ADSCs、VEGF和GM-CSF修復(fù)成纖維細(xì)胞放射性損傷的機(jī)制研究

尹小芳 秦嶺 楊超 閻海萍 栗穎利 李敏

[摘要]目的：研究對比脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）對放射后成纖維細(xì)胞（Fibroblasts，F(xiàn)b）修復(fù)的影響機(jī)制。方法：使用劑量為8 Gy的X線放射源，對大鼠的成纖維細(xì)胞進(jìn)行單次X線照射，建立ADSCs與放射后成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)模型。分別設(shè)置單純放射后成纖維細(xì)胞為Fb2組，ADSCs與放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)為Fb3組，VEGF+放射后成纖維細(xì)胞為VEGF組，GM-CSF+放射后成纖維細(xì)胞為GM-CSF組。通過VEGF、GM-CSF、ADSCs分別干預(yù)放射損傷的成纖維細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡、增殖、細(xì)胞周期及Western-Blot檢測信號通路激活情況驗(yàn)證結(jié)果。結(jié)果：VEGF、GM-CSF、ADSCs分別作用于放射損傷的成纖維細(xì)胞，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，加快細(xì)胞周期由G2/M向G1/S進(jìn)展，與照射組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其程度強(qiáng)弱依次為ADSCs、GM-CSF、VEGF。VEGF組和GM-CSF組p-Akt蛋白和p-Erk蛋白表達(dá)較照射組上調(diào)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；相同濃度ADSCs、GM-CSF和VEGF促進(jìn)p-Akt蛋白和p-Erk蛋白表達(dá)，作用程度強(qiáng)弱依次為ADSCs、GM-CSF、VEGF，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K-Akt）通路和絲裂原激活蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）通路可能發(fā)揮著重要作用，比如在VEGF和GM-CSF作用于ADSCs治療放射損傷后成纖維細(xì)胞過程中。ADSCs修復(fù)放射損傷后成纖維細(xì)胞的效果明顯好于VEGF和GM-CSF單獨(dú)修復(fù)放射損傷后成纖維細(xì)胞，表明可能還有其他的潛在作用因子。結(jié)論：ADSCs、VEGF和GM-CSF干預(yù)的放射損傷后成纖維細(xì)胞主要通過增強(qiáng)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡及加快細(xì)胞周期由G2/M向G1/S發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]脂肪干細(xì)胞；成纖維細(xì)胞；輻射；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；血管內(nèi)皮生長因子

[中圖分類號]R622? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）08-0029-05

Study on the Mechanism of ADSCs， VEGF and GM-CSF in Repairing Radiation Damage of Fibroblasts

YIN Xiaofang1，QIN Ling1，YANG Chao3，YAN Haiping4，LI Yingli2，LI Min1

（1.Department of Nuclear Medicine of the 960th Hospital of the PLA，Jinan 250031，Shandong，China; 2.Department of Burn and Plastic Surgery， 960th Hospital of the People's Liberation Army，Jinan 250031，Shandong，China; 3.People's Liberation Army Navy Special Medical Center Plastic Surgery，Shanghai 200000，China; 4.Jinan Military Region 11th Retired Cadre Rest Center，Jinan 250000，Shandong，China）

Abstract： Objective? To discuss the effect mechanism of adipose-derived stem cells（ADSCs） on irradiation fibroblasts （Fb） through vascular endothelial growth factor （VEGF） and granulocyte-macrophage colony stimulating factor （GM-CSF）. Methods? Rats Fb were irradiated with a dose of 8 Gy X-ray source， and the co-culture of ADSCs and post-irradiated Fb was established. ADSCs were co-cultured with irradiation Fb as ADSC group， VEGF+ irradiation Fb was set as VEGF group， and GM-CSF+ after-radiation Fb was set as GM-CSF group. VEGF， GM-CSF and ADSCs were used to intervene in radiation-injured fibroblasts， respectively， and cell apoptosis， proliferation， cell cycle， and activation of signaling pathways by Western-Blot were analyzed to verify the results. Results? VEGF， GM-CSF and ADSCs intervened in radiation-injured fibroblasts， respectively， and the degrees of promoting cell proliferation， anti-apoptosis and accelerating cell cycle. Compared with the irradiation group， the differences were statistically significant（P＜0.05）， and its degree was ADSCs， GM-CSF， and VEGF in order. The expressions of p-Akt protein and p-Erk protein in the VEGF group and GM-CSF group were up-regulated compared with the irradiation group， and the difference was statistically significant （P＜0.01）. The expression of p-Erk protein and the degree of action were ADSCs， GM-CSF， and VEGF in order， and the difference was statistically significant （P＜0.01）. The PI3K-Akt （phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B） pathway and the MAPK （mitogen-activated protein kinase） pathway may play an important role， such as the role of VEGF and GM-CSF in the treatment of ADSCs on irradiation fibroblasts. The effect of VEGF and GM-CSF is much weaker than that of ADSCs， which implies that they may only be part of the cytokines during the progress of radiation-induced skin repairment. Conclusion? The radiation-injured fibroblasts treated with VEGF and GM-CSF demonstrated enhanced proliferation activity， reduced apoptosis， and accelerated cell cycle progressed from G2/M to G1/S.

