啟膈散增加食管癌對(duì)順鉑的敏感性與LncRNA MEG3的關(guān)系研究*

王靜,王美樂,尹素改,馮書營,陳玉龍,江華,李亞蘭,李姝璇

河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450046

食管癌(esophageal cancer,EC)具有極強(qiáng)的地域性,在2020年惡性腫瘤中發(fā)病率排名第七位,總體死亡率排名第六位,中國屬于高發(fā)病率、高死亡率的國家之一[1-3]。食管癌常見的病理類型主要有鱗癌和腺癌,我國95%以上為鱗癌[4]。食管癌的發(fā)病年齡多在40歲以上,多數(shù)表現(xiàn)為間斷性或進(jìn)行性吞咽梗阻等特異性癥狀[5-6]。手術(shù)和化療是常用的治療手段,但化療的多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)已經(jīng)成為腫瘤切除、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)[7]。

食管癌屬于中醫(yī)“噎膈”范疇,病機(jī)包括氣郁、痰阻、血瘀、氣血津虧。其中,痰氣交阻是其發(fā)生的主要病機(jī),痰氣交阻證是其最常見證候之一。朱丹溪言:“痰之為物,在人身隨氣機(jī)升降,無處不到”,氣機(jī)不暢,氣郁生痰,痰氣互阻,久而致瘀是食管癌發(fā)病的途徑[8]。啟膈散具有潤燥解郁、化痰降逆之功效,出自清代程國彭的《醫(yī)學(xué)心悟》,“通噎膈,開關(guān)之劑,屢效”[9]。啟膈散是目前常用于治療食管癌的經(jīng)典方劑,在臨床治療中取得了良好效果。研究發(fā)現(xiàn),啟膈散可誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡并可增加食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,但具體機(jī)制仍需深入研究[10-11]。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,LncRNA)是目前腫瘤耐藥性機(jī)制研究的熱點(diǎn)。母系表達(dá)基因3 (maternally expressed gene 3,MEG3)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制作用的LncRNA。另外,在鼻咽癌的研究中,MEG3充當(dāng)腫瘤抑制因子,增加人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene,PTEN)表達(dá)來促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的自噬和凋亡[12]。但在食管癌中,MEG3的表達(dá)是否參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后與轉(zhuǎn)歸及啟膈散是否通過MEG3干預(yù)食管癌細(xì)胞增殖并增加食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,目前尚不清楚。

因此,本研究從啟膈散對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響為切入點(diǎn),研究啟膈散增加順鉑敏感性與LncRNA MEG3的關(guān)系及其機(jī)制,為開發(fā)治療食管癌的中藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),為尋找抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)提供支撐。

1 材料

1.1 細(xì)胞人食管癌EC9706細(xì)胞株由河南中醫(yī)藥大學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn)中心饋贈(zèng)。

1.2 藥物與試劑順鉑、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、5×蛋白上樣緩沖液、彩虹245廣譜蛋白Marker、ECL Plus超敏化學(xué)發(fā)光液(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):D8810、CA1020、PC0020、R0010、P0100、P1040、PR1920、PE0010);TRIzol試劑(美國ambion公司,批號(hào):15596);TB Green Premix Ex Taq、Primescript RT Master Mix(日本TaKaRa公司,貨號(hào):RR420A、RR036A);SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司,批號(hào):G2037-50T);PTEN抗體、GAPDH抗體、HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗(美國proteintech公司,批號(hào):22034-1-AP,10494-1-AP,SA00001-2)。

1.3 儀器超凈工作臺(tái)(北京世安科林凈化技術(shù)有限公司,型號(hào):SIX-70);二氧化碳培養(yǎng)箱、PCR儀(美國賽默飛公司,型號(hào):371、Quanti Studio 7 Flex);倒置顯微鏡(日本Olympus公司,型號(hào):CKX41);酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司,型號(hào):Cytation 5);流式細(xì)胞儀(美國BD Accuri公司,型號(hào):Accuri C6 Plus);蛋白通用電泳儀(美國BIO-RAD公司,型號(hào):Power Pac Universal 1645070)。

