基于加權基因共表達網(wǎng)絡分析探究養(yǎng)肺方治療非小細胞肺癌的作用機制及實驗驗證*

莊垚雪,林事成,劉殿娜,高磊,孫靜宜,魏佳,李泉旺

1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029; 2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院,北京 100078

肺癌是全球范圍內發(fā)病率較高的一類疾病,其死亡率位居各類癌癥的第一名,非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的85%[1-2]。NSCLC早期治療以根治性手術聯(lián)合放化療為主,中晚期治療以放化療為主,復發(fā)率較高,生存期不佳[3]。多項國內外研究證明,中醫(yī)藥具有較好的抗腫瘤輔助治療及對癥支持治療療效,能夠顯著提高腫瘤患者的總生存期[4-6]。首都名醫(yī)王沛教授認為肺癌的主要病機是正氣內虛,從而導致肺絡受損、痰瘀毒聚,故以益氣養(yǎng)陰為法,以“扶正”作為治療之本,以沙參麥冬湯為基礎,自擬養(yǎng)肺方以滋陰扶正、解毒散結,臨床觀察表明具有較高的安全性及較好的臨床療效[7-8]。本文首先通過網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合加權基因共表達網(wǎng)絡分析(weighted correlation network analysis,WGCNA)初步探究養(yǎng)肺方治療非小細胞肺癌的核心靶點、關鍵通路,然后基于非小細胞肺癌PC9細胞進行實驗驗證,以期為臨床養(yǎng)肺方抗肺癌的應用及中醫(yī)藥防癌治癌機制的闡明提供參考。

1 基于網(wǎng)絡藥理學和加權基因共表達網(wǎng)絡分析探究養(yǎng)肺方治療非小細胞肺癌的作用機制

1.1 資料與方法

1.1.1 養(yǎng)肺方活性成分、靶點的篩選在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)[9-10]查找養(yǎng)肺方組方中藥的化學成分,篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性指數(shù)(drug-likeness,DL)≥0.18,確定養(yǎng)肺方的活性成分。利用中醫(yī)藥百科全書(the encyclopedia of traditional Chinese medicine,ETCM)預測養(yǎng)肺方活性成分相關靶點[11],以Tanimoto>0.8作為篩選標準,獲得養(yǎng)肺方的總靶點。

1.1.2 差異基因分析運用GEO平臺[12]下載基因芯片GSE118370。采用GEO2R歸一化數(shù)據(jù)并分析差異基因,差異基因篩選標準:|logFC|≥1且P<0.05。R包ggplot2[3.3.3版本]繪制PCA圖、熱圖和火山圖。

1.1.3 WGCNA分析WGCNA是用于描述不同樣本之間基因關聯(lián)模式的生物學方法[13]。運用 WGCNA R studio函數(shù)(R包)構建共表達網(wǎng)絡,軟閾值估算運用pick Soft Threshold 函數(shù)。根據(jù)基因的內部連通性和軟閾值,將mRNA聚集成不同的共表達模塊,進而構建拓撲重疊矩陣(topological overlap matrix,TOM),利用hclust函數(shù)對TOM進行層次聚類,并根據(jù)拓撲重疊異度(1-TOM)對基因進行分組,最后利用dynamic tree cut算法來確定基因模塊。Module member ship(MM)是基于基因表達水平的不同,通過計算模塊中基因與模塊特征基因的相關性的高低,從而確定模塊中的關鍵基因,MM值高說明模塊中的基因關聯(lián)性越高[11]。

1.1.4 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡的構建利用Cytoscape 3.7.2軟件,導入養(yǎng)肺方組方中藥、有效成分及相關靶點基因和NSCLC差異基因構建的“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡文件,進而構建“藥物-活性成分-靶點”可視化網(wǎng)絡。網(wǎng)絡圖的節(jié)點(node)分別為藥物、活性成分、靶點。各節(jié)點之間的相互關系以邊(edge)表示。利用 CytoNCA 插件對網(wǎng)絡圖進行分析,設置“節(jié)度值(Dgree DC)>2倍中位數(shù)”,篩選養(yǎng)肺方治療NSCLC的有效藥效成分。

