血管內(nèi)皮生長因子-A165對形覺剝奪性近視豚鼠鞏膜重塑的影響

彭慶生,高洪蓮,孫瑞婷,張鳳一,王 磊,李 童,張 磊

0 引言

近視是全世界主要的公共衛(wèi)生問題之一[1]。全球約有26.20億人患有近視,3.99億人患有高度近視,據(jù)估計到2050年,全球?qū)⒂薪?7.58億近視患者,其中高度近視患者達(dá)到9.38億[2]。近視,尤其是高度近視不僅會導(dǎo)致模糊的視覺,還將極大地增加眼部病變的風(fēng)險,引發(fā)脈絡(luò)膜新生血管、視網(wǎng)膜萎縮、視網(wǎng)膜脫離和視神經(jīng)病變等疾病[3-4]。目前高度近視已成為全球人口視力損傷的主要原因之一[5]。因此,采取有效的防控措施對于預(yù)防近視發(fā)生和減少向高度近視進(jìn)展至關(guān)重要。

目前研究表明,眼軸增長是引發(fā)近視的主要原因[6],而鞏膜重塑變薄與眼軸延長顯著相關(guān),其不僅是眼軸增長的主要機(jī)制,還是近視發(fā)生時的重要改變[7-8],因此鞏膜重塑可能是控制近視的關(guān)鍵靶點。而鞏膜重塑主要依賴于其細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變,受多種因子調(diào)控[9],主要包括基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2,TIMP-2)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β及α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)等重要因子。視網(wǎng)膜中的多巴胺(dopamine,DA)是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),在視覺信息傳遞和屈光發(fā)育調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10-11],其活性改變可以通過視網(wǎng)膜-鞏膜級聯(lián)機(jī)制影響鞏膜重塑,進(jìn)而調(diào)節(jié)眼球的生長發(fā)育,被認(rèn)為是近視的終止信號[12-13]。而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-A165具有直接和間接的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用[14],可以保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)元[15],體內(nèi)外均能促進(jìn)DA神經(jīng)元的存活和功能恢復(fù)[16-17],故推測其在玻璃體腔內(nèi)注射后可以作用于視網(wǎng)膜神經(jīng)元,調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜中DA的活性,進(jìn)而影響鞏膜重塑。本研究通過遮蓋豚鼠右眼建立形覺剝奪性近視(form-deprivation myopia,FDM)模型,探討玻璃體腔內(nèi)注射VEGF-A165對FDM豚鼠鞏膜重塑的影響及其對近視的干預(yù)作用,從而為近視防控提供新的思路。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組選取健康3周齡英國短毛三色豚鼠120只(濟(jì)南金豐實驗動物有限公司),雌雄不限,體質(zhì)量150～200g。采用隨機(jī)數(shù)字表法將豚鼠分為空白組、FDM組、PBS組、1ng組、5ng組、10ng組,每組20只。自然照明環(huán)境下12h/12h晝夜循環(huán),自由攝水?dāng)z食,維持溫度為22℃～25℃,濕度為50%～70%。本研究通過濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會審批(批準(zhǔn)號:20220128-77),實驗動物的使用嚴(yán)格遵循濱州醫(yī)學(xué)院動物管理委員會的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2主要試劑與儀器主要試劑:重組人蛋白VEGF-A165(美國R&D Systems公司);復(fù)方托吡卡胺滴眼液(參天制藥中國有限公司);組織RNA快速提取試劑盒(艾科瑞生物工程有限公司);兔抗鼠MMP-2(A6247)、TIMP-2(A16439)、TGF-β1(A16640)、TGF-β2(A3640)、α-SMA(A1011)多克隆抗體(中國ABclonal股份有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天生物科技有限公司)。主要儀器:帶狀光檢影鏡(蘇州六六視覺科技有限公司);A型超聲(法國Quantel公司);高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型建立空白組豚鼠不做任何干預(yù);FDM組、PBS組、1ng組、5ng組、10ng組豚鼠均用修剪出左眼、雙耳和口鼻的半透明無毒氣球遮蓋右眼處理,分籠飼養(yǎng),每天光照與黑暗周期為12h/12h,連續(xù)遮蓋14d建立形覺剝奪性近視豚鼠模型。

