ELISA實驗中微量加樣量對檢測丙肝抗體的影響評價

陳文花（南昌市西湖區(qū)疾病預(yù)防控制中心,江西 南昌 330000）

丙肝是常見病毒性肝炎的一種，主要經(jīng)過輸血、針刺等渠道傳播，呈現(xiàn)出全球性流行趨勢，隨著病情進展可能發(fā)展為肝細(xì)胞癌、肝硬化等，對人們的健康和安全造成嚴(yán)重威脅。丙肝抗體檢測是目前診斷早期丙型肝炎病毒感染的主要手段，對于及早干預(yù)治療丙型肝炎有重要意義。目前臨床上主要選擇ELISA方法進行測定，而很多醫(yī)療機構(gòu)在實驗中仍然使用手工加樣方法處理。手工加樣會影響加樣量的標(biāo)準(zhǔn)性，加樣量不規(guī)范可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生不良影響，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[1]。因此需要重視加樣量對檢測結(jié)果的影響，從而加強對加樣量的控制和校正，積極防范人為因素對檢測結(jié)果的影響。本文于本中心2021年3月-2022年10月的血液樣本中隨機抽取5份展開研究，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2021年3月-2022年10月檢測的不同濃度的血清樣本中隨機抽取5份作為樣本，均使用北京萬泰HCV-AB檢測試劑盒。使用MK3酶標(biāo)儀、finnpipette加樣槍、水浴箱實驗。

1.2 方法 在反應(yīng)板上排板5×6共30孔，按照S/CO濃度從低向高進行編號，并添加100μL丙肝抗體稀釋液。1排為1號標(biāo)本，5孔分別取樣6μL、8μL、10μL、12μL、14μL。2排為2號標(biāo)本，5孔分別取樣6μL、8μL、10μL、12μL、14μL。3排為3號標(biāo)本，5孔分別取樣6μL、8μL、10μL、12μL、14μL。4排為4號標(biāo)本，5孔分別取樣6μL、8μL、10μL、12μL、14μL。5排為5號標(biāo)本，5孔分別取樣6μL、8μL、10μL、12μL、14μL。6排為對照組，5孔分別為空白對照、陰性、陽性、陽性、陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件處理本文數(shù)據(jù)，對符合正態(tài)分布的計量資料（±s）進行t檢驗，對計數(shù)資料（%）進行χ2檢驗，P＜0.05表示存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組S/CO值結(jié)果：1號和5號樣本隨著加樣量增加，S/CO值結(jié)果變化不大，即隨著加樣量增加，S/CO值變化不存在線性關(guān)系。2號、3號和4號樣本隨著加樣量增加，S/CO值也呈現(xiàn)明顯升高趨勢，即隨著樣本加樣量增加，S/CO值存在一定正相關(guān)關(guān)系。在3號樣本中，加樣量不足（≤8μL）時，S/CO值＜1，為陰性。當(dāng)S/CO值在加樣量＜6μL和＞14μL時，加樣量變化對于S/CO結(jié)果無明顯影響。詳見表1。

表1 各組S/CO值結(jié)果

3 討論

丙肝是由于丙型肝炎病毒（HCV）引起的病毒性感染，根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全球發(fā)病率約為3%，每年新發(fā)患者達到3.5萬例之多，是威脅人們健康的全球性流行疾病[2]。HCV感染后，通過免疫介導(dǎo)或者直接損傷，隨著病程延長，患者可出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死以及淋巴細(xì)胞浸潤表現(xiàn)，形成纖維組織增生?；颊呋疾『箅S著病程發(fā)展，可能會出現(xiàn)肝纖維化以及慢性炎癥，部分患者可能發(fā)展為肝細(xì)胞癌以及肝硬化。近年來，丙肝患者死亡率持續(xù)升高，已經(jīng)成為了威脅人們健康的公共衛(wèi)生問題，受到全社會的關(guān)注。目前主要通過丙肝病毒抗體進行檢查。及早篩查則能早期展開干預(yù)治療，對于改善預(yù)后、規(guī)避不良結(jié)局有著重要意義。

HCV作為有包膜結(jié)構(gòu)的病毒，其基因組由線性單股正鏈RNA構(gòu)成，由于HCV復(fù)制主要受到RNA聚合酶所影響，但RNA聚合酶由于缺乏校正活性，極容易出現(xiàn)突變，形成免疫逃逸，基因組各個變異程度不同。感染HCV病毒后，人體免疫應(yīng)答并不會立刻發(fā)生反應(yīng)，因此急性感染癥狀輕微。一般在感染1周后會出現(xiàn)較高病毒滴度，但之后便會出現(xiàn)減緩，滴度峰值低于乙肝病毒感染[3]。在感染8-12周后，患者一般可以檢測出HCV特異性抗體，病毒滴度降低。大部分患者感染后可能發(fā)展為慢性丙肝，病毒滴度相對穩(wěn)定，只有少部分患者感染后可以恢復(fù)健康，在檢測中無法檢測出HCV RNA。即使已經(jīng)經(jīng)過治療的HCV患者，其丙肝特異性抗體仍然無法消失，可能持續(xù)至10年以后。在臨床檢測中主要使用ELISA方法進行監(jiān)測，其具有較高的敏感性，操作快速、簡便，是免疫學(xué)檢查中最常見的方法，目前乙肝五項、丙肝以及HIV等病毒抗體檢測均通過ELISA方法進行實驗。