1.1.5 蛋白相互作用(protein-protein interaction networks,PPI)網(wǎng)絡的構建將WGCNA中篩選出的Hub基因與藥物靶點取交集得到治療靶點,導入STRING11.15平臺[11,14]進行PPI網(wǎng)絡構建,通過Cytoscape 3.7.2中的CytoHubba[15]篩選出核心治療靶點。

1.1.6 富集分析利用ClusterProfiler R包[16]進行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路富集分析,Org.Hs.eg.db包用于ID轉換。GO分析主要包括生物過程(biological process,BP)和分子功能(molecular function,MF)及細胞組分(cellular component,CC),以P<0.05為篩選標準,選取前20條GO條目及KEGG信號通路進行可視化,并采用ggplot2包進行氣泡圖繪制。

1.2 結果

1.2.1 養(yǎng)肺方活性成分及靶點在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出65個養(yǎng)肺方活性成分;通過ETCM數(shù)據(jù)庫對活性成分靶點進行進一步預測,共獲得283個藥物靶點。

表1 養(yǎng)肺方治療NSCLC有效藥效成分信息

1.2.2 NSCLC差異基因分析運用GEO平臺下載基因芯片GSE118370后,利用GEO2R歸一化數(shù)據(jù)并分析差異基因,以|logFC|≥1且P<0.05為條件進行篩選,共獲得差異基因1 192個,其中上調基因314個,下調基因878個。采用R包ggplot2[3.3.3版本]繪制差異基因的火山圖、PCA圖及熱圖。見圖1。

注:A:基因歸一化圖;B:差異基因火山圖;C:差異基因PCA圖;D:差異基因熱圖。

1.2.3 WGCNA分析運用 WGCNA R studio函數(shù)(R包)構建共表達網(wǎng)絡,軟閾值β標準為R2>0.50,β=9,最終獲得14個不同表達類型歸納的模塊,grey模塊被認為是無法被分配給任何模塊的基因集合。以模塊特征屬性為基礎,計算其與臨床表型關聯(lián),發(fā)現(xiàn)darkgreen模塊與吸煙表型的相關性最大,其中差異基因32個,相關系數(shù)為 0.94(P<0.01)。darkgreen模塊與吸煙表型的相關性最大這一結果可同樣通過模塊-臨床表型聚類分析獲得,以|MM|>0.8及|GS|>0.1為篩選條件,對darkgreen模塊中的32個核心基因進行篩選,共篩選出30個基因。將283個藥物靶點與WGCNA篩選出的30個核心基因取交集,獲得交集靶點基因10個。見圖2。

注:A:標度獨立性圖;B:平均連通性圖;C:模塊特征向量聚類圖;D:基因聚類圖;E:模塊與表型相關熱圖;F:樣本聚類圖;G:GS與MM相關散點圖;H:差異基因圖;I:養(yǎng)肺方靶點及核心差異基因韋恩圖。

1.2.4 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡利用Cytoscape軟件構建 “藥物-成分-靶點”相互作用關系網(wǎng)絡,見圖3,該網(wǎng)絡包括359個節(jié)點和933條邊,其中靶基因節(jié)點283個,活性成分節(jié)點65個。

圖3 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡圖

1.2.5 PPI網(wǎng)絡將10個交集靶點導入STRING網(wǎng)絡平臺構建PPI網(wǎng)絡,該網(wǎng)絡共有8個節(jié)點及19條邊,下載網(wǎng)絡文件導入Cytoscape軟件進行可視化,運用CytoHubba計算核心靶點,選取Degree值前5位的靶點,得到核心靶點基因為IL-6、PPARG、TP53、MAPK14、CASP9。見圖4。