1.2.2藥物干預(yù)遮蓋前根據(jù)分組在PBS組、1ng組、5ng組、10ng組豚鼠右眼玻璃體腔內(nèi)分別注射PBS緩沖液2.5μL、重組人蛋白VEGF-A1651、5、10ng[16-17],其中VEGF-A165均溶于2.5μL的PBS緩沖液中。玻璃體腔注射前1d使用妥布霉素滴眼液滴右眼。舒泰肌肉注射麻醉,聚維酮碘消毒豚鼠結(jié)膜囊及眼表后用生理鹽水沖洗干凈,顯微鏡下用眼科鑷固定眼球,注射器垂直鞏膜進(jìn)針,避開晶狀體推進(jìn)約2～3mm后注射,停留10s后用眼科鑷輕輕夾住針孔輔助拔出針頭,觀察有無液體流出、結(jié)膜有無紅腫,氧氟沙星眼膏涂眼,半透明無毒氣球遮眼。術(shù)后3d內(nèi)觀察右眼有無炎癥,氧氟沙星眼膏涂眼(每日3次)。

1.2.3眼部生物學(xué)參數(shù)測量造模前后分別測量各組豚鼠右眼的屈光度和眼軸長度。測量屈光度前,用復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴右眼散瞳,待瞳孔充分散大后使用帶狀光檢影鏡測量屈光度,由經(jīng)驗豐富的檢影師驗光,根據(jù)工作距離以等效球鏡度(球鏡度+1/2柱鏡度)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,連續(xù)測量5次計算平均值作為該眼的屈光度。測量眼軸長度前,用鹽酸丙美卡因滴眼液行角膜表面麻醉,待藥物生效后應(yīng)用眼部A超測量眼軸長度,選擇手動模式連續(xù)測量5次計算平均值,精確到0.01mm。

1.2.4標(biāo)本收集造模結(jié)束后,注射凝血劑處死豚鼠,摘取右眼眼球,于冰上快速取其視網(wǎng)膜和后極部鞏膜,保存于-80℃冰箱。

1.2.5高效液相色譜法檢測視網(wǎng)膜中DA含量取各組豚鼠視網(wǎng)膜稱重,每mg組織樣本加入新鮮配制的勻漿液20μL(H3ClO40.1mol/L,EDTA Na20.1mmo/L,內(nèi)標(biāo)物DHBA),-40℃冷凍勻漿(2mm氧化鋯珠,60Hz,30s,4次);低溫離心(20000r/min,30min,4℃)后取上清保存于-80℃冰箱。測樣前取出再次離心(20000r/min,30min,4℃)后取上清液上機(jī)檢測。色譜柱:Thermo Acclaim Rapid Separation Liquid Chromatography (RSLC) 2.1*100mm C182.2μm,柱溫40℃;流動相:含NaH2PO490mmo/L,檸檬酸50mmo/L,OSA 1.7mmo/L,EDTA 50μmol/L和乙腈4.5%。所有數(shù)據(jù)均由Chromeleon 6.9色譜工作站采集與分析,以內(nèi)標(biāo)法計算目標(biāo)物濃度。

