河南傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑中微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

李斌，彭兆帝，杜帆帆，楊龍輝，王靜

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046）

我國(guó)把傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑稱為老面、酵子、酸面團(tuán)或面肥等。老面是我國(guó)最古老的面團(tuán)起發(fā)劑，從13 世紀(jì)開始老面就被人們用來發(fā)酵面團(tuán)[1]。老面是一種混合型發(fā)酵劑，以米粉、小麥粉或玉米粉等谷物為主要原料，加入酒曲（大曲或小曲）和水，在酵母菌、霉菌以及乳酸菌等各種微生物的共同作用下，連續(xù)經(jīng)過多次發(fā)酵而成[2]。采用傳統(tǒng)老面制作的發(fā)酵面食，較之采用酵母的純種發(fā)酵，具有更好的香氣和口感，這與老面菌種的多樣性有關(guān)[3-5]。在我國(guó)的不同地區(qū)，生產(chǎn)老面的工藝與原材料卻大不相同，以河南的南陽、商丘以及三門峽3 個(gè)地區(qū)為例：南陽地區(qū)的老面原料是米粉，酵種為小曲，經(jīng)過多次保溫發(fā)酵而成；商丘地區(qū)老面的主要原料是玉米粉，酵種為大曲；三門峽地區(qū)的老面則是以小麥粉作為原料，小麥曲和黃酒作為酵種[6]。不同的原料和工藝使不同產(chǎn)地的老面的微生物菌群結(jié)構(gòu)存在一定的差異，對(duì)饅頭的組織結(jié)構(gòu)、老化速率、風(fēng)味特性和保質(zhì)期等有不同的影響[7-8]。

我國(guó)傳統(tǒng)老面與西方國(guó)家的酸面團(tuán)相似，但是我國(guó)對(duì)于傳統(tǒng)老面的研究卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于西方國(guó)家[9]。近年來，老面被越來越多的研究者所重視，主要是針對(duì)不同地區(qū)的傳統(tǒng)老面中的微生物多樣性進(jìn)行分析研究。高靜等[10]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了河北、山西、山東和云南4 個(gè)不同地區(qū)老面的菌群組成，并探究菌群對(duì)饅頭品質(zhì)的影響。閆博文[2]采用高通量測(cè)序技術(shù)研究了山東老面和河南酵子的微生物的菌群多樣性以及不同菌群對(duì)饅頭風(fēng)味特征的影響。傅莉莉[11]采用傳統(tǒng)平板分離技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序檢測(cè)方法，揭示了采自甘肅和新疆的酸面團(tuán)中微生物菌群的多樣性以及結(jié)構(gòu)組成。

高通量測(cè)序技術(shù)（high-throughput sequencing，HTS）具有高速、高通量以及高精確性等特點(diǎn)，為認(rèn)識(shí)傳統(tǒng)老面釀造微生物多樣性提供了有利手段[12]。河南是全國(guó)主要的面粉及面制品加工基地之一[13]，河南位于黃河流域，具有悠久的傳統(tǒng)發(fā)酵面制品的歷史[14]。本研究以鄭州、南陽、三門峽、周口、商丘和安陽6 個(gè)不同地區(qū)的傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑為研究對(duì)象，利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑菌群中的微生物多樣性進(jìn)行分析，以期解析河南傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑中復(fù)雜的菌群結(jié)構(gòu)，為后續(xù)傳統(tǒng)饅頭工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

河南本地傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑采自鄭州（樣本1）、南陽（樣本2）、三門峽（樣本3）、周口（樣本4）、商丘（樣本5）、安陽（樣本6）6 個(gè)地區(qū)，均為自然發(fā)酵而成，被長(zhǎng)期用于制作手工饅頭。樣品采集后置于無菌瓶中，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

瓊脂糖（生物純）：德國(guó)Biofroxx 公司；土壤基因組DNA 提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；醋酸（分析純）：天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16C 臺(tái)式高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；MJ-78A 立式電壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；DYCP-31E 瓊脂糖水平凝膠電泳槽：北京市六一儀器廠；GelDocTMEZImager 凝膠電泳成像分析系統(tǒng)：美國(guó)Bio-rad 公司；Nano2000 超微量紫外分光光度計(jì)；英國(guó)柏點(diǎn)公司；Illumina Miseq2500 測(cè)序儀：美國(guó)Illumina 公司；SW-CJ-2G 超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取

