基于高通量測序分析玉米浸泡液細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)及多樣性

陳麗，王敬敬，賀明君，黎銘軒，劉陽，2*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225；2.全國名特優(yōu)新農(nóng)產(chǎn)品全程質(zhì)量控制技術(shù)佛山中心，廣東 佛山 528000）

玉米淀粉生產(chǎn)工藝包括濕法工藝和干法工藝，干法工藝中的脂肪和蛋白質(zhì)含量高，但淀粉純度較低，所以大部分工廠普遍采用濕法工藝制備玉米淀粉[1]。濕法工藝又分為靜止浸泡法和逆流浸泡法，靜止浸泡法操作簡單，但隨著浸泡時(shí)間的延長，浸泡液中的滲透作用逐漸達(dá)到平衡，玉米粒中的可溶性物質(zhì)不再析出，導(dǎo)致玉米淀粉提取率較低，所以此方法不適用于工廠。逆流浸泡法又稱擴(kuò)散法，由若干個(gè)浸泡罐、管道和泵組成，多個(gè)浸泡罐利用管道串聯(lián)在一起，形成浸泡罐裝置，通過裝置的連接作用，使浸泡液沿著裝玉米相反的方向流動(dòng)[2]。逆流浸泡法可以使新鮮的玉米籽粒中所包含的可溶性物質(zhì)與浸泡液溶液的濃度差始終保持在一個(gè)恒定的狀態(tài)，充分提取玉米中的可溶性物質(zhì)[3]，相比于靜止浸泡法，逆流浸泡法能提高玉米淀粉的提取率。因此，逆流浸泡法被大多數(shù)工廠采用[4]。

玉米浸泡液是玉米粒在玉米淀粉生產(chǎn)過程中，通過濕法工藝得到的玉米加工副產(chǎn)物[5]。在浸泡過程中玉米浸泡液會(huì)產(chǎn)生大量微生物，特定的浸泡環(huán)境會(huì)使微生物大量繁殖，主要包括乳桿菌、短粗桿菌、芽孢桿菌、酵母菌等。其中乳酸菌在玉米淀粉提取階段起主要作用，乳酸菌產(chǎn)生的乳酸，在浸泡過程中也起著重要的作用。玉米顆粒中的蛋白質(zhì)，在維持浸泡過程中的Ca 和Mg 金屬離子濃度的同時(shí)，還能促進(jìn)乳酸引起的玉米粒的膨脹和轉(zhuǎn)換，減少不溶性物質(zhì)沉淀[6]。劉慶艾等[7]從玉米浸泡液篩選乳酸菌再加入到玉米浸泡液中，使得玉米淀粉提取率從59.22%提高到63.23%，浸泡周期從傳統(tǒng)的20 h 減少為10 h。叢澤峰等[8]的研究表明人為添加乳酸菌到玉米浸泡液中，既會(huì)提高玉米浸泡液的質(zhì)量，同時(shí)也會(huì)縮短浸泡周期?？梢娪衩捉菀褐械奈⑸锒鄻有院途航Y(jié)構(gòu)對于改善玉米淀粉提取工藝幫助較大。

本研究利用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)對玉米浸泡副產(chǎn)物中的新、老酸玉米浸泡液進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3～V4 測序，獲得玉米浸泡液新酸、老酸中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的組成及微生物多樣性，為玉米逆流浸泡階段的研究和提取玉米淀粉工藝改進(jìn)和優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機(jī)采集市售的不同批次老酸玉米浸泡液和新酸玉米浸泡液，新酸的SO2含量為1 300～1 500 mg/L，固形物少，老酸中SO2含量為80～120 mg/L，固形物多，浸泡溫度均為49～52 ℃。X 代表老酸，L 代表新酸，每個(gè)樣品取3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，樣品信息見表1。

表1 樣品名稱及分組信息Table 1 Sample names and group assignment

E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 試劑盒：美國Omega Bio-tek 公司；瓊脂糖：西班牙biowest 公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒：美國Axygen 公司；建庫試劑盒：美國Bioo Scientific 公司；MiSeq Reagent Kit 測序試劑盒：美國Illumina 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5430 R 小型離心機(jī)、5424R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf 公司；NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)：美國Thermo Fisher Scientific 公司；DYY-6C 電泳儀：北京市六一儀器廠；BioTek ELx800 酶標(biāo)儀：美國Biotek 公司；ABI GeneAmp?9700 型聚合酶鏈反應(yīng)核酸擴(kuò)增儀：美國ABI 公司；Illumina Miseq 測序儀：美國Illumina 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