1.2.6RT-PCR法檢測鞏膜中MMP-2、TIMP-2、TGF-β2、TGF-β1、α-SMAmRNA的表達(dá)取各組豚鼠鞏膜,在低溫研磨儀中充分研磨后,根據(jù)試劑盒說明書中的純化步驟提取鞏膜總RNA,隨后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)程序:42℃孵育2min,37℃孵育15min,85℃加熱5s,以4℃降溫結(jié)束。以GAPDH為內(nèi)參(引物序列見表1),進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性1min,95℃變性10s,60℃延伸30s,循環(huán)40次,記錄Ct值,使用2-ΔΔCt法計算各目的基因相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.7Westernblot法檢測鞏膜中MMP-2、TIMP-2、TGF-β2、TGF-β1、α-SMA蛋白的表達(dá)根據(jù)分組將豚鼠鞏膜置于不同的研磨管中,加入裂解液和蛋白酶抑制劑后于低溫研磨儀中研磨5min,轉(zhuǎn)移至EP管,置于4℃中靜置30min,低溫離心30min(4℃,12000r/min),取上清液于新的EP管中,采用BCA濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,剩余上清液中加入5×loading buffer,恒溫金屬浴中98℃煮5～10min,蛋白樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后,室溫條件下加入5% BSA封閉2h,加入對應(yīng)的一抗稀釋液(抗體的稀釋方法參照其說明書選取稀釋溶液與最佳濃度),于4℃冰室搖床上孵育過夜,TBST沖洗3次×15min,室溫條件下加入二抗孵育1h,TBST沖洗4次×15min,化學(xué)發(fā)光法顯影,Image J軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1眼部生物學(xué)參數(shù)造模前,各組豚鼠右眼均呈現(xiàn)遠(yuǎn)視狀態(tài),各組豚鼠右眼屈光度、眼軸長度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模14d后,與空白組相比,FDM組豚鼠右眼屈光度變?yōu)樨?fù)值,眼軸顯著延長,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與FDM組相比,PBS組豚鼠右眼屈光度、眼軸長度未發(fā)生明顯變化(均P>0.05),而1ng組、5ng組、10ng組豚鼠右眼向近視偏移程度均減輕,眼軸長度均較短(均P<0.01),其中1ng組豚鼠右眼近視偏移程度和眼軸長度均低于5ng組和10ng組,5ng組豚鼠右眼屈光度和眼軸長度均低于10ng組,三組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 各組豚鼠造模前后右眼屈光度和眼軸長度比較

2.2高效液相色譜法檢測視網(wǎng)膜中DA含量造模14d后,空白組、FDM組、PBS組、1ng組、5ng組、10ng組豚鼠右眼視網(wǎng)膜中DA含量分別為108.737±8.297、58.623±6.547、61.383±7.900、98.202±6.170、84.535±11.470、72.275±6.863ng/g,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=37.555,P<0.01)。與空白組相比,FDM組豚鼠右眼視網(wǎng)膜中DA含量明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與FDM組相比,PBS組豚鼠右眼視網(wǎng)膜中DA含量未發(fā)生明顯變化(P>0.05),而1ng組、5ng組、10ng組豚鼠右眼視網(wǎng)膜中DA含量均增加(均P<0.01),其中1ng組增加較5ng組明顯,5ng組增加較10ng組明顯,三組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3RT-PCR法檢測鞏膜中相關(guān)基因的表達(dá)造模14d后,與空白組相比,FDM組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA mRNA相對表達(dá)量均增加,TGF-β1、TIMP-2 mRNA相對表達(dá)量均減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與FDM組相比,PBS組豚鼠右眼鞏膜中各目的基因的相對表達(dá)量未發(fā)生明顯變化(均P>0.05),而1ng組、5ng組、10ng組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA mRNA相對表達(dá)量均減少,TGF-β1、TIMP-2 mRNA相對表達(dá)量均增加(均P<0.01),其中1ng組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA mRNA相對表達(dá)量均低于5ng組和10ng組,TGF-β1、TIMP-2 mRNA相對表達(dá)量均高于5ng組和10ng組(均P<0.01),5ng組豚鼠右眼鞏膜中TGF-β2、α-SMA mRNA相對表達(dá)量均低于10ng組,TGF-β1、TIMP-2 mRNA相對表達(dá)量均高于10ng組(均P<0.01), 但5ng組和10ng組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2 mRNA相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.353),見表3。

表3 造模后各組豚鼠鞏膜中相關(guān)基因的表達(dá)

