不同溶劑提取對(duì)刺梨物質(zhì)含量變化及抗氧化活性的影響

穆興燕，吳勝，郭銀萍，劉含，徐菁，劉曉燕，2*

（1.貴陽學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550005）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt）又叫山王果、刺莓果等，多種植于云貴高原、四川西部高原等地區(qū)。刺梨含有豐富的維生素C、黃酮、多酚、單寧、三萜等有益于人體健康的營養(yǎng)成分[1]，因其維生素C 含量十分豐富，故被譽(yù)為“VC之王”。同時(shí)，刺梨具有極高的藥用價(jià)值，其花、葉、果、籽均可作為藥物使用，不僅具有解酒[2]、抗炎[3]、提高免疫力、抗氧化[4]等功能，還可以降血糖[5-6]、降血脂[7-8]、抗突變、抗腫瘤[9]、改善糖尿病炎癥[10]、抗衰老[11]等。

目前，對(duì)刺梨活性成分進(jìn)行提取、分離、純化的研究較多，常用的提取溶劑有水、乙醇、甲醇等[12]，但不同溶劑提取對(duì)刺梨活性物質(zhì)含量變化及抗氧化活性影響的研究鮮有報(bào)道。趙玉紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，采用不同濃度乙醇提取“魯赫”刺薔薇葉時(shí)，60%乙醇提取效果顯著優(yōu)于其他濃度乙醇。因刺梨的活性成分十分豐富，故本試驗(yàn)采用強(qiáng)極性及中等極性的溶劑進(jìn)行提取比較。以水、甲醇、60%乙醇、無水乙醇、正丁醇和乙酸乙酯為溶劑，通過對(duì)刺梨提取物中的活性物質(zhì)含量和抗氧化活性進(jìn)行測定分析，以便后期為刺梨資源的加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨：產(chǎn)自貴州省龍里縣；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（99%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulph onate，ABTS）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（93%）：上海麥克林生化科技有限公司；福林酚試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、無水乙醇、正丁醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙酸乙酯：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速多功能粉碎機(jī)（CS-2000）：永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；高功率數(shù)控超聲波清洗器（KQ-400KDE）：昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1300）：上海愛朗儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（i3）：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；全波長酶標(biāo)儀（MultiskanSKY）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 刺梨提取物的制備

將刺梨洗凈、切片、去籽、烘干至恒重，粉碎過篩，各準(zhǔn)確稱取50 g 刺梨干粉于6 個(gè)錐形瓶中，分別加入水、甲醇、60%乙醇、無水乙醇、正丁醇和乙酸乙酯以料液比1∶10、1∶8、1∶6（g/mL）提取3 次，45 ℃水浴浸泡2 h，于45 ℃、200 W 超聲輔助提取30 min，抽濾后合并3 次濾液，減壓濃縮，加入純凈水將水提物溶解定容至100 mL，其他提取物用60%乙醇溶解定容至100 mL，用10 mL 離心管分裝好后，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 不同溶劑提取物含量測定

1.3.2.1 刺梨提取物中抗壞血酸含量的測定

參照曹建康等[14]的方法進(jìn)行測定。結(jié)果以每克干粉中含有的抗壞血酸質(zhì)量表示，即mg/g 干粉。

1.3.2.2 刺梨提取物中總多酚含量的測定

參照王慧竹[15]的方法進(jìn)行測定。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=126.83X+0.015 5（R2=0.999 8）。結(jié)果以每克刺梨干粉中所含沒食子酸當(dāng)量（mg/g 干粉）表示。

1.3.2.3 刺梨提取物中總黃酮含量的測定

參照連紫凌等[16]的方法進(jìn)行測定。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=10.839X-0.013 3（R2=0.999 3）。結(jié)果以每克刺梨干粉中所含蘆丁當(dāng)量（mg/g干粉）表示。

1.3.2.4 刺梨提取物中單寧含量的測定

參照李志等[17]的方法進(jìn)行測定。以單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=67.03X-0.024 9（R2=0.997 4）。結(jié)果以每克刺梨干粉中所含單寧酸當(dāng)量（mg/g 干粉）表示。