圖4 PPI網(wǎng)絡圖及核心靶點圖

1.2.6 富集分析將10個基因利用ClusterProfiler包[17]進行KEGG和GO分析,P<0.05作為篩選標準,共篩選出869個BP條目,70個MF條目(未能富集出符合標準的細胞組分)及82個KEGG富集條目,前20個條目見圖5。BP主要涉及對炎癥反應的調節(jié)作用(regulation of inflammatory response)、類固醇激素反應(response to steroid hormone)、細胞對環(huán)境刺激的反應(cellular response to environmental stimulus)、白細胞凋亡過程(leukocyte apoptotic process)等;MF主要涉及磷酸酶結合(phosphatase binding)、蛋白磷酸酶結合(protein phosphatase binding)、泛素-樣蛋白連接酶結合(ubiquitin-like protein ligase binding)、泛素蛋白連接酶結合(ubiquitin protein ligase binding)及RNA聚合酶II轉錄因子結合(RNA polymerase II transcription factor binding)等;KEGG富集通路主要為Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Notch信號通路(Notch signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等。

注:A:GO富集分析BP條目氣泡圖;B:GO富集分析MF條目氣泡圖;C:KEGG富集分析氣泡圖。

2 基于PI3K/AKT通路研究養(yǎng)肺方對NSCLC PC9細胞凋亡的影響

2.1 材料

2.1.1 動物與細胞人肺腺癌PC9細胞株(浙江美森細胞科技有限公司,貨號:CTCC-400-0185)。Wistar大鼠,雄性,40只,體質量為(200±20)g,購自斯貝福生物技術有限公司,許可證號為SCXK(京)2019-0010。Wistar大鼠購回后飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗動物中心SPF級動物房,飼養(yǎng)條件:溫度(24±2) ℃,濕度50%±10%,標準飼料喂養(yǎng),自由進食水,晝夜12 h交替。本次實驗得到北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準,倫理審查號為202020。

2.1.2 藥物與試劑養(yǎng)肺方(顆粒劑,北京康仁堂藥業(yè)有限公司)。胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素(美國GIBCO公司,貨號:10099141、25200056、15140122);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國 Hyclone公司,貨號:SH30022.01);RIPA(強)裂解液(上海碧云天生物技術有限公司,貨號:P0013K);BCA蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司,貨號:KGP902);Reveraid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司,貨號:K1622);SYBR qPCR SuPerMixPlus試劑盒(蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司,貨號:E096-01a);NucleoZol RNA提取試劑(基因科技公司,貨號:740404.6);Tunel檢測試劑盒(北京基譜生物科技有限公司公司,貨號:GPB1829);p-蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)多克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司,貨號:4060);p-磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)多克隆抗體(美國Abcam公司,貨號:ab182651);山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG(美國Proteintech公司,貨號:30000-0-AP、SA00001-1)。

2.1.3 儀器熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司,型號:ABI7300);小型垂直電泳轉印系統(tǒng)(美國 BIO-RAD公司,型號:1658033);多功能酶標儀(美國MD公司,型號:MK3)。

2.2 方法

2.2.1 含藥血清制備黨參15 g,天冬12 g,麥冬15 g,五味子6 g,浙貝母12 g,清半夏15 g,細辛 3 g,干姜6 g,竹茹9 g,三七6 g,桔梗9 g,顆粒沖泡,制成濃度為40 g·mL-1的藥液。適應性喂養(yǎng)大鼠3 d,隨機分為養(yǎng)肺方組和空白組,每組20只。養(yǎng)肺方組大鼠每日灌胃養(yǎng)肺方溶液,空白組大鼠每日灌胃蒸餾水,每日灌胃2次,灌胃體積為10 mL·kg-1,連續(xù)灌胃7 d,最后1次灌胃1 h后腹主動脈取血,末次給藥灌胃前一晚禁食不禁水。腹主動脈取血離心滅菌后獲得含藥血清。

