辣椒于地標區(qū)與非地標區(qū)種植的揮發(fā)性化合物差異分析

陳菊，王雪雅，杜雄，徐玉，孫小靜，何建文，蓬桂華*

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院 辣椒研究所，貴州 貴陽 550006；2.沿河土家族自治縣和平街道辦事處，貴州 銅仁 565300；3.修文縣第七中學，貴州 貴陽 550006）

辣椒屬于茄科，常被稱為海椒、辣茄、辣子、番椒、大椒、海椒、辣角等[1-4]，具有較高的營養(yǎng)價值，富含維生素、辣椒素等[1]，有抑菌、抗氧化、開胃的功效[5]，是常用的蔬菜及調(diào)味品[6]。辣椒是一種脂肪含量低的食品，深受全世界人們的喜愛[3，5-8]。據(jù)統(tǒng)計，現(xiàn)在世界各種辣椒的總生產(chǎn)量已經(jīng)超過6 000 萬t，成為僅次于番茄、豆類的世界第三大蔬菜作物[6]，而貴州是我國的辣椒種植大省，貴州現(xiàn)有辣椒品種資源400 余份[3]，根據(jù)不同產(chǎn)地的地理氣候形成了很多具有地方特色的優(yōu)勢辣椒品種，即地標品種，而將該品種一直以來種植的地點稱為該品種的地標區(qū)。目前，關于貴州地標品種辣椒的研究主要在地標品種品質(zhì)、風味以及彼此間品質(zhì)差異分析等方面，而對以相同種植方式將地標品種種植在非地標區(qū)后的辣椒品質(zhì)差異卻鮮有研究。

頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer，HS-SPME-GC-MS）技術(shù)是一種研究食品揮發(fā)性成分的方法，該方法可以對食品中的揮發(fā)性成分進行定性及定量分析。目前，HS-SPME-GC-MS 已廣泛應用于酒類、肉類、食用菌類、發(fā)酵食品類等的揮發(fā)性成分分析。揮發(fā)性風味物質(zhì)是評價辣椒品質(zhì)的重要指標，為了初步探究地標品種辣椒在地標區(qū)種植和非地標區(qū)種植的品質(zhì)差異，本文選取3 個貴州名優(yōu)產(chǎn)地的辣椒品種（大方皺椒、黃平線椒、黃楊小米辣）和1 個優(yōu)良辣椒品種（黔椒8 號）為研究對象，通過相同的種植方式將這4 種辣椒同時種在大方、黃平、遵義和貴陽地區(qū)，辣椒成熟后采摘，通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對地標品種辣椒種植在地標區(qū)和非地標區(qū)的干辣椒樣品揮發(fā)性成分進行測定，分析其香氣成分差異，以期為篩選優(yōu)化辣椒加工原料及地標品種基地的擴大提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

地標區(qū)及非地標區(qū)種植的辣椒品種如表1 所示。

表1 在地標區(qū)及非地標區(qū)種植的辣椒品種Table 1 Pepper varieties grown in landmark and non-landmark areas

將各品種在各種植地點以株行距50 cm×100 cm、種植密度17 550 株/hm2的種植方式種植，施以相同的化肥，辣椒成熟后各采摘10 kg，立即運回實驗室，于55 ℃烘72 h，經(jīng)粉碎機粉碎2 min 后裝于密封袋中待測。

1.1.2 試劑

2-辛醇（≥99%）：北京索萊寶科技有限公司；甲醇（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器

萃取纖維（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）、手動SPME裝置：美國Supelco 公司；GC/MS 聯(lián)用儀（7890B/7000D）：美國安捷倫公司；電熱鼓風干燥箱（DNG-9240A）：南京同皓干燥設備有限公司；高速萬能粉碎機（FW80）：天津市臺斯特儀器有限公司；電子天平（BSA423S）：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