Key words： adipose-derived stem cells; fibroblasts; radiation; Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; Vascular endothelial growth factor

放射性皮膚損傷是指皮膚受輻射線作用發(fā)生的皮膚損傷，臨床上近85%～95%的腫瘤患者因放射性治療出現(xiàn)不同程度的皮膚損傷[1]。臨床上，常見的治療有高壓氧、激光局部治療、局部藥物涂抹及外科手術(shù)等，但這些方式往往效果欠佳，易導(dǎo)致局部損傷加重，病變范圍擴(kuò)大。脂肪干細(xì)胞是一種具有自我更新及向多種組織細(xì)胞分化能力的多能干細(xì)胞，并可分泌多種細(xì)胞因子、生長因子，具有延緩輻射纖維化、促進(jìn)新生血管及肉芽組織形成等作用，在再生醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著重要作用[2]。

輻射損傷引起成纖維細(xì)胞功能障礙，而肌成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）的主要細(xì)胞，成纖維細(xì)胞增殖受抑制及ECM生成減少會導(dǎo)致傷口愈合不良。Haubner F等發(fā)現(xiàn)ADSCs可能通過分泌細(xì)胞因子和生長因子修復(fù)損傷后成纖維細(xì)胞及加速微血管密度的形成，同時不會造成成纖維細(xì)胞過度活化，形成皮膚瘢痕[3]。但是，目前的研究都是通過蛋白質(zhì)檢測篩選出可能影響修復(fù)的細(xì)胞因子，而沒有具體驗(yàn)證這些細(xì)胞因子是否對放射性皮膚損傷修復(fù)過程產(chǎn)生影響。

本研究發(fā)現(xiàn)ADSCs可能通過分泌血管內(nèi)皮生長因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（Endothelial cell growth factor，EGF）等多種因子影響放射后成纖維細(xì)胞的修復(fù)[4]。為了驗(yàn)證這些細(xì)胞因子是否在該過程中起作用，本實(shí)驗(yàn)選取了ADSCs、GM-CSF和VEGF，設(shè)置照射組以及ADSCs組、GM-CSF組、VEGF組分別與體外放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，來初步驗(yàn)證它們對放射后成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑：康寧DMEM培養(yǎng)液（低糖）、美國Gibco胎牛血清、美國Gibco胰蛋白酶（0.25%）、美國GibcoⅠ型膠原酶（0.1%）、美國Gibco Dispase酶；直線加速器（德國西門子）；5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo scientific，美國）；倒置顯微鏡（Olympus，日本）；熒光顯微鏡（Olympus，日本）；流式細(xì)胞儀（Mihenyi Biotec，德國）；麻醉劑戊巴比妥鈉（Sigma，美國）；Tunnel凋亡試劑盒（羅氏）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物：10只成年雄性SD大鼠，生長周齡為10周齡，體重300～400 g，由長海醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。本研究經(jīng)長海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 大鼠ADSCs及皮膚成纖維細(xì)胞的提取、培養(yǎng)與鑒定：SD大鼠經(jīng)頸椎脫臼處死后，于小燒杯中加入適量75%酒精浸泡5 min消毒，剖腹取腹股溝處脂肪組織，并用有齒鑷和顯微剪刀將筋膜、淋巴組織及小血管剔除干凈，然后用適量含1%雙抗的磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer solution，PBS）溶液沖洗3次。用無菌眼科剪將脂肪組織剪碎至糊狀后放置于裝有適量PBS的培養(yǎng)皿中，然后加入約等體積的含0.1%膠原酶I，搖晃均勻后，置于37℃溫箱中1 h，每間隔5 min手動搖勻一次。于干凈離心管中放入消化后的脂肪組織液，取等量含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基加入至消化后的脂肪組織液，以結(jié)束膠原酶的繼續(xù)消化作用，然后放入離心機(jī)中，以1 000 r/min離心10 min，倒掉上層脂肪后，余液體用75μm細(xì)胞濾網(wǎng)濾去雜質(zhì)后置于無菌50 ml離心管，繼續(xù)以1 000 r/min，離心5 min，離心后倒掉表層的淡紅色液體，切記不要倒掉底部的沉淀，然后加入含胎牛血清的低糖DMEM重懸細(xì)胞液。將細(xì)胞懸液加入至無菌培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)于條件為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，每隔48 h更換一次培養(yǎng)基，每次倒掉培養(yǎng)基后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)培養(yǎng)瓶的瓶底單層細(xì)胞豐度達(dá)到80%以上時，就可以進(jìn)行胰酶消化后的傳代操作。取3代細(xì)胞活力良好的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面CD分子流氏鑒定、體外成脂誘導(dǎo)分化及成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化。同上步驟取大鼠背部皮下真皮組織消化離心重懸處理后傳代培養(yǎng)，取第3代成纖維細(xì)胞切片做波形蛋白（Vimention）免疫組化。具體實(shí)驗(yàn)步驟及細(xì)胞表面CD分子、蛋白及誘導(dǎo)分化鑒定結(jié)果參考課題組前期方法[5]。

