熒光定量PCR法在乙型肝炎病毒檢測(cè)中的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)

張黎

【摘要】? 目的? ? 分析熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（FQ-PCR）應(yīng)用在乙型肝炎病毒（HBV）檢測(cè)中的準(zhǔn)確性。方法? ? 選擇2020年1月—2021年6月接診的100例HBV攜帶者，均行FQ-PCR、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)，對(duì)比二者檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果? ? 100例HBV攜帶者中“大三陽(yáng)（模式1）”共24例，HBV-DNA含量平均為（8.24±1.12）copy/mL，陽(yáng)性率為95.83%（23/24），均顯著高于其他6種模式（P<0.05）；100例HBV攜帶者中“小三陽(yáng)（模式2）”共31例，HBV-DNA陽(yáng)性率為83.87%（26/31），均顯著高于3，4，5，6，7模式（P<0.05）；而其他模式在HBV-DNA陽(yáng)性率及含量方面均無(wú)明顯差異（P>0.05）。結(jié)論? ? 與ELISA相比較，F(xiàn)Q-PCR更能定量反映HBV復(fù)制、感染狀況，有助于早期確診乙型病毒性肝炎，以及判斷傳染性質(zhì)與監(jiān)測(cè)病情，值得推廣。

【關(guān)鍵詞】? 熒光定量PCR法；乙型肝炎病毒；準(zhǔn)確性

中圖分類號(hào)：R446.1? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-1721（2023）11-0098-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.11.033

乙型病毒性肝炎是臨床常見傳染性疾病，兼具感染率高、傳播途徑復(fù)雜、流行面廣等特點(diǎn)[1]。主要因乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）所致，若長(zhǎng)期攜帶HBV，容易導(dǎo)致肝臟炎性損傷，甚至誘發(fā)肝硬化、肝衰竭、肝細(xì)胞癌等疾病。相關(guān)報(bào)道指出[2]，目前我國(guó)乙肝患者數(shù)量居全世界首位，極大地威脅著國(guó)民健康，故需重視乙肝臨床診療工作。近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)、免疫學(xué)的飛速發(fā)展，可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（polymerase chain reaction，PCR）、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等檢測(cè)HBV標(biāo)志物。且有報(bào)道指出[3]，ELISA通過測(cè)驗(yàn)HBV表達(dá)蛋白的抗體、抗原，能夠診斷乙肝；但是容易受到HBV翻譯、轉(zhuǎn)錄功能減弱等的干擾，出現(xiàn)假陰性，導(dǎo)致漏診，影響后續(xù)治療及預(yù)后。而PCR作為新型檢驗(yàn)技術(shù)，通過熒光標(biāo)記處理HBV-DNA，亦能檢驗(yàn)HBV- DNA的翻譯及轉(zhuǎn)錄情況，有助于提高檢驗(yàn)準(zhǔn)確性。本文就熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）在HBV檢測(cè)中的準(zhǔn)確性展開分析，報(bào)道如下。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 一般資料? ? 選擇2020年1月—2021年6月接診的100例HBV攜帶者，其中男68例，女32例，年齡23～58歲，平均年齡（41.5±10.8）歲，體重49～77 kg，平均（62.5±4.5）kg。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）在就診中發(fā)現(xiàn)HBV；（2）檢查依從性好；（3）知情同意，自愿參加。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）惡性腫瘤疾病者；（2）嚴(yán)重內(nèi)科疾病者；（3）凝血功能障礙者；（4）資料不完善者；（5）溝通、認(rèn)知、精神障礙者；（6）免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2? ? 方法? ? 全部入組者均行FQ-PCR、ELISA檢測(cè)。（1）FQ-PCR：取晨起3 mL肘靜脈血，采集血液樣本前均空腹8～10 h，將其置入真空惰性分離膠促凝管，離心處理（時(shí)間10 min，轉(zhuǎn)速3 500 r/min），制備血漿標(biāo)本，之后通過熒光定量分析儀（儀器廠家：杭州安譽(yù)科技有限公司；儀器型號(hào)：AGS4800型）+熒光定量PCR診斷試劑盒（購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）檢測(cè)HBV-DNA。（2）ELISA：取晨起3 mL肘靜脈血，采集血液樣本前均空腹8～10 h，之后將血液樣本放置在4 ℃冰箱，時(shí)間2 h，再離心處理（時(shí)間10 min，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，離心半徑10 cm），將上層血清置入無(wú)菌試管備測(cè)，檢測(cè)乙肝標(biāo)志物時(shí)采用全自動(dòng)酶免儀（儀器廠家：深圳市愛康生物科技有限公司；儀器型號(hào)：Uranus AE150型）+ELISA試劑盒（北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司），包括乙肝表面抗體（HBsAb）、乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗體（HBeAb）、乙肝核心抗體（HBcAb），于450 nm位置讀取酶標(biāo)儀吸光度值，得到診斷結(jié)果。