2 方法

2.1 藥物制備啟膈散藥物劑量比例為沙參丹參茯苓川貝母(去心)郁金砂仁殼杵頭糠=6623111,采取乙酸乙酯法提取,濃縮干燥,冷藏備用。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞活性取對(duì)數(shù)生長期的EC9706細(xì)胞,以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,吸走舊培養(yǎng)液,加入不同劑量的啟膈散及相應(yīng)濃度的啟膈散聯(lián)合2 mg·L-1順鉑,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。加藥48 h后吸出舊液,按 91 比例用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋MTT儲(chǔ)存液,MTT終濃度為0.5 g·L-1,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,加入 DMSO 150 μL,酶標(biāo)儀570 nm下檢測吸光度(absorbance,A)值,計(jì)算各組抑制率E值,并用金氏Q值公式法評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同作用,選取適當(dāng)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

E=(1-A藥物組/A對(duì)照組)×100%

Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)

Q>1.15表示聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用,Q為0.85～1.15表示聯(lián)合用藥具有相加作用,Q<0.85表示聯(lián)合用藥具有拮抗作用(Ea+b:啟膈散與順鉑聯(lián)合用藥組的抑制率;Ea:啟膈散組的抑制率;Eb:順鉑組的抑制率)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長期的EC9706細(xì)胞,以3×105個(gè)/孔接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h,加藥培養(yǎng)48 h,收集培養(yǎng)液,加入不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞,用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次,加入緩沖液500 μL重懸細(xì)胞,每管加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL,室溫避光孵育5 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

2.3 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)提取細(xì)胞總蛋白,在冰上裂解提取各組總蛋白。BCA法測定樣本蛋白濃度。加入5×蛋白上樣緩沖液按比例混合樣品,100 ℃加熱10 min變性,進(jìn)行聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,采用Tris堿緩沖液配置的5%牛奶封閉2 h,添加一抗PTEN(稀釋比例12 000)、GAPDH(稀釋比例12 500),4 ℃冰箱孵育過夜,次日用TBST洗膜3次,每次10 min。添加二抗(稀釋比例15 000)孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10 min;加入ECL超敏發(fā)光液,凝膠成像儀中曝光各組蛋白條帶,用Image J統(tǒng)計(jì)條帶灰度值。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR,RT-PCR)加藥48 h后,TRIzol法提取各組細(xì)胞樣品總RNA,按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,逆轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃反應(yīng)15 min,85 ℃ 反應(yīng)5 s。配制反轉(zhuǎn)錄體系總體積20 μL進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,55 ℃退火45 s,共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參,引物序列見表1,利用2-ΔΔCt公式計(jì)算各個(gè)樣品中目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因引物序列

2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移劃痕實(shí)驗(yàn):細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),將對(duì)數(shù)生長期EC9706細(xì)胞接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞融合度達(dá)到90%左右,用 200 μL 的槍頭沿直尺畫水平線的垂直線,加入PBS緩沖液去除劃掉的細(xì)胞,輕輕清洗3次,以免沖散單層貼壁細(xì)胞。按上述實(shí)驗(yàn)分組加藥處理細(xì)胞,均使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),從換為含對(duì)應(yīng)藥物的無血清培養(yǎng)基起開始計(jì)算,分別于0 h、48 h拍照觀察,每次拍照觀察前,應(yīng)再次清洗細(xì)胞,去除凋亡的細(xì)胞。以Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析劃痕面積,計(jì)算細(xì)胞遷移率。Transwell實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞饑餓培養(yǎng)24 h,在各組Transwell小室的上室中加入濃度為2×105mL-1細(xì)胞懸液0.3 mL,下室加入0.7 mL含10% FBS的完全培養(yǎng)基或含對(duì)應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h后甲醛固定,結(jié)晶紫染色后PBS洗滌,晾干,顯微鏡下計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)。

