(色譜純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);乙醇(分析純,天津富宇精細(xì)化工有限公司);純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

藥材均購(gòu)自其道地產(chǎn)地或主產(chǎn)區(qū)(甘草產(chǎn)自新疆,丹參產(chǎn)自四川),經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院郭麗娜教授鑒定,丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge. 的干燥根和根莖,甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根和根莖。12批GSC分別為S1(20210901)、S2(20210902)、S3(20210903)、S4(20210904)、S5(20210905)、S6(20210906)、S7(20210907)、S8(20210908)、S9(20210909)、S10(20210910)、S11(20210911)、S12(20210912)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters T3-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5 mL·L- 1磷酸水(B)溶液,梯度洗脫:0～10 min,10%～20%A;10～20 min,20%～24%A;20～35 min,24%～48%A;35～45 min,48%～80%A;45～50 min,80%～90%A;50～60 min,90%～10%A。柱溫為40 ℃;流速為0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量為5 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取粉碎后的甘草和丹參各5.0 g,置于250 mL 燒瓶中,用10倍量的體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇提取2次,在60 ℃每次提取1.5 h,搖勻,濾過,合并2次濾液置于另一個(gè)250 mL 燒瓶中,減壓濃縮,將濃縮液置于100 mL量瓶中,定容,過0.22 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1精密度實(shí)驗(yàn) 取同一批次GSC供試品溶液(S1),按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,計(jì)算得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均<0.7%,相對(duì)峰面積的RSD值均<0.5%,表明儀器的精密度良好。

2.3.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取GSC供試品溶液(S1)6份,按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值分別為0.06%～0.96%、0.39%～1.88%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取GSC供試品溶液(S1),分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均<0.04%,相對(duì)峰面積的RSD值均<0.72%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取12批GSC樣品,按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)”,用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜,經(jīng)多點(diǎn)校正后進(jìn)行色譜峰匹配,生成疊加圖譜,結(jié)果見圖1。共標(biāo)定32個(gè)共有峰,其中23號(hào)峰(甘草酸)峰形對(duì)稱、分離度好、峰面積大,因此選其作為參照峰(S峰),計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積,結(jié)果見表1、表2。計(jì)算12批GSC樣品圖譜相似度。計(jì)算得12批樣品對(duì)照?qǐng)D譜相似度均在0.98以上,結(jié)果見表3,表明所建立的GSC指紋圖譜穩(wěn)定,不同批次藥材的主要化學(xué)成分基本一致,可以反映其指紋特征、綜合評(píng)價(jià)GSC的整體質(zhì)量。

注:1.丹參素;2.芍藥內(nèi)酯苷;3.芍藥苷;6.芹糖甘草苷;11.甘草苷;13.迷迭香酸;14.丹酚酸B;19.苯甲酰芍藥苷;23.甘草酸;24.二氫丹參酮Ⅰ;26.隱丹參酮;30.丹參酮Ⅰ;32.丹參酮ⅡA;R為對(duì)照指紋圖譜;其他數(shù)字表示的色譜峰未鑒定出。

表1 共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表2 共有峰的相對(duì)峰面積

表3 相似度評(píng)價(jià)的結(jié)果

2.5 聚類分析

將12批GSC樣品中32個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS 24.0軟件,用離差平均和法,測(cè)量區(qū)間為平方歐氏距離,以12批樣品的共有峰的相對(duì)峰面積為變量進(jìn)行聚類分析,聚類結(jié)果見圖2。當(dāng)平方歐氏距離為15時(shí),可將12批標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品分為3類,其中S9為一類,S8、S10聚為一類,S1～S7、S11、S12聚為一類,結(jié)果表明不同批號(hào)的GSC質(zhì)量存在一定的差異。

圖2 12批甘參復(fù)方樣品的聚類分析

2.6 主成分分析(PCA)

用SPSS 24.0軟件,以32個(gè)共有峰的峰面積作為變量,將12批樣品進(jìn)行主成分分析(principle component analysis,PCA)。通過降維因子分析,計(jì)算特征值、累積方差貢獻(xiàn)率,結(jié)果見表4。不同產(chǎn)地的樣品中前6個(gè)成分的累積方差貢獻(xiàn)率為92.955%,可基本反映樣品的主要信息。用SIMCA-P 14.1軟件繪制12批不同產(chǎn)地甘參復(fù)方樣品的主成分得分圖,見圖3。由圖3可知,12批不同產(chǎn)地GSC樣品明顯分布于3個(gè)區(qū)域,均可將樣品分為3類,與聚類分析結(jié)果一致。

圖3 GSC樣品的主成分分析

表4 不同產(chǎn)地GSC樣品的主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

2.7 偏最小二乘法判別分析

在主成分分析的基礎(chǔ)上,為了更深入地探究不同產(chǎn)地間GSC樣品的差異,本研究進(jìn)一步用偏最小二乘法對(duì)12批樣品進(jìn)行比較。結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示R2X和R2Y分別為0.782、0.975,預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.777,表明建立的模型預(yù)測(cè)能力較好,且3類間離散趨勢(shì)較為明顯,與上述的聚類分析和主成分分析結(jié)果一致,表明不同產(chǎn)地的樣品質(zhì)量存在差異。

圖4 偏最小二乘法判別分析圖

3 討論

中成藥的質(zhì)量不穩(wěn)定是中藥現(xiàn)代化研究中必須要解決的重大問題之一,由于海拔、氣候、光照、降雨量及土壤等自然環(huán)境的影響,使同一種中藥材中的有效成分差別很大。藥材的質(zhì)量直接關(guān)系到中藥方劑的質(zhì)量和療效,《神農(nóng)本草經(jīng)》在序錄中記載:“土地所出,真?zhèn)涡玛?并各有法”;陶弘景在《本草經(jīng)集注》中指出:“諸藥所生,皆有境界”,并列出40多種中藥材生于何地、何種土壤者良,現(xiàn)代研究將指紋圖譜引入中藥及其方劑的質(zhì)量研究中。

本實(shí)驗(yàn)用指紋圖譜研究由新疆的甘草和四川的丹參組成的GSC,建立了GSC的指紋圖譜分析方法,可為GSC制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。指紋圖譜結(jié)果表明,12批樣品的指紋圖譜相似度均在0.98以上,相似度較高,且儀器的精密度、方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好,表明所建立的GSC指紋圖譜分析方法穩(wěn)定、可靠。12批樣品中各成分色譜峰的峰面積略有差別,表明不同批次的GSC中主要成分含量有一定差異,因此,非常有必要制定更加嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方劑的質(zhì)量控制。本文后期的研究方向是建立GSC的含量測(cè)定方法,對(duì)不同批號(hào)的GSC中的主要活性成分的含量進(jìn)行研究,進(jìn)一步完善GSC的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

由于本實(shí)驗(yàn)研究成分較多,各成分在不同條件下各有優(yōu)劣,綜合各方面因素考慮進(jìn)行分析條件的確定。本實(shí)驗(yàn)首先考察了不同體積分?jǐn)?shù)(30%、50%、75%、100%)的乙醇對(duì)GSC有效成分提取的影響,結(jié)果表明,用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇提取效果較好。指紋圖譜測(cè)定色譜條件分別考察了乙腈-水、甲醇-水系統(tǒng),并加入磷酸或甲酸進(jìn)行調(diào)節(jié),最終確定用乙腈-5 mL·L- 1磷酸水系統(tǒng)進(jìn)行分離,所得各成分色譜圖峰形較好、基線穩(wěn)定。