1.3.2.5 刺梨總?cè)坪康臏y定

參照張雁冰等[18]和代甜甜等[19]的方法進(jìn)行測定。以熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=3.991 4X-0.047 6（R2=0.998 4）。結(jié)果以每克刺梨干粉中所含熊果酸當(dāng)量（mg/g 干粉）表示。

1.3.3 不同溶劑提取物抗氧化活性測定

1.3.3.1 DPPH 自由基清除率的測定

參照汪洋等[20]的方法，稍作修改，分別配制濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL 的刺梨不同溶劑提取物，吸取處理好的刺梨提取物各100 μL，與等量0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液混勻后，暗反應(yīng)30 min，于517 nm 處測定吸光值A(chǔ)1。分別用等量無水乙醇代替樣品和DPPH 乙醇溶液作對(duì)照組，測定吸光值A(chǔ)0和A2。DPPH 自由基清除率（X1，%）按下式進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3.2 羥基自由基清除率的測定

參照劉曉燕等[21]的方法，稍作修改，分別配制濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 的刺梨不同溶劑提取物，移取處理好的刺梨提取物各100 μL，分別加入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L 水楊酸溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液各50 μL 混勻，于37 ℃反應(yīng)30 min，在510 nm 處測定樣品的吸光值A(chǔ)i。分別用等量水代替H2O2溶液和樣品，測定吸光值A(chǔ)i0和A0。羥基自由基清除率（X2，%）按下式計(jì)算。

1.3.3.3 超氧陰離子自由基清除率的測定

參照劉曉燕等[21]的方法，稍作修改，分別配制濃度為1、2、3、4、5 mg/mL 的刺梨不同溶劑提取物，吸取處理好的刺梨提取物各50 μL，先加入0.1 mol/L Tris-HCl（pH8.2）緩沖液125 μL，于25 ℃預(yù)熱20 min，再加入50 μL 4.5 mol/L 鄰苯三酚溶液混勻后于25 ℃反應(yīng)6 min，最后加入10 mmol/L HCl 溶液20 μL 終止反應(yīng)，于320 nm 處測定吸光值A(chǔ)2，分別以等量純凈水代替樣品和鄰苯三酚溶液，測定吸光值A(chǔ)0和A1。超氧陰離子自由基清除率（X3，%）計(jì)算公式如下。

1.3.3.4 ABTS+自由基清除率的測定

參照劉曉燕等[21]的方法，稍作修改，分別配制濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL 的刺梨不同溶劑提取物，吸取處理好的刺梨提取物各30 μL，加入200 μL ABTS 測定液（將7 mmol/L ABTS 溶液與4.9 mmol/L 過硫酸鉀溶液等量混合），反應(yīng)5 min 后于734 nm 處測定吸光值A(chǔ)1。用蒸餾水代替樣品作空白對(duì)照，測定吸光值A(chǔ)0。ABTS+自由基清除率（X4，%）按下式計(jì)算。

1.3.3.5 還原力測定

采用鐵氰化鉀還原法[22]，分別配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 的刺梨不同溶劑提取物，依次加入刺梨不同溶劑提取物、磷酸緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6）、1%鐵氰化鉀水溶液各1 mL，于50 ℃水浴加熱20 min，取出后迅速冷水浴，再加入10%三氯乙酸溶液1 mL，混勻后以3 000 r/min 離心10 min。分別按體積比5∶4∶1 取上清液、純凈水和0.1%三氯化鐵溶液混合均勻，于700 nm 處測定其吸光值。

1.3.3.6 刺梨不同溶劑提取物總抗氧化活性評(píng)價(jià)

采用APC 指數(shù)[23-24]評(píng)價(jià)刺梨不同溶劑提取物的總抗氧化活性。APC 指數(shù)（A，%）計(jì)算公式如下。

A=（I/Imax×X）×100

式中：I 為每種方法測定的半抑制濃度的倒數(shù)，mL/mg；Imax為每種方法測定的半抑制濃度的倒數(shù)最大值，mL/mg；X 為測定方法的總數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Execl 和GraphPad Prism 8.4.2（679）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，采用Origin 2018 64Bit 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取物含量分析