2.2.2 細胞培養(yǎng)PC9培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2,根據(jù)實驗安排將細胞隨機分為對照組及養(yǎng)肺方組。完全培養(yǎng)基含10%胎牛血清或不同比例含藥血清及1%青霉素/鏈霉素。待細胞生長90%～100%時以13比例傳代。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.2.3 細胞活力測定將PC9細胞接種到96孔板中,每孔5 000個細胞,每組設置3個重復孔,并設空孔組。培養(yǎng)12 h后細胞分別用不同濃度含藥血清(20%空白組大鼠血清、2.5%含藥大鼠血清+17.5%空白組大鼠血清、5%含藥大鼠血清+15%空白組大鼠血清、10%含藥大鼠血清+10%空白組大鼠血清、15%含藥大鼠血清+5%空白組大鼠血清、20%含藥大鼠血清)的培養(yǎng)基處理。在處理24 h后,棄培養(yǎng)基,并向每個孔中加入含10 μL CCK8試劑的新鮮培養(yǎng)基100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后采用酶標儀檢測每組細胞在450 nm處的光密度(optical density,OD)值,計算各組細胞的細胞活力。細胞活力(%)=[(實驗組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)]×100%[17]。

2.2.4 蛋白質免疫印跡分析細胞分為對照(20%空白組大鼠血清)組及養(yǎng)肺方組(10%含藥大鼠血清+10%空白組大鼠血清),培養(yǎng)于6孔板中。給藥完畢后,將裂解溶液加入孔中以收集樣品。在12 000×g,4 ℃離心20 min后采用BCA蛋白濃度測定法測定各樣本蛋白濃度,依據(jù)測定結果將所有樣本總蛋白濃度統(tǒng)一調至1 g·L-1。100 ℃高溫煮沸10 min使蛋白變性以便于保存。SDS-PAGE電泳,取10 μL樣本上樣,80 V恒壓電泳,條帶至底部時停止電泳,100 mA恒流電轉100 min,已完成電泳電轉的PVDF膜加入快速封閉液封閉30 min結合PVDF膜上無關蛋白反應位點,加入11 000、12 000 稀釋的p-PI3K、p-AKT一抗工作液及15 000 稀釋的GAPDH 4 ℃過夜,加入15 000 稀釋的山羊抗兔(鼠)二抗室溫孵育1 h,超敏ECL發(fā)光液孵育后顯影,ImageJ軟件分析條帶灰度值。

2.2.5 實時定量熒光PCR分析細胞分為對照組(20%空白組大鼠血清)及養(yǎng)肺方組(10%含藥大鼠血清+10%空白組大鼠血清)?？俁NA提取及濃度測定依據(jù)NucleoZol RNA提取試劑說明書完成。反轉錄獲得cDNA后進行擴增,擴增反應體系為2×NovoStart?SYBR qPCR SμperMix Plμs 10μL,上下游引物各1 μL,模版cDNA 1 μL,ROX I 0.4 μL,RNase Free Water 6.6 μL。使用ABI 7300 qRT-PCR系統(tǒng)檢測相關mRNA的表達,反應條件:95 ℃ 1 min,95 ℃ 20 s,60 ℃ 1 min,共 40個循環(huán),最后一步 60 ℃時記錄熒光信號,依程序設定溶解曲線,按照 2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達量。引物序列為:PI3K:上游引物:5′-ACTGAAGCAGATGTTGAACAAC-3′,下游引物:5′-CATCGATCATTTCCAAGTCCAC-3′;AKT:上游引物:5′-TGACCATGAACGAGTTTGAGTA-3′,下游引物:5′-GAGGATCTTCATGGCGTAGTAG-3′。β-ACTIN:上游引物:5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′,下游引物:5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′。

2.2.6 細胞凋亡檢測細胞分為對照組(20%空白組大鼠血清)及養(yǎng)肺方組(10%含藥大鼠血清+10%空白組大鼠血清)。分組給藥后,收集細胞,制備細胞爬片,4%多聚甲醛固定,PBS漂洗后加入500 μL 透膜液,室溫水平搖床孵育15 min。PBS漂洗后,滴加50 μL Tunel檢測液37 ℃孵育5 min。棄去檢測液,PBS漂洗,滴加50 μL Tunel試劑于濕盒內37 ℃孵育90 min。棄掉Tunel試劑,PBS漂洗,滴加50 μL FITC試劑工作液37 ℃避光孵育30min。PBS漂洗,爬片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)封片。樣本于熒光顯微鏡下觀察,每個樣本隨機挑選3個視野,計算細胞總數(shù)及陽性細胞數(shù)。DAPI染出來的細胞核為藍色,TUNEL陽性表達的細胞為綠色。