1.3? ? 觀察指標(biāo)? ? 記錄乙肝血清學(xué)標(biāo)志物（HBsAb、HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb）結(jié)果，再將其陽(yáng)性結(jié)果劃分成7種模式，其中模式1為“大三陽(yáng)”（HBsAg、HBeAg、HBcAb），模式2為“小三陽(yáng)”（HBsAg、HBeAb、HBcAb），其他模式分別是：模式3（HBsAg、 HBeAg）、模式4（HBsAb、HBeAb、HBcAb）、模式5（HBsAb、HBeAb）、模式6（HBsAb、HBcAb）、模式7（HBeAb、HBcAb）。FQ-PCR檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為HBV-DNA>1.0×102 IU/mL，ELISA檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為吸光度值>1[4]。

1.4? ? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? ? 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? ? 結(jié)果

100例HBV攜帶者中“大三陽(yáng)（模式1）”共24例，HBV-DNA含量平均為（8.24±1.12）copy/mL，陽(yáng)性率為95.83%（23/24），均顯著高于其他6項(xiàng)模式（P<0.05）；100例HBV攜帶者中“小三陽(yáng)（模式2）”共31例，HBV-DNA陽(yáng)性率為83.87%（26/31），均顯著高于3，4，5，6，7模式（P<0.05）；而其他模式在HBV-DNA陽(yáng)性率及含量方面均無(wú)明顯差異（P>0.05），見表1。

3? ? 討論

乙肝是傳染率高、起病緩慢、傳播途徑廣的病毒性肝炎疾病。相關(guān)報(bào)道指出[5]，當(dāng)前我國(guó)HBV攜帶者高達(dá)9 300萬(wàn)人，且HBV感染呈現(xiàn)世界性流行。人類因含HBV血液、體液經(jīng)破損黏膜、皮膚進(jìn)入機(jī)體而感染，且傳播途徑包括血制品傳播、母嬰傳播[6-7]。我國(guó)母嬰傳播概率較高，約40%～50%的HBV感染人群因母嬰傳播而罹患乙肝。90年代初我國(guó)將兒童普種乙肝疫苗作為控制乙肝流行的重要策略[8]，通過幾十年的努力，當(dāng)前屬于乙肝中度流行國(guó)家。盡管如此，由于我國(guó)是人口大國(guó)，所以當(dāng)前HBsAg攜帶者仍較多，使得乙肝成為重要的公共衛(wèi)生問題之一。臨床強(qiáng)調(diào)對(duì)乙肝進(jìn)行早診早治，以阻止病情惡化，降低病死率。但是由于臨床廣泛應(yīng)用抗病毒藥物，使得HBV變異株數(shù)量顯著增加，明顯提高了傳統(tǒng)HBV血清學(xué)檢測(cè)難度[9]，導(dǎo)致檢測(cè)可重復(fù)性、準(zhǔn)確性等均出現(xiàn)一定缺陷，尚需完善檢測(cè)方法。