參考文獻[9-10]的方法并進行優(yōu)化，稱取1.0 g 粉碎后的干辣椒粉于10 mL 固相微萃取采樣瓶中，加入5 μg/μL 2-辛醇（甲醇溶解）30 μL 作為內(nèi)標，用含聚四氟乙烯襯里的硅橡膠蓋子密封，將密封好的樣品瓶于60 ℃磁力攪拌器中熱平衡8 min，然后將已老化的50/30 μm PDMS 萃取頭通過隔墊插入樣品瓶內(nèi)，推出纖維頭，使之距樣品面約5 mm，頂空吸附40 min 后，快速移出萃取頭，并迅速將萃取頭插入GC-MS 進樣口（250 ℃）熱解吸5 min。

1.4 GC-MS 條件

1.4.1 色譜條件

采用HP-5MS 5% 毛細管柱（30 m × 250 μm ×0.25 μm）；載氣為高純He（99.999%），流速1 mL/min，不分流；進樣口溫度250 ℃；升溫程序為起始溫度45 ℃，以3.5 ℃/min 升至85 ℃（保留2 min），再以2.5 ℃/min升至126 ℃（保留2 min），之后以1 ℃/min 升至140 ℃，最后以20 ℃/min 升至280 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電子電離源的電子轟擊能量70 eV、發(fā)射電流34.6 μA、離子源溫度230 ℃、四極桿溫度150 ℃、接口溫度280 ℃、調(diào)諧文件stune.u、質(zhì)量掃描范圍20～550 amu。

1.5 譜圖分析方法

將試驗數(shù)據(jù)通過NIST17 標準譜庫進行自動檢索和人工解析，將匹配度大于85%作為物質(zhì)鑒定依據(jù)，檢索鑒定，采用內(nèi)標相對定量法，得到各揮發(fā)性物質(zhì)生物相對含量，計算公式如下。

式中：Ci為i 物質(zhì)的濃度，μg/g；Ai為i 物質(zhì)的峰面積；B 為內(nèi)標物峰面積；mB為內(nèi)標物的添加量，g；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 2017 軟件和維恩圖在線制作軟件作圖，SPSS 19.0 軟件作數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同辣椒揮發(fā)性風味物質(zhì)種類和含量差異分析

采用HS-SPME-GC-MS 分別對種植在地標區(qū)和非地標區(qū)的樣品進行揮發(fā)性風味物質(zhì)測定分析。各樣品揮發(fā)性風味物質(zhì)種類如圖1 所示。

圖1 各地標辣椒品種在地標區(qū)及非地標區(qū)種植的揮發(fā)性物質(zhì)種類差異Fig.1 Differences in the types of volatile compounds of various landmark pepper varieties planted in the landmark and non-landmark areas

由圖1 可知，大方皺椒共鑒定出27 種揮發(fā)性化合物，黃平線椒共鑒定出85 種揮發(fā)性化合物，黃楊小米辣共鑒定出61 種揮發(fā)性化合物，黔椒8 號共鑒定出59 種揮發(fā)性化合物。大方皺椒在非地標區(qū)種植后的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類均高于在地標區(qū)種植后的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類（圖1A），HDF8001、ZDF8001、GDF8001的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類分別是DDF8001 的1.14、1.23、1.09 倍，其中非地標區(qū)種植的ZDF8001 揮發(fā)性風味物質(zhì)種類最多，主要為烷烴和烯烴類物質(zhì)。黃平線椒在非地標區(qū)種植后的揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類均高于地標區(qū)（圖1B），其中遵義地區(qū)種植的黃平線椒（ZHP8001）的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類最為豐富，共有52種，是地標區(qū)種植辣椒（HHP8001）的2.2 倍，烯烴類是ZHP8001 最多的風味物質(zhì)種類。黃楊小米辣在地標區(qū)種植后的揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類高于非地標區(qū)（圖1C），地標區(qū)ZHY9001 揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類最多，分別是非地標區(qū)種植的黃楊小米辣DHY9001、GHY9001和HHY9001 的1.5、1.1、1.6 倍，且烯烴類物質(zhì)是ZHY9001揮發(fā)性物質(zhì)中種類最豐富的物質(zhì)。黔椒8 號在大方地區(qū)種植的揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類最豐富（圖1D），分別是HQJ08、ZQJ08 和GQJ08 的1.21、1.03、1.55 倍，其中烯烴類物質(zhì)是種類最豐富的揮發(fā)性物質(zhì)。由此可見，各地標辣椒品種在地標區(qū)和非地標區(qū)種植后的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類差別較大，大方皺椒和黃平線椒在非地標區(qū)種植后的揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類均高于地標區(qū)，黃楊小米辣和黔椒8 號在地標區(qū)種植后的揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類高于非地標區(qū)。