根據(jù)土壤基因組DNA 提取試劑盒說明書提取樣品中的微生物總DNA。提取的DNA 保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及測(cè)序

對(duì)真菌的ITS 基因序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其中包括引物ITS1（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2-Rev（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）[15]。對(duì)細(xì)菌的16S rDNA 的V3～V4區(qū)域基因序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其中包括引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）[16]。PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[17]的方法。按照Illumina MiSeq2500 測(cè)序儀操作說明進(jìn)行pe250/300 雙端測(cè)序，序列信息由MiSeq 控制軟件讀取。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行剪接和低質(zhì)量過濾，然后去除嵌合序列，得到有效的序列進(jìn)行聚類分析，具體參考文獻(xiàn)方法[17]。計(jì)算各個(gè)樣品中微生物的Alpha 多樣性指數(shù)，繪制香農(nóng)（Shannon）指數(shù)曲線，同時(shí)統(tǒng)計(jì)分析各個(gè)樣品中的真菌和細(xì)菌的群落信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌菌群多樣性分析

2.1.1 序列的拼接

利用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)獲得樣本1 至樣本6 對(duì)應(yīng)的真菌原始序列分別為36 482、47 852、38 298、43 467、56 916 條和45 355 條，其平均堿基長(zhǎng)度分別為340、337、432、375、311 bp 和337 bp。經(jīng)拼接、過濾，得到有效序列分別為36 459、47 849、38 226、43 387、56 873、45 318 條，它們的平均堿基長(zhǎng)度分別為298、295、389、334、269 bp 和295 bp。操作分類單元（operational taxonomicunits，OTU）數(shù)量分別為39、23、43、53、23 和53。

2.1.2 Alpha 多樣性分析

通常用于描述微生物群落物種多樣性的Alpha 多樣性指數(shù)主要是香農(nóng)指數(shù)、ACE 指數(shù)、超1（Chaol）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)，它們可以綜合性地評(píng)價(jià)群落物種組成的豐富度[18-19]。ACE 指數(shù)（或超1 指數(shù)）越小，說明菌群的物種豐富度越低；香農(nóng)指數(shù)越小，說明菌群中物種的多樣性越低；辛普森指數(shù)越小，說明菌群中物種的多樣性越高；覆蓋率越小，說明樣本中序列沒有被測(cè)出的概率越高，若覆蓋率＞97%，則說明本次試驗(yàn)結(jié)果是可信的[20]。不同樣品中的真菌菌群的Alpha多樣性指數(shù)的分析結(jié)果見表1。

表1 不同面食發(fā)酵劑中真菌菌群Alpha 多樣性指數(shù)分析Table 1 Alpha diversity index of fungi community in different dough starter cultures

根據(jù)表1 可知，樣本1 的香農(nóng)指數(shù)最大，辛普森指數(shù)最小，證明其真菌物種多樣性最高；樣本4 的超1 指數(shù)和ACE 指數(shù)最大，表明其真菌群落的物種豐富度最高；辛普森指數(shù)值最大的是樣本3，說明它的群落中真菌物種多樣性最低。6 個(gè)樣品的覆蓋率都大于99%，證明本研究取樣合理，測(cè)序結(jié)果可以反映樣本真實(shí)情況。

為了比較不同樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量不同時(shí)物種多樣性的大小和判斷樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理，用Shannon 指數(shù)作為縱坐標(biāo)，提取的序列數(shù)目作為橫坐標(biāo)繪制稀疏性曲線[5]，結(jié)果如圖1。

圖1 不同面食發(fā)酵劑真菌菌群的Shannon 指數(shù)曲線Fig.1 Shannon index curves of fungi community in different dough starter cultures

根據(jù)圖1 可知，6 個(gè)樣品真菌菌群多樣性的大小為樣本1＞樣本6＞樣本4＞樣本5＞樣本2＞樣本3，并且隨著提取序列數(shù)目的不斷增加，Shannon 指數(shù)基本穩(wěn)定不變，曲線趨于平緩，說明測(cè)序的數(shù)據(jù)量逐漸合理。

2.1.3 基于屬水平各樣本中真菌的種類和相對(duì)豐度分析

在屬水平上，以傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑真菌的類型和相對(duì)豐度為基礎(chǔ)，將樣品中的菌屬按相對(duì)豐度劃分，相對(duì)豐度≥0.01%的菌屬作為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度＜0.01%的菌屬作為次要菌屬，把所有次要菌屬劃分為其他，結(jié)果如表2 所示。