2.1.1 刺梨提取物中抗壞血酸含量

對(duì)不同溶劑提取物中抗壞血酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 不同溶劑對(duì)刺梨提取物中抗壞血酸含量的影響Fig.1 Effect of different solvents on ascorbate content in Rosa roxburghii extract

由圖1 可知，采用不同溶劑提取得到的刺梨提取物中，抗壞血酸含量相差較大。其中水提取物中抗壞血酸含量最高，高達(dá)（85.00±0.20）mg/g 干粉，乙酸乙酯提取物中抗壞血酸含量最低，僅有（2.46±0.07）mg/g 干粉，與陳軍[25]研究結(jié)果一致，因VC是水溶性維生素，易溶于水，所以在水中溶解度較大。

2.1.2 刺梨提取物中總多酚含量

對(duì)不同溶劑提取物中總多酚含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖2。

圖2 不同溶劑對(duì)刺梨提取物中總多酚含量的影響Fig.2 Effect of different solvents on total polyphenols content in Rosa roxburghii extract

由圖2 可知，采用不同極性的溶劑提取得到的刺梨提取物中，總多酚含量差異明顯，其中乙酸乙酯提取物僅有（3.03±0.04）mg/g 干粉，60%乙醇提取物高達(dá)（102.66±1.28）mg/g 干粉。研究結(jié)果表明，由于相似相溶的原理以及不同提取溶劑的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等不同，60%乙醇溶液更有利于刺梨酚類物質(zhì)的溶出。這與董怡等[26]研究結(jié)果一致，因此60%乙醇是刺梨總多酚的良好提取溶劑。

2.1.3 刺梨提取物中總黃酮含量

對(duì)不同溶劑提取物中總黃酮含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3。

圖3 不同溶劑對(duì)刺梨提取物中總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of different solvents on total flavonoid content in Rosa roxburghii extract

由圖3 可知，采用不同溶劑提取得到的提取物中，60%乙醇提取得到的刺梨總黃酮含量最高，其次是水、甲醇、無水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯，這與劉世馨等[27]研究結(jié)果一致。相比其他幾種溶劑，60%乙醇提取刺梨總黃酮效果最好。研究表明，刺梨中總多酚含量高于總黃酮含量[28]，而本試驗(yàn)中，60%乙醇提取物中總黃酮含量[（106.09±0.35）mg/g 干粉]高于總多酚含量[（102.66±1.28）mg/g 干粉]，其原因可能是刺梨中總黃酮類物質(zhì)相較于其他溶劑更易溶于60%乙醇。

2.1.4 刺梨提取物中單寧含量

對(duì)不同溶劑提取物中單寧含量進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4。

圖4 不同溶劑對(duì)刺梨提取物中單寧含量的影響Fig.4 Effect of different solvents on tannin content in Rosa roxburghii extract

由圖4 可知，采用不同溶劑提取得到的提取物中，60%乙醇溶液提取出的刺梨提取物中單寧含量最高[（97.54±2.31）mg/g 干粉]，是正丁醇提取物[（8.58±0.78）mg/g 干粉]的11 倍左右。單寧屬于酚類物質(zhì)中的鞣質(zhì)類，溶于水和乙醇，所以60%乙醇有利于刺梨單寧的提取，與Sepahpour 等[29]的研究結(jié)果一致。由總多酚含量、總黃酮含量和單寧含量可以表明，60%乙醇水溶液比純水更有利于此類物質(zhì)的溶出。

2.1.5 刺梨提取物中總?cè)坪?/p>

對(duì)不同溶劑提取物中總?cè)坪窟M(jìn)行測定，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 不同溶劑對(duì)刺梨提取物中總?cè)坪康挠绊慒ig.5 Effect of different solvents on total triterpene content in Rosa roxburghii extract