物質(zhì)的含量在一定程度上可反映其在樣品中的作用。為了進一步了解各類物質(zhì)含量對辣椒風味的影響，將樣品中的物質(zhì)進行歸類后分析，如酯類、醇類、烷烴類、烯烴類及芳香族類物質(zhì)等如圖2 所示。

圖2 各地標辣椒品種在地標區(qū)及非地標區(qū)種植的揮發(fā)性物質(zhì)含量差異Fig.2 Differences in the content of volatile compounds of various landmark pepper varieties planted in landmark and nonlandmark areas

由圖2 可知，在地標區(qū)種植的DDF8001 揮發(fā)性風味物質(zhì)含量最高（圖2A），可達1.52 mg/g，分別是HDF8001、ZDF8001、GDF8001 的1.4、1.2、1.8 倍。DDF8001、GDF8001和HDF8001 中烯烴類物質(zhì)含量最高，ZDF8001 中烷烴類物質(zhì)和烯烴類含量較高，有研究表明烷烴類物質(zhì)分子量較大，氣味閾值較高，香氣特征不顯著[11]，而烯烴類物質(zhì)中的萜烯類化合物的閾值較低，且有花香、果香味[12-13]。黃平線椒在非地標區(qū)種植后揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量高于地標區(qū)（圖2B），其中大方地區(qū)種植的黃平線椒DHP8001 揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量最高，是地標區(qū)種植的黃平線椒HHP8001 的4.0 倍，且DHP8001 中酯類物質(zhì)含量最高，是地標區(qū)的29.5 倍，其中十二烷酸甲酯、十六烷酸甲酯、（Z）-丁酸2-己烯基酯、十三酸12-甲基-甲酯、丙酸2-甲基-己酯是DHP8001 特有的酯類物質(zhì)。酯主要通過有機酸和醇的酯化作用形成[14]，具有花香、果香、草藥香味、奶油香味、可可香味和薄荷味等[14-18]，對整體風味有較大貢獻，如水楊酸甲酯具有薄荷味，是一種芳香活性成分[19-20]，乙酸乙酯給人一種怡人的芳香[21]。地標區(qū)種植的黃楊小米辣（ZHY9001）揮發(fā)性風味物質(zhì)含量高于非地標區(qū)（圖2C），ZHY9001揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量分別是非地標區(qū)種植的黃楊小米辣DHY9001、GHY9001 和HHY9001 的2.0、1.2、2.1 倍，其中酮類物質(zhì)是地標區(qū)黃楊小米辣含量最多的揮發(fā)性物質(zhì)。酮類物質(zhì)主要是氨基酸的降解、脂質(zhì)氧化、烷烴降解和仲醇脫氫過程中形成的[22-25]。研究發(fā)現(xiàn)，酮類物質(zhì)一般具有花香氣味，且性質(zhì)穩(wěn)定，香氣持久，對風味起重要作用[26-27]。此外，貴陽地區(qū)和大方地區(qū)種植的黃楊小米辣的揮發(fā)性風味物質(zhì)總含量較黃平地區(qū)高，分別是其的1.68、1.04 倍。黔椒8 號在大方地區(qū)種植（DQJ08）的揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量最高（圖2D），分別是HQJ08、ZQJ08 和GQJ08 的1.21、1.03、1.55倍，其中烷烴類物質(zhì)是DQJ08 中含量最多的揮發(fā)性物質(zhì)。綜上，各地標辣椒品種在地標區(qū)和非地標區(qū)種植后的揮發(fā)性風味物質(zhì)含量具有明顯差別，其中在地標區(qū)種植的大方皺椒、黃楊小米辣和黔椒8 號揮發(fā)性風味物質(zhì)含量高于其在非地標區(qū)種植的揮發(fā)性物質(zhì)含量，而黃平線椒則是在非地標區(qū)種植后的揮發(fā)性物質(zhì)含量更高。