表2 不同面食發(fā)酵劑中真菌菌屬及相對(duì)豐度Table 2 Genera and relative abundance of fungi in different dough starter cultures

根據(jù)表2 可知，不同產(chǎn)地的傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑的真菌菌群結(jié)構(gòu)存在著明顯差異，酵母屬（Saccharomyces）是傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑中的優(yōu)勢(shì)真菌屬。酵母屬屬于子囊菌門、酵母亞門、酵母綱、酵母目、酵母科，其中最典型的是釀酒酵母，它是一種與人類有著密切聯(lián)系的酵母。釀酒酵母也是迄今為止對(duì)人類社會(huì)具有較大貢獻(xiàn)的菌種，是釀酒行業(yè)中非常重要的菌種之一，也是面包、糕點(diǎn)和制藥行業(yè)中的主要菌種之一[21]。有孢圓酵母屬（Torulaspora）是一株非釀酒酵母菌，發(fā)現(xiàn)于傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑中，而且是主要存在的酵母類群之一。隨著德爾布有孢圓酵母菌的高耐受性和抗凍性的發(fā)現(xiàn)，引起了非常多的科研工作者的注意[22]。德爾布有孢圓酵母對(duì)面團(tuán)發(fā)酵的能力和商業(yè)面包酵母能力非常相近，因此在食品發(fā)酵行業(yè)具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值[23]。在葡萄糖不足氧氣充足的條件下，德爾布有孢圓酵母的生物生長(zhǎng)量和釀酒酵母的生長(zhǎng)能力非常接近，當(dāng)氧氣的量逐漸缺乏的時(shí)候，釀酒酵母就開始改變呼吸方式，進(jìn)行發(fā)酵代謝，但是德爾布有孢圓酵母仍然可以進(jìn)行有氧呼吸。德爾布有孢圓酵母不但具有耐高滲透壓能力，還有很高的產(chǎn)酯能力，可以使發(fā)酵過程中產(chǎn)生濃郁的果香味[24]。威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）是一種非釀酒酵母，它的發(fā)酵量很小，但是它可以通過合成酶，使原料中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化成酯、酸、醇、醛等芳香物質(zhì)，在釀造過程中也起著重要的作用，其中的異常威克漢姆酵母就是一種典型的產(chǎn)香酵母，具有很強(qiáng)的產(chǎn)香產(chǎn)酯能力[25]。

2.2 細(xì)菌菌群多樣性分析

2.2.1 序列的拼接

利用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)獲得的樣本1 至樣本6 對(duì)應(yīng)的細(xì)菌原始序列分別為73 460、60 215、51 109、46 030、58 818 條和48 140 條，其平均堿基長(zhǎng)度分別為464、462、462、457、458 bp 和451 bp。經(jīng)拼接、過濾，得到有效序列分別為73 284、60 092、50 615、45 482、58 273 條和47 388 條，它們的平均堿基長(zhǎng)度分別為426、425、426、423、423 bp 和417 bp。OTU 數(shù)量分別是34、22、82、98、96 和91。

2.2.2 Alpha 多樣性分析

不同樣品中細(xì)菌菌群的Alpha 多樣性指數(shù)分析結(jié)果見表3。

表3 不同面食發(fā)酵劑中細(xì)菌菌群Alpha 多樣性指數(shù)分析Table 3 Alpha diversity index of bacterial community in different dough starter cultures

根據(jù)表3 可知，樣本5 的香農(nóng)指數(shù)最高，辛普森指數(shù)最低，說明樣本5 中的細(xì)菌群落分布多樣性在所有樣本中是最高的，樣本1 則剛好相反。ACE 指數(shù)和超1指數(shù)最大的樣本均為樣本4，由此可見樣本4 中的細(xì)菌群落分布豐富度在6 個(gè)樣本中是最高的，而樣本2則為最低。6 個(gè)樣本的覆蓋率都大于99%，證明本次取樣合理，測(cè)序結(jié)果可以反映樣本真實(shí)情況。

不同面食發(fā)酵劑細(xì)菌菌群的Shannon 指數(shù)曲線見圖2。

圖2 不同面食發(fā)酵劑細(xì)菌菌群的Shannon 指數(shù)曲線Fig.2 Shannon index curves of bacterial community in different dough starter cultures