三萜是一類基本母核由30 個(gè)碳原子組成的萜類化合物，以游離形式或以與糖結(jié)合成苷或酯的形式存在于植物體內(nèi)，根據(jù)三萜類化合物在植物體內(nèi)的存在形式、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可分為三萜皂苷及其苷元和其他三萜類。由圖5 可知，采用不同溶劑提取得到的提取物中，60%乙醇刺梨提取物中總?cè)坪孔罡遊（110.28±13.85）mg/g 干粉]，乙酸乙酯提取物中刺梨總?cè)坪孔畹蚚（8.94±0.65）mg/g 干粉]，根據(jù)相似相溶原理與相關(guān)研究表明：三萜類化合物極性與溶劑極性越接近，越有利于三萜類化合物溶出[30]。且三萜皂苷一般易溶于熱水、含水稀醇、熱甲醇和熱乙醇中，而三萜皂苷元不溶于水，易溶于石油醚、乙醚等有機(jī)溶劑，所以采用不同溶劑對(duì)刺梨進(jìn)行提取得到了混合提取物，而分光光度法測定的是總?cè)坪?，因此不同溶劑提取得到的總?cè)坪坑兴煌?/p>

2.2 不同溶劑提取物抗氧化活性分析

2.2.1 DPPH 自由基清除率

對(duì)不同溶劑提取物清除DPPH 自由基的能力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 不同濃度提取物和VC 的DPPH 自由基清除率Fig.6 DPPH radical scavenging activities of different Rosa roxburghii extracts and VC

由圖6 可知，當(dāng)刺梨提取物濃度在0.04～0.16 mg/mL范圍內(nèi)，除正丁醇和乙酸乙酯提取物外，其余溶劑提取物的DPPH 自由基清除率均大幅增加，當(dāng)濃度達(dá)到0.16 mg/mL 之后，清除率增加緩慢，而VCDPPH 自由基清除率在濃度為0.02～0.08 mg/mL 范圍內(nèi)明顯增加，后趨于平緩，且清除率可高達(dá)90.35%，說明刺梨不同溶劑提取物清除DPPH 自由基的能力稍弱于VC。

2.2.2 羥基自由基清除率

對(duì)不同溶劑提取物清除羥基自由基的能力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 不同濃度提取物和VC 的羥基自由基清除率Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activities of different Rosa roxburghii extracts and VC

由圖7 可知，在濃度為0.4～2.0 mg/mL 范圍內(nèi)，隨著刺梨提取物濃度的增大，羥基自由基的清除率逐漸增大。當(dāng)濃度為1.2 mg/mL 時(shí)，各溶劑提取物的羥基自由基清除率均在55%左右，而當(dāng)VC濃度為0.08 mg/mL時(shí)，羥基自由基即可達(dá)到55%，說明刺梨各溶劑提取物清除羥基自由基的能力低于VC。

2.2.3 超氧陰離子自由基清除率

對(duì)不同溶劑提取物清除超氧陰離子自由基的能力進(jìn)行測定，結(jié)果見圖8。

圖8 不同濃度提取物和VC 的超氧陰離子自由基清除率Fig.8 Superoxide anion radical scavenging activities of different Rosa roxburghii extracts and VC

由圖8 可知，提取物濃度在1～4 mg/mL 范圍內(nèi)，其超氧陰離子自由基清除率明顯上升。其中乙酸乙酯提取物的清除率高達(dá)100%，水提取物清除率達(dá)96%，當(dāng)濃度超過4 mg/mL 之后，清除率增加逐漸減緩，而VC的超氧陰離子自由基清除率在濃度達(dá)到0.4 mg/mL 時(shí)已達(dá)到97.25%，濃度超過0.4 mg/mL 之后清除率逐漸趨于平緩。說明刺梨各溶劑提取物清除超氧陰離子自由基的能力低于VC。

2.2.4 ABTS+自由基清除率

對(duì)不同溶劑提取物清除ABTS+自由基的能力進(jìn)行測定，結(jié)果見圖9。

圖9 不同濃度提取物和VC 的ABTS+自由基清除率Fig.9 ABTS+radical scavenging activities of different Rosa roxburghii extracts and VC