2.4Westernblot法檢測鞏膜中相關(guān)蛋白的表達(dá)造模14d后,與空白組相比,FDM組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA蛋白相對表達(dá)量均增加,TIMP-2、TGF-β1蛋白相對表達(dá)量均減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與FDM組相比,PBS組豚鼠右眼鞏膜中各蛋白相對表達(dá)量未發(fā)生明顯變化(均P>0.05),而1ng組、5ng組、10ng組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA蛋白相對表達(dá)量均減少,TIMP-2、TGF-β1蛋白相對表達(dá)量均增加(均P<0.01),其中1ng組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA蛋白相對表達(dá)量均低于5ng組和10ng組,TGF-β1、TIMP-2蛋白相對表達(dá)量均高于5ng組和10ng組(均P<0.01),5ng組豚鼠右眼鞏膜中TGF-β2、α-SMA蛋白相對表達(dá)量均低于10ng組,TGF-β1、TIMP-2蛋白相對表達(dá)量均高于10ng組(均P<0.05), 但5ng組和10ng組豚鼠右眼鞏膜中MMP-2蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.610),見圖1。

圖1 造模后各組豚鼠鞏膜中相關(guān)蛋白的表達(dá) A:Western Blot電泳圖;B:MMP-2蛋白相對表達(dá)量(F=99.230,P<0.01);C:TIMP-2蛋白相對表達(dá)量(F=94.752,P<0.01);D:TGF-β2蛋白相對表達(dá)量(F=49.873,P<0.01);E:TGF-β1蛋白相對表達(dá)量(F=121.672,P<0.01);F:α-SMA蛋白相對表達(dá)量(F=56.915,P<0.01)。bP<0.01 vs 空白組;dP<0.01 vs FDM組;fP<0.01 vs 1ng組;gP<0.05,hP<0.01 vs 5ng組。

3 討論

近年來,近視的病因及機(jī)制一直是眼科研究的熱點,盡管具體的機(jī)制目前仍不清楚,但多數(shù)研究認(rèn)為眼軸長度的異常增加是引發(fā)近視的主要原因,鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑是眼軸增長的主要機(jī)制[7-8,18]。當(dāng)鞏膜重塑發(fā)生時,其細(xì)胞外基質(zhì)中膠原降解增加、蛋白聚糖合成減少、成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,鞏膜原纖維組裝紊亂,鞏膜生物力學(xué)變?nèi)?鞏膜逐漸變薄和延伸,眼軸隨之延長,近視也逐漸發(fā)展[9,19]。由此可見,鞏膜重塑在近視的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,可能是近視機(jī)制的一個關(guān)鍵靶點。

鞏膜重塑是一個受多因素調(diào)控的動態(tài)過程,其中局部缺氧是該過程的主要誘因。研究表明,缺氧可以調(diào)控鞏膜重塑相關(guān)因子的活動,引起細(xì)胞外基質(zhì)中膠原含量的下降和肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,最終導(dǎo)致鞏膜重塑[20-21]。同時,MMP-2在該過程中也發(fā)揮重要作用,其含量的增加不僅可使鞏膜中Ⅰ型膠原的降解增加,使膠原纖維逐漸變細(xì),引起鞏膜重塑,近視的啟動也依賴于MMP-2的表達(dá)增加[22-23];而TIMP-2是MMP-2的內(nèi)源性抑制因子,可使鞏膜中膠原的降解減少,兩者之間的失衡可引起鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)代謝異常,膠原蛋白水平下降,從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)重塑[24-25]。α-SMA在鞏膜重塑中也發(fā)揮關(guān)鍵作用,其具有細(xì)胞收縮特性,可以促進(jìn)近視發(fā)生時鞏膜的變薄和延伸,同時α-SMA表達(dá)量的增加標(biāo)志著肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞應(yīng)力的增加[26-27]。TGF-β在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用,不僅可以調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和膠原蛋白的含量,還可以特異性調(diào)節(jié)鞏膜細(xì)胞的收縮特性,影響α-SMA的表達(dá)[26],其中TGF-β1不僅可以促進(jìn)鞏膜成纖維細(xì)胞的增殖,還可調(diào)控Ⅰ型膠原的合成,增加基質(zhì)中膠原的含量[28],而TGF-β2主要調(diào)節(jié)基質(zhì)中成纖維細(xì)胞的增殖[29],可以呈劑量依賴性地促進(jìn)大鼠鞏膜中成纖維細(xì)胞的增殖,使鞏膜增厚[30]。綜上所述,MMP-2、TIMP-2、TGF-β1、TGF-β2、α-SMA在調(diào)控鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用,因此通過測定上述指標(biāo)的表達(dá),可以有效觀察鞏膜重塑情況。現(xiàn)已有大量研究表明,隨著近視的發(fā)生,鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA的表達(dá)增加[9,26],TIMP-2、TGF-β1的表達(dá)降低[24,28],這與本研究中FDM組豚鼠右眼鞏膜中各種因子的表達(dá)一致,均代表著近視性鞏膜重塑的建立。