1.4 成纖維細(xì)胞放射模型的建立：取第3代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，加入1～2 ml 0.25%胰蛋白酶消化5 min后，加入等量含胎牛血清低糖DMEM的培養(yǎng)基制成混合細(xì)胞液。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，以1.5×105個/孔均勻吸取放入6孔板底部，條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，然后將6孔板置于直線加速器平臺，調(diào)整培養(yǎng)板位置使光源投射區(qū)中心正對培養(yǎng)板，為使放射能量集中于培養(yǎng)板上，可加蓋一塊放射板。直線加速器設(shè)置參數(shù)能量為6 MV，距離100 cm，劑量8 Gy。停止照射后立即將成纖維細(xì)胞與ADSCs共培養(yǎng)。具體實(shí)驗(yàn)步驟參考課題組前期方法[6]。

1.5 共培養(yǎng)模型及分組：共培養(yǎng)模型參考前期實(shí)驗(yàn)組建立的模型。取第3代成纖維細(xì)胞和ADSCs，放射后成纖維細(xì)胞為Fb2組、ADSCs共培養(yǎng)干預(yù)的放射后成纖維細(xì)胞為Fb3組、VEGF+放射后成纖維細(xì)胞為VEGF組、GM-CSF+放射后成纖維細(xì)胞為GM-CSF組。

1.6 CCK-8法檢測Fb細(xì)胞增殖活性：取第3代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù)，均勻鋪至24孔板中（3.5×104個細(xì)胞/孔），F(xiàn)b2組、GM-CSF組和VEGF組的成纖維細(xì)胞采用普通24孔板，24孔Transwell板下室內(nèi)放置Fb3組的成纖維細(xì)胞。8 Gy X線照射每組貼壁后的成纖維細(xì)胞，照射后將取3×104個ADSCs接種在Transwell培養(yǎng)皿可取出的上室，GM-CSF組分別加入GM-CSF濃度分別為25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的培養(yǎng)基，VEGF組分別加入VEGF濃度為10 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml的培養(yǎng)基，各組設(shè)置6個復(fù)孔，于37℃、5%CO2條件的孵箱共培養(yǎng)。分別于6 h、12 h、24 h和48 h下室及培養(yǎng)孔中加入含40～50 μl CCK-8的培養(yǎng)基，于37℃孵箱培養(yǎng)0.5～4 h，用光度儀檢測450 nm處OD值，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測Fb細(xì)胞凋亡和周期：取第3代成纖維細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，以每孔1.5×105個細(xì)胞鋪至6孔板中，F(xiàn)b2組、GM-CSF組和VEGF組成纖維細(xì)胞鋪在普通6孔板中，Transwell 6孔板的下室中放置Fb3組成纖維細(xì)胞。8 Gy X線照射各組貼壁細(xì)胞，照射完后ADSCs組成纖維細(xì)胞置于接種ADSCs的上室（1.0×105個細(xì)胞/孔），GM-CSF組和VEGF組分別加入上述濃度VEGF和GM-CSF培養(yǎng)基，37℃孵箱共培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，各組貼壁細(xì)胞經(jīng)適量胰酶消化處理，Buffer重懸細(xì)胞后加入5 μl細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-APC）在室溫條件下培養(yǎng)30 min，然后加入5 μl 7-AAD（7-氨基放線菌素）復(fù)染，然后用流氏細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。檢測細(xì)胞周期時，用適量PBS將消化后的細(xì)胞洗2遍，并加入100 μl PBS，用-20℃的PBS將無水乙醇稀釋至75%，室溫放置約6 h。檢測前離心機(jī)以轉(zhuǎn)速為1 500 r/min離心，倒掉上層乙醇后用適量PBS沖洗，加入熒光染料PI（碘化丙啶）后室溫培養(yǎng)30 min上檢測。