2.3 結果

2.3.1 CCK8結果各實驗組PC9細胞經(jīng)過 24 h 不同濃度養(yǎng)肺方含藥血清干預后,與對照組比較,細胞活力明顯下降(P<0.05),且不具有濃度依賴性,養(yǎng)肺方含藥血清濃度為10%時,細胞活力最差,且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05),因此后續(xù)實驗選定養(yǎng)肺方組的藥物干預方式為10%含藥血清。見圖6及表2。

圖6 細胞活力圖

表2 CCK8法檢測細胞活力

2.3.2 養(yǎng)肺方降低PC9細胞PI3K及AKT表達并誘導細胞凋亡與對照組比較,養(yǎng)肺方組p-PI3K、p-AKT蛋白及PI3K、AKT的mRNA表達水平均降低,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.01)。見圖7、表3及表4。與對照組比較,養(yǎng)肺方組TUNEL染色陽性細胞數(shù)增加(P<0.05)。見圖8及表4。

圖7 PI3K/AKT通路相關蛋白條帶圖

圖8 細胞凋亡圖

表3 PI3K、AKT蛋白及mRNA表達水平比較

表4 兩組細胞凋亡率比較

3 討論

肺癌為難治性、高發(fā)性、高致死性的一類惡性腫瘤,主要治療手段仍為外科手術聯(lián)合放、化療,然而放化療在殺滅腫瘤細胞、控制與縮小腫瘤的同時,其嚴重的毒副反應常給患者帶來極大的痛苦,且有效率仍不理想,使患者身心受到嚴重的打擊。因此,在保證一定生存質量的前提下,尋求有效延長生存期的治療方案尤為迫切。前期臨床研究表明,養(yǎng)肺方聯(lián)合治療可延長患者生存期,改善臨床癥狀并有效提高生存質量,然其作用機制尚不明晰。故本研究選用人肺腺癌細胞株PC9探討?zhàn)B肺方抑制NSCLC發(fā)展的機制。

肺癌在中醫(yī)中屬于“積病”“癥瘕”等范疇,治療時可以扶正益氣、化痰散結、養(yǎng)陰生津為基本治則,王沛教授以沙參麥冬湯為基礎方進行加減化裁,以益氣養(yǎng)陰為基礎,佐以扶正化痰之品,最終形成以黨參、麥冬、天冬、五味子、干姜、細辛、清半夏、浙貝母、竹茹、桔梗、三七粉為主要成分的養(yǎng)肺方。方中黨參味甘、性平,主歸脾、肺二經(jīng),具有補脾益肺、養(yǎng)陰生津之效,補而不燥故為君藥。麥冬、天冬甘寒質潤,主入肺經(jīng),與黨參同用增潤肺生津之效、清甘補之燥烈,故為臣藥。五味子酸甘性溫,主入肺、腎、心經(jīng),為補虛強壯收澀之要藥,上可斂肺止咳、下可固腎平喘、內能生津安神、外能固表止汗,與黨參、麥冬、天冬相合則津液得生、諸氣得復,正氣存內而邪不可干;癌多為痰、瘀互結而成,故予半夏燥濕化痰、消痞散結,浙貝母清熱化痰、解毒散結,竹茹清熱化痰、止咳平喘以增強化痰散結之力;然而痰邪久羈最易耗氣傷血,故純用散痰消積之品唯恐耗傷肺氣,取張仲景“病痰飲者,當以溫藥和之”的治療原則,以干姜、細辛溫化痰飲又合五味子以斂肺止咳平喘,則痰飲消、咳喘止、肺氣不傷;三七粉活血而不耗氣、止血而不留瘀;諸藥相合共奏化痰散結、止咳化瘀之效,共為佐藥。桔梗以其升散之力載諸藥上行,主歸肺經(jīng)引諸藥入肺,又有宣肺化痰之效,故為佐使藥。半夏、貝母、三七均被證明有較好的抗腫瘤療效,然作用機制繁雜,據(jù)此本研究先以加權基因共表達聯(lián)合網(wǎng)絡藥理學挖掘養(yǎng)肺方治療NSCLC的機制,進而進行體外實驗驗證。