視網(wǎng)膜中的DA是傳遞視覺信息的視網(wǎng)膜-鞏膜信號級聯(lián)的起點,與眼球的屈光發(fā)育息息相關(guān)[13]。研究表明,DA活性的改變可以影響視網(wǎng)膜與其色素上皮層中的信號通路,進(jìn)而影響脈絡(luò)膜和鞏膜之間的信息傳遞,最終通過鞏膜的細(xì)胞外基質(zhì)重塑調(diào)節(jié)眼睛的生長發(fā)育[12,20]。同時,VEGF已經(jīng)被證明是一種潛在的治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物,可以通過營養(yǎng)DA神經(jīng)元,增加神經(jīng)遞質(zhì)DA的分泌[17,31],其中VEGF-A165是主要的同種型,在海馬神經(jīng)節(jié)、背根神經(jīng)節(jié)和視網(wǎng)膜神經(jīng)元中均具有神經(jīng)保護(hù)作用,對神經(jīng)元具有直接的抗細(xì)胞毒性作用[15-16]。所以我們推測VEGF-A165在眼內(nèi)可以增加視網(wǎng)膜中DA的活性,對鞏膜重塑產(chǎn)生影響,從而干擾近視發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),玻璃體腔內(nèi)注射抗VEGF藥物(康柏西普)會降低FDM豚鼠視網(wǎng)膜中DA含量,促進(jìn)近視發(fā)展[32],間接證明了VEGF對視網(wǎng)膜中DA含量的影響。

本研究通過玻璃體腔內(nèi)注射VEGF-A165,驗證其對FDM豚鼠鞏膜重塑的影響,以及對FDM的干擾效果。Beazley-Long等[16]研究發(fā)現(xiàn),玻璃體腔內(nèi)注射10ng VEGF-A165對大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用,可減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)核層細(xì)胞凋亡;同時,Meng等[17]研究提出,VEGF對DA神經(jīng)元的保護(hù)作用具有劑量依賴性,在1ng/mL組和10ng/mL組中,1ng/mL組的神經(jīng)保護(hù)作用更強(qiáng)。因此,本研究采用了3種不同劑量(1、5、10ng)進(jìn)行注射,探究不同劑量VEGF對FDM豚鼠鞏膜重塑的作用是否也會有差異。結(jié)果顯示,與FDM組相比,VEGF-A165處理組豚鼠視網(wǎng)膜中DA含量均增加,這與Sheikh等[31]研究結(jié)果一致,該研究表明VEGF對DA神經(jīng)元具有保護(hù)作用,本研究進(jìn)一步證明了這種神經(jīng)保護(hù)可以作用于視網(wǎng)膜DA神經(jīng)元,增加視網(wǎng)膜中DA的含量。同時,本研究發(fā)現(xiàn),1ng組、5ng組、10ng組豚鼠近視程度均降低,眼軸增長趨勢明顯減緩,鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA表達(dá)量均減少,TIMP-2、TGF-β1表達(dá)量均增加,而Yu等[9]和Jobling等[26]研究認(rèn)為,近視恢復(fù)期豚鼠鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA表達(dá)的降低以及TIMP-2、TGF-β1表達(dá)的升高,代表著基質(zhì)中膠原含量的升高、鞏膜厚度的增加等,這些均提示近視性鞏膜重塑受到抑制。因此,本研究結(jié)果表明VEGF-A165可以增加視網(wǎng)膜中DA含量,對鞏膜重塑產(chǎn)生抑制作用,抑制近視進(jìn)展。Lin等[33]研究表明,玻璃體腔內(nèi)注射DA主要通過調(diào)節(jié)鞏膜發(fā)育抑制近視發(fā)展,而本研究結(jié)果提示鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)的增加會抑制近視的發(fā)展,間接證明了視網(wǎng)膜與鞏膜之間的級聯(lián)信號在近視發(fā)生發(fā)展中的作用,同時還提出了一種可以提高視網(wǎng)膜中DA濃度的方法,即玻璃體腔內(nèi)注射VEGF-A165。