1.8 Western-blot檢測通路變化

1.8.1 蛋白的抽提：各組成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉培養(yǎng)基后，用適量PBS沖洗，六孔板每孔加入100～150μl 4℃預(yù)冷蛋白裂解液?；厥盏鞍琢呀庖河贓P管，冰上放置30 min，4℃條件下1 200 r/min離心機(jī)離心15 min，留取上清液。采用BCA蛋白定量法，于567 nm波長的吸光光度儀測定OD值，確定蛋白濃度，用Loading Buffer調(diào)整樣品濃度一致。

1.8.2 電泳和轉(zhuǎn)膜：配制凝膠固定后，加入電泳液至電泳槽中。用生理鹽水清洗上樣孔后，分別加入等量marker和樣品。電壓調(diào)至60 V，待溴酚藍(lán)至分離膠后更換100 V電壓跑至底部。剪取適量凝膠及PVDF膜，放入甲醛溶液中30 s。取出凝膠及PVDF膜放入轉(zhuǎn)膜電泳槽中，加入適量轉(zhuǎn)膜液，周圍放置適量冰塊，以200 mA電流轉(zhuǎn)膜90 min。

1.8.3 免疫和顯影：取出電泳后的PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入按說明書方法稀釋后的一抗，4℃搖床過夜。第2天用TBST溶液清洗PVDF膜3次，每次持續(xù)10 min。然后加入按說明書方法稀釋后的二抗孵育2 h，TBST溶液清洗PVDF膜3次，每次持續(xù)10 min。拍照記錄確定膜在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中的坐標(biāo)后，將膜置于HRP底物過氧化物溶液與HRP魯米諾等體積混合液中，30 s后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：Western-blot用Quantity One4.64計(jì)算條帶的灰度值進(jìn)行計(jì)算，使用Excel軟件匯總統(tǒng)計(jì)CCK-8、凋亡等數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，所有數(shù)據(jù)用Mean±SD表示。所得的值采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用多組單因素方差分析處理數(shù)據(jù)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖形采用GraphPad Prism 6.0制作。

2? 結(jié)果

2.1 大鼠ADSCs與成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定：ADSCs貼壁后，倒置顯微鏡下觀察呈多角形，細(xì)胞核呈圓形。培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后細(xì)胞變成長梭形，細(xì)胞核變?yōu)闄E圓形。ADSCs表面標(biāo)記流式檢測結(jié)果CD29、CD44、CD31和CD45陽性率分別為97.4%、96.9%、4.37%和0.61%。第3代ADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后胞漿內(nèi)可見脂滴，油紅O染色呈紅色；經(jīng)成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞由長梭形變成多角形，可見鈣鹽結(jié)晶沉積及礦化結(jié)節(jié)，誘導(dǎo)15 d后經(jīng)AKP及茜素紅染色呈陽性。另提取的成纖維細(xì)胞外形呈長梭形或多角形，和ADSCs形態(tài)類似；同時細(xì)胞可檢測出高表達(dá)的Vimentin蛋白。見圖1。