通過挖掘養(yǎng)肺方活性成分及靶點發(fā)現(xiàn),除中藥中常見成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、黃芩苷等發(fā)揮作用,薯蕷皂苷元、金合歡素及人參皂苷 Rh2同樣作為主要活性成分發(fā)揮重要藥理作用,可以抗血管生成、抑制腫瘤細胞侵襲遷移、抗腫瘤細胞增殖并誘導腫瘤細胞凋亡,且主要通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮相關作用[18-23]。核心靶點IL-6、PPARG、TP53、MAPK14、CASP9。IL-6、MAPK14、CASP9的高表達與NSCLC的不良預后密切相關[24-26],PPARG、TP53的高表達被證明可抑制NSCLC的發(fā)生發(fā)展[27-28]。

通過對交集靶點的KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),主要包括PI3K/AKT、Wnt、Notch、MAPK等通路,其中PI3K/AKT通路不僅對腫瘤細胞的增殖凋亡、侵襲遷移起到重要作用,并且可以干預上下游靶點或通路以促進腫瘤細胞的增殖及相關藥物耐藥,靶向PI3K/AKT通路的藥物部分已被批準于臨床使用,并取得一定療效[29-31]。在肺腺癌中,IL-6被認為可能是PI3K/AKT通路的上游因子,抑制IL-6/PI3K/AKT信號通路可以抑制肺腺癌細胞的增殖[32]。劉曉麗等[33]研究發(fā)現(xiàn),沉默TP53基因表達可介導PI3K/PTEN/AKT信號通路從而抑制腎透明細胞癌侵襲轉移。Verma等[34]研究發(fā)現(xiàn),MAPK/RAS/RAF/MEK/ERK、PI3K/Akt/mTOR及PPARG下游靶點具有相互串擾的作用。MAPK及PI3K/AKT信號通路在腫瘤中起到協(xié)同作用,PI3K/AKT通路的高表達可以激活MAPK通路[35]。PI3K/AKT通路可以誘導糖原合成激酶-3β(GSK-3β)磷酸化[36],磷酸化的GSK-3β可以與β-catenin結合并促進Wnt/β-catenin通路的激活,進而促進肺癌的發(fā)生發(fā)展并誘導上皮間充質轉化[37]。在NSCLC中Notch1和Notch3的激活突變會促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展及誘導轉移,同時抑制P53的表達從而抑制腫瘤細胞凋亡,Notch信號中的細胞內結構域(NICD)則可以在細胞質或細胞核內與AKT、Wnt等途徑相互作用,以調節(jié)靶基因的轉錄[38]。由此推斷,PI3K/AKT通路為本研究富集通路中的關鍵通路,故本研究針對PI3K/AKT通路,應用PC9細胞,初步驗證養(yǎng)肺方抗非小細胞肺癌的作用機制。結合PI3K/AKT通路可以串擾其他相關通路及誘導腫瘤細胞凋亡的作用,推測養(yǎng)肺方可能通過抑制PI3K/AKT通路誘導細胞凋亡。

綜上所述,養(yǎng)肺方治療NSCLC的主要成分分別為槲皮素、山柰酚、木犀草素、黃芩苷、薯蕷皂苷元、金合歡素及人參皂苷 Rh2,主要靶點為IL-6、PPARG、TP53、MAPK14、CASP9,主要通路包括PI3K/AKT、Wnt、Notch、MAPK等通路。體外實驗證明養(yǎng)肺方可以抑制NSCLC PC9細胞活性,并可能通過抑制PI3K/AKT通路誘導腫瘤細胞凋亡。NSCLC的發(fā)生發(fā)展為多條信號通路的協(xié)同串擾作用,并涉及多種細胞因子,本研究初步檢測養(yǎng)肺方發(fā)揮抑癌作用的關鍵通路,后續(xù)仍需進一步檢測養(yǎng)肺方化合物并分析有效成分,并深入探析相關信號通路間的機制,進一步探究癌細胞凋亡機制,依次驗證活性成分-預測靶點-預測細胞通路的分子機制,并進行體內驗證。