將玉米浸泡液灌裝至500 mL 無菌藍(lán)蓋瓶中，低溫條件下運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.3.2 DNA 提取

玉米浸泡液中微生物總DNA 的提取按照E.Z.N.A.?SoilDNAKit 試劑盒操作指導(dǎo)書進(jìn)行。吸取3μL DNA利用超微量分光光度計(jì)測定樣品OD 值，計(jì)算DNA純度，以電泳儀檢測核酸樣本的完整性，將檢測合格的DNA 提取物置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 聚合酶鏈反應(yīng)核酸擴(kuò)增

參考鄧高文等[9]的方法進(jìn)行樣品細(xì)菌16S rRNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增及高通量測序Illumina MiSeq，使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）通用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。將PCR 產(chǎn)物合格的樣品送至上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Illumina Miseq 的Miseq PE300 平臺(tái)測序，將測序得到的序列進(jìn)行拼接和過濾，按照97%的相似度進(jìn)行操作分類，使用OTU 分類單位（operational taxonomic units，OTU）[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米浸泡液菌群α 多樣性分析

玉米浸泡液細(xì)菌α 多樣性指數(shù)測定結(jié)果見表2。

表2 玉米浸泡液細(xì)菌α 多樣性指數(shù)測定結(jié)果Table 2 Bacterial α-diversity indexes in corn soaking solution

由表2 可知，在不同的玉米浸泡液樣本中進(jìn)行測序，得到的有效序列242 178 條，其中覆蓋率均達(dá)到了0.99，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明覆蓋率高，測序深度可靠，所測序結(jié)果能夠真實(shí)反映玉米浸泡液中新酸、老酸樣品的細(xì)菌群落組成。

α 多樣性通常用以下指數(shù)來評估[11]，一是樣品物種的豐度（包括Chao 指數(shù)和ACE 指數(shù)），二是物種的多樣性（包括Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)），老酸中的Chao 指數(shù)比新酸更高，可能是因?yàn)殡S著浸泡時(shí)間的延長，浸泡液中的pH 值不斷升高，浸泡環(huán)境呈酸性，導(dǎo)致不耐受酸性的細(xì)菌逐漸消失，所以新酸樣品中細(xì)菌的群落豐度和多樣性降低。

另外Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映了樣本物種的多樣性，Shannon 指數(shù)逐漸增大，代表樣本指數(shù)多樣性越高。由測序結(jié)果可見，玉米浸泡液老酸中的Shannon 指數(shù)高于新酸，可見玉米浸泡液樣品老酸中的菌群多樣性大于新酸。

2.2 菌群結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 基于門水平玉米浸泡液中群落結(jié)構(gòu)分析

在門水平上，圖1 顯示了根據(jù)豐度水平排名前10的物種，其他物種均被合并為其他。

圖1 基于門水平玉米浸泡液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Bacterial community structure in corn soaking solution at the phylum level

從圖1 可以看出，優(yōu)勢菌門有厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）。在樣品中均檢測出厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度均大于50%，表明在玉米浸泡液的浸泡過程中，厚壁菌門占主導(dǎo)地位，這也是因?yàn)楹癖诰T的部分厭氧菌可以在低氧、酸性和高酒精的環(huán)境中可以生存[12]，其中屬于厚壁菌門中的乳酸菌也可以在低氧、低酸的環(huán)境下生長，由此可見，厚壁菌門在玉米浸泡的第一階段起著重要作用。

2.2.2 基于目水平玉米浸泡液中群落結(jié)構(gòu)分析

基于目水平玉米浸泡液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 基于目水平玉米浸泡液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure in corn soaking solution at the order level