2.2 細(xì)胞增殖力、凋亡和周期結(jié)果：GM-CSF組成纖維細(xì)胞較Fb2組成纖維細(xì)胞增殖快（P＜0.05）。25 ng/ml、50 ng/ml和100 ng/ml濃度GM-CSF處理后增殖程度遞增。VEGF組成纖維細(xì)胞增殖程度較Fb2組快（P＜0.05），10 ng/ml、25 ng/ml和50 ng/ml濃度的VEGF處理后增殖程度遞增，有劑量依賴關(guān)系。50 ng/ml GM-CSF組較50 ng/mlVEGF組Fb增殖快（P＜0.05）。50 ng/ml GM-CSF組成纖維細(xì)胞抗凋亡作用弱于Fb3組（P＜0.01），較Fb2組強(qiáng)（P＜0.01）；50 ng/ml VEGF組成纖維細(xì)胞抑制凋亡作用弱于Fb3組（P＜0.01），較Fb2組強(qiáng)；50 ng/ml GM-CSF組抗凋亡作用強(qiáng)于50 ng/ml VEGF組（P＜0.01）。50 ng/ml GM-CSF組成纖維細(xì)胞處于G2期細(xì)胞數(shù)明顯少于Fb3組P＜0.05）；50 ng/ml GM-CSF組成纖維細(xì)胞處于G2期細(xì)胞數(shù)多于Fb2組（P＜0.01）；50 ng/ml VEGF組成纖維細(xì)胞較Fb3組G2期細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）；50 ng/ml VEGF組成纖維細(xì)胞處于G2期細(xì)胞數(shù)多于Fb2組（P＜0.05）；50 ng/ml GM-CSF組成纖維細(xì)胞處于G2期細(xì)胞數(shù)多于50 ng/ml VEGF組處于G2期細(xì)胞數(shù)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1、圖2～3。

2.3 VEGF和GM-CSF作用通路檢測：結(jié)果顯示，50 ng/ml GM-CSF組的p-Erk蛋白表達(dá)高于Fb2組，50 ng/ml VEGF組的p-Erk蛋白表達(dá)高于Fb2組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；50 ng/ml GM-CSF組的p-Akt蛋白表達(dá)多于Fb2組，50 ng/ml VEGF組的p-Akt蛋白表達(dá)高于Fb2組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。ADSCs、GM-CSF和VEGF對信號通路的激活程度ADSCs＞GM-CSF＞VEGF。見圖4。

3? 討論

放射性皮膚損傷是腫瘤患者接受放射治療后常見的皮膚并發(fā)癥，近年來，隨著惡性腫瘤術(shù)后放療的普及、外照射和放射性粒子內(nèi)照射治療逐步成為治療規(guī)范，這使得放射性皮膚損傷成為臨床常見病和多發(fā)病之一[7]。放射性皮膚損傷傳統(tǒng)治療方法往往難以達(dá)到理想的效果，主要是因?yàn)殚L期以來放射性皮膚損傷的預(yù)防和管理通?；趥€人經(jīng)驗(yàn)，缺乏高質(zhì)量的大樣本研究和統(tǒng)一的評估標(biāo)準(zhǔn)，各研究結(jié)果往往相互矛盾，缺乏科學(xué)證據(jù)[8]。成纖維細(xì)胞在修復(fù)放射性皮膚損傷過程中發(fā)揮重要作用，輻射損傷刺激后，成纖維細(xì)胞一方面在趨化因子的作用下募集至創(chuàng)面分裂增殖，分泌大量膠原纖維及ECM填補(bǔ)創(chuàng)面，與新生毛細(xì)血管及炎細(xì)胞組成肉芽組織，保護(hù)創(chuàng)面。另一方面，成纖維細(xì)胞在遷徙運(yùn)動過程中分化為肌成纖維細(xì)胞，具有收縮傷口效應(yīng)，減小創(chuàng)面面積[9]。