2.2 種植在地標區(qū)和非地標區(qū)的各地標辣椒特有揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

為了進一步了解各地標辣椒品種在地標區(qū)及非地標區(qū)種植的揮發(fā)性物質(zhì)差異，對它們特有的揮發(fā)性物質(zhì)進行分析。結(jié)果如圖3 和表2 所示。

圖3 各地標辣椒品種在地標區(qū)及非地標區(qū)種植的揮發(fā)性物質(zhì)韋恩圖Fig.3 Venn diagram of volatile compounds of various landmark pepper varieties planted in the landmark area and non-landmark area

表2 各地標辣椒品種在地標區(qū)及非地標區(qū)種植后特有和共有的揮發(fā)性物質(zhì)Table 2 Unique and common volatile compounds of landmark pepper varieties planted in landmark and non-landmark areas

由圖3 可知，在4 個地區(qū)種植的大方皺椒共同含有10 種揮發(fā)性物質(zhì)，但不同地區(qū)種植的大方線椒都有它們獨特的揮發(fā)性物質(zhì)，DDF8001、GDF8001、HDF8001和ZDF8001 特有的物質(zhì)分別有8、4、6、5 種。其中DDF8001 所含特有物質(zhì)種類最多，其中酮類物質(zhì)賦予DDF8001 持久的花香味[10，27]，酯賦予其酯香味[28]，烯烴類物質(zhì)具有花香、果香味[29-30]。4 個地方種植的黃平線椒含有的共同揮發(fā)性物質(zhì)有14 種（圖3B），但它們在4 個地區(qū)種植后也有著各自特有揮發(fā)性風味物質(zhì)。DHP8001、GHP8001、HHP8001 和ZHP8001 特有的物質(zhì)分別有11、12、4 及27 種，特有揮發(fā)性風味物質(zhì)種類最多的是ZHP8001，其中對傘花烴賦予ZHP8001 果味和草本氣味[30-31]。HP8001 在地標地區(qū)特有的揮發(fā)性物質(zhì)是3-乙?；?1H-吡咯啉、芳烴烯、甲酯（Z）-7-十六碳烯酸、9，10-脫氫-環(huán)異長葉烯。種植在4 個地區(qū)的HY9001 的共有揮發(fā)性物質(zhì)有11 種（表2、圖3C），各地的HY9001 也有其特有物質(zhì)，DHY9001、GHY9001、HHY9001 和ZHY9001 特有的物質(zhì)分別有4、10、2 及11 種，地標區(qū)種植的ZHY9001 所含特有物質(zhì)最多，如α-甲基-苯乙醇、（E）-3-十四碳烯、1-（1-丁炔）環(huán)戊醇、1-甲基-萘、2-乙基-2-丙基-1-己醇、3，4-二甲基苯甲醛、α-石竹烯、萘和異丁基草酸壬基酯、1-（2-呋喃基）-乙酮、8-甲基壬酸甲酯等，這些物質(zhì)中α-石竹烯具有清香，青草味道；酯類賦予ZHY9001 芳香氣和水果香。QJ08 在4 個地區(qū)種植后共有的物質(zhì)有9 種（表2、圖3D），DQJ08、GQJ08、HQJ08 和ZQJ08 特有的物質(zhì)分別有6、4、10 及13 種，其中特有揮發(fā)性物質(zhì)種類最多的是ZQJ08，地標區(qū)種植的DQJ08 特有揮發(fā)性物質(zhì)為7-甲基-3-辛炔、四甲基吡嗪、2，2-二甲基-己酯丙酸、4-甲基戊基3-甲基丁酸酯、4-甲基戊基4-甲基戊酸酯、6，10-二甲基-5，9-十一雙烯-2-酮，其中四甲基吡嗪賦予其花生、榛子和可可香氣。