此外,本研究發(fā)現(xiàn),隨著VEGF-A165劑量的增加,近視偏移程度加重,視網(wǎng)膜中DA含量逐漸減少,鞏膜中MMP-2、TGF-β2、α-SMA表達(dá)量均逐漸增加,TIMP-2、TGF-β1表達(dá)量均逐漸減少,但鞏膜中MMP-2在5ng組與10ng組中的表達(dá)無顯著差異。分析其原因是由于鞏膜缺氧時缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)主要被激活[21],引起鞏膜重塑相關(guān)因子的改變,而缺氧時MMP-2的上調(diào)依賴于HIF-2α的表達(dá)而不是HIF-1α的表達(dá)[34],且房水中MMP-2濃度達(dá)到一定范圍時與VEGF-A呈負(fù)相關(guān)[35],但具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。本研究中,增加VEGF-A165的劑量反而會減弱對豚鼠鞏膜重塑的抑制作用,其中1ng劑量的抑制效果最好。推測其可能的機(jī)制主要有以下兩種:(1)視網(wǎng)膜中DA含量的降低導(dǎo)致了這種結(jié)果。由于DA主要通過影響鞏膜的發(fā)育和重塑調(diào)控近視的發(fā)生發(fā)展[12],且降低視網(wǎng)膜中DA的含量會促進(jìn)近視發(fā)展[32],因此本研究中玻璃體腔注射VEGF-A165劑量增加引起視網(wǎng)膜中DA含量相對降低,可能通過級聯(lián)信號減弱對鞏膜重塑的抑制作用,從而發(fā)揮對近視的促進(jìn)作用;而視網(wǎng)膜中DA含量由1ng組到10ng組逐漸減少的原因,可能是由于VEGF-A165對DA神經(jīng)元的作用在低劑量下獲益最大[17]導(dǎo)致的;(2)VEGF-A165過量可能透過血-視網(wǎng)膜屏障直接作用于脈絡(luò)膜[36],誘導(dǎo)病理性血管生成,使脈絡(luò)膜毛細(xì)血管被血栓阻塞[37],進(jìn)而減少了脈絡(luò)膜血流灌注,加重了鞏膜的缺氧[20],從而相對性地促進(jìn)了5ng組與10ng組豚鼠鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)的重塑。但對于以上兩種推測的驗證,還需通過對VEGF-A165作用機(jī)制的進(jìn)一步研究闡明。

本研究通過在FDM豚鼠玻璃體腔內(nèi)注射不同劑量的VEGF-A165,發(fā)現(xiàn)均會增加視網(wǎng)膜中DA含量,對豚鼠鞏膜重塑起到抑制作用,抑制FDM進(jìn)展。其機(jī)制可能是VEGF-A165通過營養(yǎng)和保護(hù)視網(wǎng)膜DA神經(jīng)元,增加視網(wǎng)膜中DA的活性,進(jìn)而通過信號級聯(lián)抑制鞏膜重塑,從而發(fā)揮對近視的抑制作用,但具體的發(fā)生機(jī)制還需進(jìn)一步實驗研究。同時本研究發(fā)現(xiàn),1、5、10ng VEGF-A165對鞏膜重塑的抑制作用存在差異,其中1ng效果最好,5ng次之,10ng最差。本文不足之處在于僅觀察了3種劑量VEGF-A165作用的差異,對于更小或更大濃度梯度是否還會存在差異,以及0.5ng或2ng是否會有比1ng具有更好的效果等問題尚不明確,因此還需在此研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討VEGF-A165作用的最佳劑量范圍,準(zhǔn)確把握劑量差異對個體造成的影響,從而為以后VEGF-A165用于臨床近視防控提供實驗基礎(chǔ)。