ADSCs目前已廣泛應(yīng)用于修復(fù)各種難治性創(chuàng)面、燒傷燙傷及放射性皮膚損傷等皮膚創(chuàng)面。ADSCs被認(rèn)為是修復(fù)皮膚損傷及重建皮膚損傷組織細(xì)胞的來源，將來在大面積皮膚缺損修復(fù)方面具有明顯優(yōu)勢。ADSCs可通過分泌多種細(xì)胞因子、生長因子加速血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖和新生血管形成，還可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成和膠原生成，對肉芽組織基質(zhì)形成、創(chuàng)面再上皮化及瘢痕組織的形成將產(chǎn)生重要的作用[10]。GM-CSF是調(diào)節(jié)急性皮膚反應(yīng)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子，GM-CSF可促進(jìn)巨噬細(xì)胞合成及分泌多種細(xì)胞因子及生長因子，促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，加速創(chuàng)面再上皮化及新生血管形成的作用[11]。劉宏東等在評估GM-CSF治療深Ⅱ度燒傷時，發(fā)現(xiàn)GM-CSF可提高創(chuàng)面組織中多種生長因子的表達(dá)水平，加速創(chuàng)面修復(fù)[12]。VEGF主要由成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化、新生血管生成的作用，在皮膚創(chuàng)面修復(fù)過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)VEGF可通過抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)肉芽組織生長及成纖維細(xì)胞增殖等方面促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合[13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VEGF與放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，其促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡以及加快細(xì)胞周期方面弱于GM-CSF與放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組和ADSCs與放射后成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)組。進(jìn)一步說明，ADSCs修復(fù)放射后成纖維細(xì)胞是多因子共同作用的結(jié)果。VEGF與GM-CSF能直接或間接作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)放射后成纖維細(xì)胞的修復(fù)；還可通過刺激Erk的磷酸化狀態(tài)，激活MAPK細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期使處于G2期細(xì)胞數(shù)增多，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化。VEGF和GM-CSF干預(yù)放射后成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)、凋亡減少、并促進(jìn)細(xì)胞周期由G2/M向G1/S發(fā)展。本文初步研究了GM-CSF和VEGF對通路的激活情況，50 ng/ml VEGF組和GM-CSF組細(xì)胞的p-Akt和p-Erk較照射組明顯上調(diào)，這說明VEGF和GM-CSF在ADSCs修復(fù)放射后成纖維細(xì)胞過程中可能通過活化PI3K-Akt通路和MAPK通路發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt信號通路和MAPK通路可被VEGF等各種細(xì)胞因子、生長因子激活，通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的凋亡，誘導(dǎo)新生血管形成，從而修復(fù)皮膚損傷[14]。綜上所述，ADSCs、VEGF與GM-CSF可有效促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡以及加速細(xì)胞周期，促進(jìn)放射后成纖維細(xì)胞修復(fù)，為放射性皮膚損傷提供替代治療方法。由于實(shí)驗(yàn)中VEGF和GM-CSF細(xì)胞因子用量遠(yuǎn)大于ADSC的分泌量，且兩組Akt和Erk磷酸化效應(yīng)弱于ADSCs共培養(yǎng)組。所以VEGF和GM-CSF可能只是參與放射性損傷修復(fù)細(xì)胞因子中的一部分。本次實(shí)驗(yàn)不足之處在于沒有設(shè)置輻射后ADSCs對照組，無法直接證明VEGF和GM-CSF是ADSCs分泌。在下一步實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上可以增加這一對照組以及逐步驗(yàn)證ADSCs分泌的其他細(xì)胞因子在修復(fù)放射后成纖維細(xì)胞的作用，探討ADSCs修復(fù)放射性皮膚損傷的各種潛在機(jī)制。

ADSCs、VEGF與GM-CSF在治療放射性皮膚損傷時由于穩(wěn)定性較差及半衰期較短，直接靜脈或局部注射會影響其活性及功能，且靜脈注射脂肪干細(xì)胞大部分會駐留在肺、肝、脾等臟器中，無法有效地將干細(xì)胞傳遞至損傷部位[15]。所以，合理利用載體穩(wěn)定細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)及提高干細(xì)胞的利用率，充分發(fā)揮它的生理功能是未來臨床研究的重點(diǎn)。最新研究表明，各種新興納米粒子支架材料已經(jīng)廣泛用做ADSCs、VEGF等的載體，可為ADSCs的分化和增殖提供適合的微環(huán)境，以及穩(wěn)定細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)。已有研究表明，載VEGF殼聚糖納米粒子能夠使VEGF持久釋放，可以有效的治療大鼠放射性皮膚損傷[16]。體外釋藥研究結(jié)果表明，負(fù)載VEGF的溫敏凝膠可以持續(xù)釋放生長因子，促進(jìn)大鼠全層皮膚創(chuàng)面愈合[17]。已有研究表明，磁靶向聚多巴胺修飾的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞不僅可以維持間充質(zhì)干細(xì)胞的各種生理功能，還可以定向歸巢至靶位修復(fù)損傷[18]。

綜上所述，ADSCs、VEGF與GM-CSF與載體或支架的新興結(jié)合方式將會是未來治療大面積皮膚創(chuàng)面的有效治療途徑，且不存在倫理學(xué)爭議，未來在臨床會成為更好的替代治療途徑。

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[收稿日期]2022-06-09

本文引用格式：尹小芳，秦嶺，楊超，等.ADSCs、VEGF和GM-CSF修復(fù)成纖維細(xì)胞放射性損傷的機(jī)制研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2023，32（8）：29-34.