由圖9 可知，刺梨提取物的濃度在0.04～0.12 mg/mL范圍內(nèi)，ABTS+自由基清除率隨提取物濃度的增大而增加，其清除率最高可達(dá)91.80%，當(dāng)濃度達(dá)到0.12 mg/mL后，除甲醇和60%乙醇提取物的清除率趨于平緩?fù)?，其他溶劑提取物的清除率均呈上升趨勢，VC的清除率在濃度為0.02～0.06 mg/mL 之間明顯增加，達(dá)到0.06 mg/mL之后趨于平緩，其清除效果遠(yuǎn)高于刺梨各溶劑提取物的清除效果。

2.2.5 還原能力

對(duì)不同溶劑提取物的還原能力進(jìn)行測定，結(jié)果見圖10。

圖10 不同濃度提取物和VC 的還原能力Fig.10 Reducing power of different Rosa roxburghii extract and VC

由圖10 可知，60%乙醇提取物隨著濃度的增大其吸光值明顯增大，而其他5 種溶劑的吸光值隨著濃度的增大，增幅出現(xiàn)波動(dòng)。由此表明60%乙醇提取物的還原能力比其他5 種溶劑提取物的還原能力強(qiáng)且穩(wěn)定。

2.2.6 刺梨不同溶劑提取物抗氧化活性綜合評(píng)價(jià)

對(duì)刺梨不同溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果見表1。

表1 刺梨不同溶劑提取物抗氧化活性的綜合評(píng)價(jià)Table 1 Comprehensive evaluation of antioxidant activities of different Rosa roxburghii extract

由表1 可知，當(dāng)自由基清除率和還原能力達(dá)到50%時(shí)，各提取物濃度越低則抗氧化能力越強(qiáng)，即IC50值越低，其抗氧化活性越高。除陽性對(duì)照VC外，DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除能力、還原能力最高的是60%乙醇提取物，羥基自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力最高的是甲醇和乙酸乙酯提取物。由于不同的自由基之間其性質(zhì)和空間構(gòu)型等不同，所以測定抗氧化結(jié)果不同，因此采用APC 指數(shù)對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，刺梨不同溶劑提取物中抗氧化活性最強(qiáng)的是60%乙醇提取物，與Sompila 等[31]的研究結(jié)果一致，表明60%乙醇有利于刺梨相關(guān)物質(zhì)的提取且抗氧化活性相對(duì)較高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用水、甲醇、60%乙醇、無水乙醇、正丁醇和乙酸乙酯6 種極性不同的溶劑對(duì)刺梨進(jìn)行提取，對(duì)其抗壞血酸含量、總多酚含量、總黃酮含量、單寧含量和總?cè)坪窟M(jìn)行測定。結(jié)果表明，不同的活性物質(zhì)在不同溶劑中溶解性不同，其中60%乙醇提取物中總多酚含量、總黃酮含量、單寧含量和總?cè)坪孔罡?，分別為（102.66±1.28）、（106.09±0.35）、（97.54±2.31）、（110.28±13.85）mg/g 干粉，而水提取物中抗壞血酸含量最高，為（85.00±0.20）mg/g 干粉。乙酸乙酯提取物中總多酚含量、總黃酮含量、抗壞血酸含量和總?cè)坪孔畹?，分別為（3.03±0.04）、（2.78±0.11）、（2.46±0.07）、（8.94±0.65）mg/g 干粉。同時(shí)采用多種方法測定抗氧化能力，結(jié)果顯示不同的方法得到的抗氧化結(jié)果不同，這可能是由于不同的自由基之間其性質(zhì)和空間構(gòu)型不同，且不同溶劑的極性和結(jié)構(gòu)性質(zhì)等不同，導(dǎo)致提取物中各種物質(zhì)含量有差異，因此采用APC 指數(shù)對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，刺梨不同溶劑提取物中抗氧化活性由強(qiáng)到弱依次為60%乙醇提取物＞甲醇提取物＞水提取物＞無水乙醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物。抗氧化活性不僅與提取物中總多酚、總黃酮含量等有關(guān)，還與其他活性物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等有關(guān)，提取物中多種物質(zhì)之間存在的協(xié)同或拮抗作用，還有待進(jìn)一步研究。