2.3 不同品種辣椒揮發(fā)性風味物質(zhì)的主成分分析

對16 個辣椒樣品揮發(fā)性風味物質(zhì)進行主成分分析，相關特征值見表3。

表3 主成分特征值及貢獻率Table 3 Eigenvalues and contribution rates of principal components

選取特征值大于1 的成分作為主成分，由表3 可知，揮發(fā)性風味物質(zhì)有4 個主成分，并且這4 個主成分的累計方差貢獻率為78.788%（一般累計方差貢獻率大于70%表示結(jié)果理想），說明這4 個因子可以較好地代表干辣椒粉的揮發(fā)性風味的成分信息，故選擇這4 個成分代表所有因子進行揮發(fā)性風味物質(zhì)分析。

采用主成分分析法進行因子分析時，可通過旋轉(zhuǎn)后的主成分載荷進行因子解釋，主成分載荷矩陣可以反映變量對相應主成分的影響程度，各物質(zhì)的載荷值如表4 所示。

表4 主成分的載荷矩陣Table 4 Loading matrix of principal components

由表4 可知，第1 主成分主要反映酯類、烷烴類、醛類和烯烴類物質(zhì)信息；第2 主成分主要反映酮類、芳香族和其他物質(zhì)的信息；第3 主成分主要反映酸類物質(zhì)的信息；第4 主成分主要反映醇類物質(zhì)的信息。

將風味物質(zhì)進行標準化后，對4 個主成分進行評分（Yi），即將載荷（Ui）與9 個變量的標準值（Xi）相乘，即Y1=U1iX1+U1iX2+U1iX3+U1iX4+U1iX5+U1iX6+U1iX7+U1iX8+U1iX9；Y2=U2iX1+U2iX2+U2iX3+U2iX4+U2iX5+U2iX6+U2iX7+U2iX8+U2iX9；Y3=U3iX1+U3iX2+U3iX3+U3iX4+U3iX5+U3iX6+U3iX7+U3iX8+U3iX9；Y4=U4iX1+U4iX2+U4iX3+U4iX4+U4iX5+U4iX6+U4iX7+U4iX8+U4iX9，分數(shù)越高表明該主成分的貢獻越大。

將表3 中的特征向量進行標準化處理，然后與對應的4 個主成分得分做內(nèi)積，得到綜合風味品質(zhì)的評價函數(shù)Y，表達式為Y=0.391 5Y1+0.279 1Y2+0.185 6Y3+0.143 8Y4，根據(jù)各式得到的風味評價綜合得分值及排序如表5 所示。

表5 綜合得分結(jié)果Table 5 Composite score

得分值相對越大，干辣椒的揮發(fā)性風味品質(zhì)越好。由表5 可知，第1 主成分得分最高的是GQJ08，其次為GHP8001。第2 主成分得分最高的是GHP8001，第3 主成分得分最高的是GQJ08，第4 主成分得分最高的是HQJ08。在風味品質(zhì)綜合評價得分最高的是GHP8001，其次是GQJ08，再次是ZDF8001。故從揮發(fā)性風味物質(zhì)來看，在貴陽市花溪區(qū)種植的黃平線椒品質(zhì)最好，其次是在貴陽市花溪區(qū)種植的黔椒8 號，然后是在遵義市綏陽縣黃楊鎮(zhèn)種植的大方皺椒，對于黃楊小米辣而言，在大方縣理化鄉(xiāng)種植后的品質(zhì)較好。