ELISA檢測方法能夠利用包被抗原以及夾心抗原的方式進行檢測，有效提高了檢測特異性。該方法可以對IgG抗體進行檢測，同時還可以檢測IgM抗體，能夠有效減少感染窗口期的影響，從而提高檢測靈敏程度。首先，固相載體吸附抗原可以結(jié)合特異性抗體，在固相載體上發(fā)生抗體反應(yīng)，可以檢出特異性抗體。酶標(biāo)抗原主要經(jīng)過免疫反應(yīng)以及化學(xué)反應(yīng)讓抗原和酶形成結(jié)合物。改良過碘酸鈉法可以標(biāo)記HRP（過氧化物酶），作為一種糖蛋白，過碘酸鈉將無關(guān)多糖羥基進行氧化反應(yīng)，形成醛基，醛基活性高，結(jié)合抗原游離氨基，可以得到HRP-CH2-NH-IgG[4]?？贵w和酶發(fā)生結(jié)合反應(yīng)后，添加硼氫化鈉進行還原反應(yīng)，可以得到酶標(biāo)記物。該方法可以提高酶標(biāo)記物的產(chǎn)率，是常見的標(biāo)記抗體使用方法。戊二醛交聯(lián)標(biāo)記法是利用交聯(lián)劑結(jié)合抗原和酶，抗原分子以及酶分子分別結(jié)合。兩種標(biāo)記方法都依賴于氨基、抗原分子和酶的結(jié)合。丙肝抗原的B細(xì)胞位點是HCV衣殼蛋白，屬于強堿性蛋白，有著豐富的堿性氨基酸。如果直接標(biāo)記抗原，將會造成位點抗原表位受到封閉，進而對檢測敏感度產(chǎn)生影響。因此，ELISA檢測方法重組連接硫氧還蛋白（TRX）以及HCV抗原，通過TRXmAb和橋蛋白TRX的反應(yīng)，促進HCV抗原蛋白通過酶標(biāo)記物形成復(fù)合物，可以對HCV抗原標(biāo)記，進行檢測。

目前ELISA方法作為丙肝病毒最常見的檢測和診斷方法，也用于評估臨床治療效果，但ELISA檢測結(jié)果受到實驗操作的影響，其中加樣量是影響檢測結(jié)果的重要因素。加樣量的多少會對檢測結(jié)果產(chǎn)生直接影響，若減少加樣量，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，容易出現(xiàn)漏診情況，影響患者的及時治療，若加樣量增加，則可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，可能造成臨床誤診的情況，加樣量多或少都會影響到最終檢測結(jié)果。目前很多醫(yī)療機構(gòu)仍然采取手工加樣方式進行檢測，人工目測和操作很難準(zhǔn)確控制加樣量，這也是影響檢測結(jié)果的主要因素。因此，本文針對加樣量變化對檢測結(jié)果的影響展開研究，于我中心的采集樣本中隨機選取5份樣本，分別添加不同劑量的樣本量進行對比實驗。經(jīng)過本文統(tǒng)計，1號和5號樣本隨著加樣量增加，S/CO值結(jié)果變化不大，即隨著加樣量增加，S/CO值變化不存在線性關(guān)系。2號、3號和4號樣本隨著加樣量增加，S/CO值也呈現(xiàn)明顯升高趨勢，即隨著樣本加樣量增加，S/CO值存在一定正相關(guān)關(guān)系。在3號樣本中，加樣量不足（≤8μL）時，S/CO值＜1，為陰性。當(dāng)S/CO值在加樣量＜6μL和＞14μL時，加樣量變化對于S/CO結(jié)果無明顯影響。證實當(dāng)標(biāo)本S/CO值在加樣量＜6μL和＞14μL時，加樣量變化并未對測定結(jié)果產(chǎn)生明顯影響。但當(dāng)標(biāo)本S/CO值為0.3-7時，隨著樣本量增加，S/CO值也明顯提高，受到加樣量多少的影響，檢測結(jié)果也存在一定偏差。因此，在ELISA實驗過程中需要重視對加樣槍校正控制，加強對加樣量操作的管理，要求操作人員具備較高質(zhì)量意識，能夠嚴(yán)格控制加樣量，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