由圖2 可見，6 條曲線最終都趨于平穩(wěn)，說明測(cè)序結(jié)果是合理的。并且根據(jù)圖中Shannon 指數(shù)的數(shù)值可以看出，6 個(gè)樣品的細(xì)菌群落多樣性由高到低依次是樣本5＞樣本4＞樣本2＞樣本6＞樣本3＞樣本1。

2.2.3 屬水平細(xì)菌種類和相對(duì)豐度分析

在屬水平上，以傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑細(xì)菌的類型和相對(duì)豐度為基礎(chǔ)，將樣品中的菌屬按相對(duì)豐度劃分，相對(duì)豐度≥0.01%的菌屬作為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度小于0.01%的菌屬作為次要菌屬，并將所有次要菌屬劃分為其他，結(jié)果如下表4 所示。

表4 不同面食發(fā)酵劑中細(xì)菌菌屬及相對(duì)豐度Table 4 Genera and relative abundance of bacterial in different dough starter cultures

根據(jù)表4 可知，6 個(gè)樣本都存在的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬是乳桿菌屬（Lactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）。乳酸菌為傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，且不同地區(qū)樣本中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬存在一定的差異。乳桿菌屬（Lactobacillus）包含發(fā)酵乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、哈爾濱乳桿菌（Lactobacillus harbinensis）和德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）等多個(gè)菌種。乳桿菌屬是目前開發(fā)研究比較深入的一類益生菌，是人類腸道中重要的菌群[26]。片球菌屬（Pediococcus）較為常見的菌種有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、小片球菌（Pediococcus smallus）和有害片球菌（Pediococcus harmful）等。其中的戊糖片球菌是被批準(zhǔn)的可食用菌種，戊糖片球菌具有抑制食源性致病菌、抗氧化以及提高機(jī)體免疫力等優(yōu)點(diǎn)，而且在動(dòng)物飼料以及發(fā)酵食品等方面還有廣泛的應(yīng)用前景[27-28]。魏斯氏菌屬（Weissella）不僅能對(duì)發(fā)酵食品的風(fēng)味以及發(fā)酵進(jìn)程產(chǎn)生巨大影響，而且還能夠提高食品的安全性和保質(zhì)期[29-30]。明串球菌屬（Leuconostoc）包括冷明串珠菌（Leuconostoc frigida）、檸檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和乳酸明串珠菌（Leuconostoc lactis）等7 個(gè)菌種。檸檬明串珠菌是明串球菌屬中較為常見的菌種，其產(chǎn)生的細(xì)菌素可以在不同發(fā)酵食品中進(jìn)行生物保存，也可以應(yīng)用于抗生素耐藥的動(dòng)脈或腸球菌感染的生物治療中[31]。Zhang 等[32]通過對(duì)老面的菌群結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬在自然發(fā)酵面團(tuán)中最普遍；片球菌常存在于植物性發(fā)酵食品中，在發(fā)酵面團(tuán)中也常被發(fā)現(xiàn)。De Vuyst 等[33]發(fā)現(xiàn)酵子中的乳酸菌主要包括片球菌屬（Pediococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）和明串珠菌屬（Leuconostoc）等。

3 結(jié)論

采用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)分析了河南6 個(gè)不同地區(qū)（鄭州、南陽、三門峽、周口、商丘和安陽）的傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑中的微生物多樣性。研究結(jié)果表明：真菌菌群多樣性分析結(jié)果表明在6 個(gè)樣品中鄭州樣本的Shannon 指數(shù)最大，Simpson 指數(shù)最小，證明其真菌物種多樣性最高。6 個(gè)樣品的優(yōu)勢(shì)真菌屬主要是酵母屬（Saccharomyces）和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）。細(xì)菌群落多樣性分析結(jié)果表明商丘樣本的Shannon 指數(shù)最大，Simpson 指數(shù)最小，說明其細(xì)菌物種多樣性最高。6 個(gè)樣品中的細(xì)菌絕大部分是乳酸菌，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬主要有乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串球菌屬（Leuconostoc）和魏斯氏菌屬（Weissella）等。在不同地區(qū)的樣品中優(yōu)勢(shì)真菌和細(xì)菌菌屬的種類和含量存在較大差異。本研究將根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，采用傳統(tǒng)平板劃線分離的方法，以期獲得優(yōu)勢(shì)菌種純種，并對(duì)其發(fā)酵性能進(jìn)行研究，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)具有傳統(tǒng)風(fēng)味饅頭提供一定的理論依據(jù)。