當(dāng)前臨床可以通過下列方法診斷HBV感染。（1）HBV基因產(chǎn)物：除通過免疫學(xué)方法測(cè)定HBsAg、HBeAg等，還可依據(jù)免疫組織化學(xué)技術(shù)（兼具敏感性高、功能與形態(tài)相結(jié)合、特異性好、定位準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)）、肝臟組織形態(tài)學(xué)變化等測(cè)定HBV基因產(chǎn)物，進(jìn)而明確病毒性肝炎是否由HBV感染所致。（2）影像學(xué)：如核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、計(jì)算機(jī)X線斷層掃描（computed tomography，CT）以及超聲等檢查脾臟、膽囊以及肝臟等，從而評(píng)估有無(wú)肝硬化病變、慢性乙肝發(fā)生及進(jìn)展、占位性病變性質(zhì)等。（3）病理學(xué)：通過肝臟穿刺活檢能夠更為準(zhǔn)確、早期觀察肝組織細(xì)微病變，評(píng)估HBV患者肝臟狀況，從而判斷預(yù)后情況、藥物療效等。（4）HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）：HBV cccDNA被徹底清除后意味著慢性乙肝患者被治愈。當(dāng)前HBV cccDNA技術(shù)進(jìn)展迅猛，且以選擇性FQ-PCR發(fā)展較快，其能用于評(píng)估肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA水平，從而反映免疫功能對(duì)HBV的控制情況，從而指導(dǎo)停藥時(shí)機(jī)。不過若想檢測(cè)HBV cccDNA，尚需肝組織活檢，具有一定的創(chuàng)傷性，患者接受度不高，且需進(jìn)一步明確檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，故推廣難度較大。

本次研究表明，F(xiàn)Q-PCR檢測(cè)HBV有較好效果。ELISA是檢測(cè)HBV的常用方法，通過檢測(cè)血清中特異性抗原與抗體，能夠評(píng)估有無(wú)HBV感染，加之靈敏度高、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單，所以得到臨床推廣。然而實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)該方法僅能反映HBV感染免疫應(yīng)答狀態(tài)，無(wú)法定量分析HBV感染程度以及含量等[10]，所以存在一定的局限性；同時(shí)檢測(cè)結(jié)果也易受到標(biāo)本保存、洗板情況、加樣時(shí)有無(wú)濺出、血清分離、孵育方式等因素的影響；另外，ELISA需要使用特殊設(shè)備，加之難以評(píng)估病毒量及感染程度間關(guān)系、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，不適用于急診初篩、門診與無(wú)償獻(xiàn)血。

陳春妍[11]、謝玉娜[12]的研究均指出，F(xiàn)Q-PCR能夠有效檢測(cè)HBV。本次研究亦發(fā)現(xiàn)FQ-PCR檢測(cè)準(zhǔn)確率較高。FQ-PCR兼具DNA探針雜交、PCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，通過實(shí)施閉管、熒光技術(shù)檢測(cè)，能夠直接探測(cè)PCR過程中熒光信號(hào)，進(jìn)而定量、定性評(píng)估HBV感染程度，反映其傳染性與復(fù)制狀況，有助于醫(yī)師準(zhǔn)確評(píng)估病情。另外，HBsAg是區(qū)分急性乙肝與健康攜帶者的重要指標(biāo)，而HBeAg是評(píng)估血清有無(wú)傳染性的重要指標(biāo)，若是受檢者表現(xiàn)為大三陽(yáng)，提示HBV-DNA復(fù)制率高且傳染性強(qiáng)。本研究亦顯示，相比大三陽(yáng)（模式1），小三陽(yáng)（模式2）的陽(yáng)性率較低。主要是小三陽(yáng)患者HBV復(fù)制弱、傳染性低，不過仍有HBV-DNA復(fù)制，故僅憑血清學(xué)難以評(píng)定結(jié)果，尚需檢測(cè)HBV-DNA，從而監(jiān)測(cè)病情，以便及時(shí)對(duì)癥處理。值得注意的是，F(xiàn)Q-PCR也有局限性，例如無(wú)法對(duì)病原體入侵后機(jī)體抗體如何應(yīng)答作出反映，也無(wú)法測(cè)定病原體數(shù)量，所以暫時(shí)不能取代血清學(xué)標(biāo)志物；不過其檢測(cè)結(jié)果敏感度高、可靠性強(qiáng)，便于醫(yī)師評(píng)估HBV感染狀態(tài)以及病毒DNA復(fù)制情況，能夠在早期診斷、評(píng)估乙肝傳染性，監(jiān)測(cè)治療情況等方面提供參考依據(jù)，所以臨床應(yīng)用價(jià)值仍較高。

綜上所述，與ELISA相比較，F(xiàn)Q-PCR更能定量反映HBV復(fù)制、感染狀況，有助于早期確診乙型病毒性肝炎，以及判斷傳染性質(zhì)與監(jiān)測(cè)病情，值得推廣。

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（收稿日期：2023-01-22）