如圖2 所示，在目水平上，根據(jù)物種注釋結(jié)果，采用最大值排序法，選取在目水平最大豐度排名前10 的物種，老酸中有乳酸桿菌目（Lactobacillales）、芽孢桿菌目（Bacillales）、棒狀桿菌目（Corynebacteriales）、伯克霍爾德菌目（Burkholderiales）、類芽孢桿菌目（Paenibacillales）、梭菌目（Clostridiales）等，新酸中主要以乳酸桿菌目（Lactobacillales）為主。可見在玉米逆流浸泡的過程，新酸、老酸中主要以乳酸桿菌目為主。研究表明，在逆流浸泡階段，乳酸菌占主導(dǎo)地位，乳酸菌在生產(chǎn)過程中產(chǎn)乳酸，乳酸可以破壞玉米籽粒中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使得可溶性物質(zhì)析出，從而提高玉米淀粉的產(chǎn)率[13]。在浸泡過程中，乳酸桿菌目這類菌種與亞硫酸共同作用，能改善浸泡周期過長的缺點(diǎn)，促進(jìn)淀粉與蛋白質(zhì)分離，提高玉米淀粉產(chǎn)量。此外，也有研究證明，破壞蛋白質(zhì)與淀粉顆粒的結(jié)合，從而使蛋白能更好地溶出[14]。

2.2.3 基于屬水平玉米浸泡液中群落結(jié)構(gòu)分析

基于屬水平玉米浸泡液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 基于屬水平玉米浸泡液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community structure in corn soaking solution at the genus level

從圖3 可以看出，老酸樣品中相對豐度最高的屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）。新酸中主要測到了乳酸桿菌屬（Lactobacillus），可見玉米浸泡液主要優(yōu)勢菌為乳酸桿菌屬。乳酸菌在玉米浸泡過程中發(fā)揮著重要作用，乳酸菌大多是厭氧菌或是部分厭氧的細(xì)菌[15]，在浸泡期間可以在厭氧條件下生長和繁殖，它在發(fā)酵過程中具有重要的生物結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)功能[16]，隨著玉米浸泡發(fā)酵期延長，在發(fā)酵體系中乙醇的濃度和酸度不斷地上升，含氧量逐漸下降，幾乎所有無法承受高酸度、高乙醇濃度和厭氧條件的微生物均逐漸減少，乳酸菌成為絕對優(yōu)勢菌。優(yōu)勢乳酸菌從糖類中產(chǎn)生乳酸和乙酸，造成浸泡液中的pH 值升高，高濃度的酸性環(huán)境會(huì)抑制其他細(xì)菌的生長繁殖，同時(shí)，乳酸菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素等拮抗物質(zhì)，通過與其他微生物競爭底物來影響其他微生物的生長[17-19]，乳酸菌還能降解其中的蛋白質(zhì)，使浸泡液中的不可溶性物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇芪镔|(zhì)，更利于后續(xù)的清洗工作[20]。因此，乳酸菌在浸泡過程中占有絕對優(yōu)勢。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)對玉米淀粉逆流浸泡階段中的新酸、老酸玉米浸泡液樣品中的微生物多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乳酸菌（Lactobacillus）在兩種樣品中均存在，說明在玉米浸泡這個(gè)重要階段乳酸菌（Lactobacillus）占據(jù)主導(dǎo)地位。研究表明，乳酸菌（Lactobacillus）影響玉米浸泡液的質(zhì)量從而影響玉米淀粉的提取質(zhì)量。本研究為玉米淀粉生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供了參考，同時(shí)為篩選玉米浸泡液中的優(yōu)勢菌群奠定基礎(chǔ)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，老酸浸泡液的細(xì)菌含量比新酸更豐富。原因可能為老酸浸泡液中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，細(xì)菌在此條件下不斷生長繁殖；隨著浸泡時(shí)間的延長，浸泡環(huán)境逐漸呈酸性，酸性條件會(huì)抑制雜菌的生長，細(xì)菌豐度降低。因此，與老酸相比，新酸中的細(xì)菌群落降低。

SO2濃度隨著浸泡時(shí)間的延長而增加，亞硫酸濃度增加，首先通過胚芽作用于玉米皮，使胚芽變鈍，表皮由半滲透膜變?yōu)闈B透膜，便于谷物中可溶性物質(zhì)浸出到玉米浸泡液中。添加亞硫酸被用來作為減少玉米浸泡中的可溶性物質(zhì)的手段，其作用是將玉米粒中的一些不溶性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性蛋白質(zhì)，從而提高玉米淀粉的提取率。同時(shí)浸泡玉米的最佳溫度為50 ℃左右，一些細(xì)菌不能在高溫下生長，因此可以通過減少在50 ℃環(huán)境下不能生長的致病和有害細(xì)菌，提高玉米淀粉的質(zhì)量。