細(xì)胞遷移率=(初始空白面積-某時(shí)間點(diǎn)空白面積)/初始空白面積×100%

3 結(jié)果

3.1 藥物對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組比較,當(dāng)啟隔散濃度為12.5 mg·L-1時(shí),可促進(jìn)EC9706細(xì)胞的增殖,但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);啟膈散濃度≥50 mg·L-1可顯著抑制EC9706細(xì)胞的增殖,隨著劑量的增大,抑制率逐漸上升(P<0.01),見圖1。選取0 mg·L-1、12.5 mg·L-1、25 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1濃度的啟膈散聯(lián)合2 mg·L-1順鉑作用EC9706細(xì)胞48 h后,細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01);與順鉑組比較,50 mg·L-1、100 mg·L-1的啟膈散聯(lián)合順鉑可顯著降低細(xì)胞的增殖能力,Q值分別為1.15、1.03,具有藥物相加作用(P<0.01),見圖2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取50 mg·L-1的啟膈散、2 mg·L-1順鉑、50 mg·L-1的啟膈散聯(lián)合2 mg·L-1順鉑用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注:與對(duì)照組比較,* P<0.05;**P<0.01;與順鉑組比較,# P<0.05,# #P<0.01;圖中負(fù)值表示促進(jìn)增殖。

3.2 啟膈散和順鉑聯(lián)合作用誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞凋亡與對(duì)照組比較,啟膈散組、啟膈散聯(lián)合順鉑組鏡下可看到細(xì)胞固縮變圓,凋亡率明顯增加(P<0.01);與順鉑組比較,啟膈散組和啟膈散聯(lián)合順鉑組的早期凋亡率顯著增加,總凋亡率顯著增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),見圖3、圖4,表2。

3.3 啟膈散和順鉑聯(lián)合作用可增加食管癌EC9706細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較,啟膈散組、順鉑組、啟膈散聯(lián)合順鉑組PTEN蛋白表達(dá)量均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與順鉑組比較,啟膈散組、啟膈散聯(lián)合順鉑組PTEN蛋白表達(dá)量均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

注:CON:對(duì)照組;QGS:啟膈散組;DDP:順鉑組;Q+D:啟膈散聯(lián)合順鉑組;與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與順鉑組比較,#P<0.05,##P<0.01。

3.4 啟膈散聯(lián)合順鉑對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞MEG3mRNA、PTENmRNA表達(dá)的影響結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,啟膈散組、啟膈散聯(lián)合順鉑組的MEG3mRNA、PTENmRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.01),順鉑組MEG3mRNA表達(dá)量增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),PTENmRNA表達(dá)量增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與順鉑組比較,啟膈散聯(lián)合順鉑組MEG3mRNA表達(dá)量極顯著升高(P<0.01),PTENmRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見圖6。

注:CON:對(duì)照組;QGS:啟膈散組;DDP:順鉑組;Q+D:啟膈散聯(lián)合順鉑組;與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與順鉑組比較,#P<0.05,##P<0.01。

3.5 啟膈散聯(lián)合順鉑對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞遷移的影響藥物作用48 h后,對(duì)照組的遷移率增高,劃痕面積減少,其余各組劃痕面積增大,出現(xiàn)反向遷移現(xiàn)象。與對(duì)照組比較,啟膈散組、順鉑組和啟膈散聯(lián)合順鉑組細(xì)胞遷移率降低(P<0.01);與順鉑組比較,啟膈散聯(lián)合順鉑組遷移率顯著降低(P<0.01)。由Transwell遷移實(shí)驗(yàn)可知,與對(duì)照組比較,啟膈散組和啟膈散聯(lián)合順鉑組遷移細(xì)胞減少。見圖7。

注:CON:對(duì)照組;QGS:啟膈散組;DDP:順鉑組;Q+D:啟膈散聯(lián)合順鉑組;與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與順鉑組比較,#P<0.05,##P<0.01。A:細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(10×),B:Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(20×),C:細(xì)胞劃痕統(tǒng)計(jì)結(jié)果(其中負(fù)值表示抑制遷移)。