3 結(jié)論

通過HS-SPME-GC-MS 對種植在地標區(qū)和非地標區(qū)的大方皺椒、黃平線椒、黃楊小米辣和黔椒8 號4 種干辣椒的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析，大方皺椒共鑒定出27 種揮發(fā)性化合物、黃平線椒共鑒定出85 種揮發(fā)性化合物、黃楊小米辣共鑒定出61 種揮發(fā)性化合物、黔椒8 號共鑒定出59 種揮發(fā)性化合物。其中非地標區(qū)遵義種植的大方皺椒、黃平線椒比在其他3 個地方種植的大方皺椒、黃平線椒的揮發(fā)性化合物種類多，分別為27、52 種；對于黃楊小米辣和黔椒8 號，則是種植在地標區(qū)的辣椒揮發(fā)性化合物種類最多，分別為37、34 種。4 種干辣椒的主要揮發(fā)性化合物為烷烴類、烯烴類、酯類、醛類、醇類、酮類、芳香烴類、其他類化合物等揮發(fā)性物質(zhì)。從揮發(fā)性化合物含量上看，大方皺椒、黃平線椒、黃楊小米辣和黔椒8 號含量最高的分別是DDF8001、DHP8001、ZHY9001 和DQJ08，其中DDF8001 含量最高的揮發(fā)性物質(zhì)是烯烴類，DQJ08含量最高的揮發(fā)性物質(zhì)是烷烴類，DHP8001 含量最高的揮發(fā)性物質(zhì)是酯類，ZHY9001 含量最高的揮發(fā)性物質(zhì)是酮類物質(zhì)。

對種植在地標區(qū)和非地標區(qū)的大方皺椒、黃平線椒、黃楊小米辣和黔椒8 號4 種干辣椒的揮發(fā)性風味物質(zhì)種類共性和特性進行分析，發(fā)現(xiàn)在4 個地方區(qū)種植的大方皺椒共同含有10 種揮發(fā)性物質(zhì)，種植在4 個地區(qū)的黃平線椒共同含有14 種物質(zhì)，種植在4 個地區(qū)的黃平小米辣共同含有11 種物質(zhì)，種植在4 個地區(qū)的黔椒8 號共同含有9 種物質(zhì)。相同的品種種植的地方不同，均會含有其特殊的揮發(fā)性風味物質(zhì)。

干辣椒揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析表明，酯類、烷烴類、醛類和烯烴類物質(zhì)載荷值較高，即是影響干辣椒香味的主要因素。通過主成分分析結(jié)果對16 個干辣椒樣品的風味物質(zhì)進行打分，根據(jù)得分評價不同干辣椒樣品間的整體風味的高低，得出在風味品質(zhì)綜合評價得分最高的是在貴陽市花溪區(qū)種植的黃平線椒（GHP8001），其次是貴陽市花溪區(qū)種植的黔椒8 號（GQJ08），再次是遵義市綏陽縣黃楊鎮(zhèn)種植的大方線椒（ZDF8001）。對于黃楊小米辣而言，在大方縣理化鄉(xiāng)種植的辣椒（DHY9001）品質(zhì)較好。辣椒的風味與生長地理環(huán)境、施肥方式、采收時間等密切相關，本文通過對4 種辣椒種植在地標區(qū)和非地標區(qū)的揮發(fā)性風味成分進行分析，初步確定了地標品種辣椒與其在非地標地區(qū)種植后的揮發(fā)性物質(zhì)的差異，為不同產(chǎn)品的地標品種辣椒的鑒別、企業(yè)辣椒加工原料的優(yōu)化及地標品種基地的擴大奠定理論基礎。