此外，在ELISA檢測中，還需要注意以下幾個方面。

①采集樣本。一般情況下檢驗以血清為樣本，采集血清樣本要注意避免發(fā)生溶血反應(yīng)，由于紅細(xì)胞在溶解時可能會釋放過氧化物酶，在ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會異常顯色，血清標(biāo)本檢測時如果受到污染，也可能會表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。若血樣標(biāo)本存放時間過長，造成IgG聚合為多聚體，測定中則易造成假陽性反應(yīng)。一般情況下，5d內(nèi)采集的血樣應(yīng)保存于4℃環(huán)境下，若血樣采集時間超過1周，則需要在低溫環(huán)境下保存。②準(zhǔn)備試劑。根據(jù)試劑盒說明，準(zhǔn)備相關(guān)試劑。ELISA方法中主要使用去離子水或者蒸餾水，取出試劑后，放置在室溫環(huán)境下備用，其余試劑均放置于冰箱中冷藏管理。③加樣量。ELISA方法需要重復(fù)3次加樣處理，包括添加標(biāo)本、添加底物以及添加酶結(jié)合物。在加樣過程中需要在板孔底部加樣，避免在孔壁上加物，注意避免樣本產(chǎn)生氣泡或者濺出。使用微量加樣器添加標(biāo)本，按照實驗規(guī)定量加樣處理，每次添加標(biāo)本都需要更換吸嘴，預(yù)防交叉污染的出現(xiàn)。稀釋血清需要提前進行稀釋，在試管內(nèi)進行稀釋后再加樣。板孔應(yīng)添加稀釋液，再添加血清，使用振蕩器進行震蕩處理，確保充分混合。④保溫。一般情況下包括兩次抗體反應(yīng)，添加標(biāo)本以及添加酶結(jié)合物后出現(xiàn)，抗原抗體反應(yīng)只存在于固相表面?？贵w包被夾心方法將樣本加入板孔之中，抗原沒有同等機會結(jié)合固相抗體，貼近于孔壁位置的抗原可以和抗體結(jié)合，需要經(jīng)過一段時間擴散反應(yīng)后才能達到平衡。使用37℃水浴反應(yīng)，將ELISA板放置于水浴箱中，讓溫度作用，使其達到快速平衡。為了避免受熱蒸發(fā)，要使用封板條將反應(yīng)孔封住處理。若使用保溫箱設(shè)備，則將ELISA反應(yīng)板放置于濕紗布之上，經(jīng)過水浴或者濕盒溫育，反應(yīng)板都不能疊放，保證反應(yīng)板溫度可以達到平衡，并注意溫育時間以及溫度按照規(guī)定設(shè)計。⑤洗滌。ELISA方法通過洗滌作用促進酶標(biāo)記物的分離以及結(jié)合，在洗滌處理后，將板孔中的殘留清除掉，以吸附干擾物質(zhì)，并在洗滌過程中將蛋白質(zhì)吸附洗滌下來。洗滌在實驗過程中十分關(guān)鍵，若洗滌操作質(zhì)量不佳，也可能引起假陽性的問題。如血液凝固不全，存在纖維吸附的問題，洗板不充分，造成非固相酶殘留，引起非特異性顯色的問題，而顯色過深可能會顯示出假陽性的結(jié)果。在洗板后要注意觀察板孔內(nèi)是否存在殘留問題，避免出現(xiàn)假陽性。使用的洗液均需要現(xiàn)配置，否則儲存時間過長也容易引起混濁或者形成絮狀物，容易出現(xiàn)堵孔的問題。按照說明書要求保證洗滌時間，并根據(jù)實際情況適當(dāng)增加洗滌時間，可以避免假陽性的問題。⑥比色。顯色后需要在規(guī)定時間內(nèi)進行比色，以酶標(biāo)儀測定結(jié)果，不能根據(jù)目測結(jié)果判定。并注意觀察各孔比色液體積是否一致，否則可能產(chǎn)生誤差。如果比色液體積過少，液面低可能和孔內(nèi)壁形成折光，造成吸光度的提高。因此測定過程中還需要關(guān)注顯色劑的添加劑量。

因此，在ELISA檢測過程中需要嚴(yán)格控制操作質(zhì)量，按照說明書要求進行操作，才能保證檢測結(jié)果的真實準(zhǔn)確，對丙肝檢測結(jié)果負(fù)責(zé)，降低假陽性率。

綜上所述，為了保證ELISA方法測定丙肝抗體檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實驗過程中要嚴(yán)格遵守技術(shù)要求，使用穩(wěn)定試劑以及先進設(shè)備，更需要保證加樣量的準(zhǔn)確值，嚴(yán)格按照規(guī)范操作進行加樣處理，避免假陽性以及假陰性的結(jié)果。