4 討論

食管癌是常見的惡性腫瘤之一,手術(shù)和化療是常用的治療方法,可以取得一定的臨床療效,但其5年生存率僅為15%～20%,MDR是治療食管癌的主要障礙之一[13]?！吨T病源候論》有五噎和五膈記載,氣機(jī)郁結(jié)不暢,氣病失運(yùn),津凝而為痰,血滯而為瘀,繼而痰瘀乃生。食管癌的發(fā)病以正氣虧虛為主,與痰、瘀、熱關(guān)系密切,正虛邪實(shí)是食管癌的主要病機(jī),臨床診療中以扶正攻毒為主要治療原則,司富春研究團(tuán)隊(duì)收集研究151篇食管癌相關(guān)文章發(fā)現(xiàn):補(bǔ)虛、清熱、化痰散結(jié)、活血祛瘀類藥的使用占65%,主要治療方劑為啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯、補(bǔ)氣運(yùn)脾湯[14]。臨床常用方劑啟膈散方中沙參養(yǎng)陰潤肺,益胃生津;貝母滋陰化痰,砂仁殼性溫味辛,行氣溫中;荷葉蒂平苦和胃,茯苓甘淡滲利健脾為佐,共同促進(jìn)脾胃運(yùn)化功能,顧護(hù)中焦,使生痰無源;郁金、丹參共行活血祛瘀之效;杵頭糠作為引藥,可通咽達(dá)胃、益氣養(yǎng)血健脾,有利于改善病情,提高機(jī)體免疫力,減輕吞咽梗塞、疼痛、嘔吐等癥狀,增強(qiáng)消化道功能。大量臨床研究資料表明,啟膈散在有效抑制食管癌細(xì)胞生長及擴(kuò)散、降低復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率的同時(shí),可明顯減輕化療的毒副反應(yīng),改善血清中癌胚抗原、鱗狀上皮癌相關(guān)抗原、卡氏評(píng)分,提高患者生活質(zhì)量,使部分患者處于荷瘤生存狀態(tài),提升整體療效[15-17]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),啟膈散可干預(yù)食管癌細(xì)胞的增殖,因而本文以啟膈散為研究對(duì)象,探索其內(nèi)在機(jī)制。

LncRNA MEG3是位于人類染色體14q32.3上的印記基因,約1 600個(gè)核苷酸片段,是具有腫瘤抑制作用的LncRNA[18-19]。它在許多正常組織高表達(dá),但在一些原發(fā)性惡性腫瘤組織如食管癌、胃癌、口腔鱗癌等中低表達(dá)甚至不表達(dá),與腫瘤患者的不良預(yù)后存在相關(guān)性[20-22]。過表達(dá)MEG3可增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá),同時(shí)能夠抑制細(xì)胞生長,誘導(dǎo)EC109細(xì)胞凋亡,是ESCC中一種新的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn),但機(jī)制尚不明確[23]。本研究MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,啟膈散可有效抑制食管癌EC9706細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞形態(tài)、降低細(xì)胞貼壁率、抑制細(xì)胞的遷移,且聯(lián)合順鉑使用達(dá)到藥物相加作用。qRT-PCR的結(jié)果顯示,啟膈散組及啟膈散與順鉑聯(lián)合用藥組可上調(diào)LncRNA MEG3的mRNA水平,這表明啟膈散可能是通過干預(yù)LncRNA MEG3的表達(dá)來抑制食管癌細(xì)胞的增殖并增加細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性的,且LncRNA MEG3可能是食管癌防治的重要靶點(diǎn)。

PTEN基因位于10q23.3上,是人第10號(hào)染色體的基因,屬于抑癌基因,可以抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,并在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用[24-25]。當(dāng)腫瘤微環(huán)境中的PTEN低表達(dá)時(shí),會(huì)影響腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAM)中不同免疫細(xì)胞群的數(shù)量,誘導(dǎo)M2 TAM的極化并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[26]。另有研究表明,MEG3參與調(diào)節(jié)PTEN水平,在宮頸癌、膀胱癌、胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[27-29]。本研究中PTEN的結(jié)果顯示,啟膈散組及啟膈散聯(lián)合順鉑組PTEN蛋白及其mRNA水平均呈上升趨勢,可初步推斷啟膈散可能是通過干預(yù)LncRNA MEG3的表達(dá)進(jìn)而上調(diào)PTEN,起到抑制食管癌細(xì)胞增殖并增加食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的作用。

綜上所述,啟膈散干預(yù)EC9706細(xì)胞的增殖和遷移,促進(jìn)凋亡,增加食管癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,其機(jī)制可能與其上調(diào) MEG3進(jìn)而影響PTEN信號(hào)通路有關(guān)。課題組下一步準(zhǔn)備對(duì)LncRNA MEG3進(jìn)行敲除,觀察啟膈散是否還具治療并增加化療藥物順鉑敏感性的作用,進(jìn)一步探究啟膈散的作用機(jī)制。