綿羊精液液態(tài)保存中的應(yīng)用現(xiàn)狀

胡世超，于小杰，王 凈

（1.河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院 075000；河北省肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟 075000）

隨著養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的興起，我國養(yǎng)羊業(yè)更加趨向集約化，與傳統(tǒng)養(yǎng)殖業(yè)相比，規(guī)?；B(yǎng)殖有了顯著的提升[1]。羊人工授精技術(shù)在現(xiàn)代養(yǎng)羊業(yè)中應(yīng)用日益廣泛。人工授精是在合理的時(shí)間范圍內(nèi)對家畜進(jìn)行快速遺傳改良最實(shí)用的技術(shù)，該技術(shù)具有提高優(yōu)良公畜繁殖效率而減少公畜所需的頭數(shù)，阻礙生殖道疾病傳播，解決因公母畜體型差異大造成交配困難的難題，打破時(shí)間、地域限制實(shí)現(xiàn)配種等優(yōu)點(diǎn)，羊人工授精的推廣應(yīng)用加速了遺傳改良的進(jìn)程[2]。

目前種公羊精液基本上是現(xiàn)采現(xiàn)用，保存期最長3 d 左右，不能滿足生產(chǎn)需要，因此精液保存是人工授精最重要的一環(huán)，精液的保存方式有冷凍保存和低溫、常溫保存。冷凍保存適用于長時(shí)間保存精液，但冷凍保存成本高且綿羊精子耐凍性差易導(dǎo)致其活力和受精能力降低，保存在液氮中的凍精在轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，由于道路顛簸，無法保證凍精的質(zhì)量[3]。常溫保存溫度范圍為15℃～25℃，操作簡單、成本最低但保存時(shí)間短，不能實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離運(yùn)輸[4]。低溫保存一般在0℃～5℃，與常溫保存相比，精液的保存時(shí)間更長，能滿足一定程度時(shí)間和距離的繁育要求；較冷凍保存而言，生產(chǎn)成本降低，又能有效提高精子的成活率[5,6]。目前影響綿羊精液保存的因素基本上是保存溫度、精液稀釋液成分、稀釋倍數(shù)、滲透壓等，以期延長精子保存時(shí)間和質(zhì)量，提高母羊受胎率。

1 綿羊精液常溫保存中的應(yīng)用

常溫下保存的精液，如果3h 內(nèi)使用完成，則不需要特殊的降溫處理，只需將精液密封放置在常溫下即可，但是一般不能滿足生產(chǎn)需要，需要進(jìn)行處理使其保存時(shí)間更長。影響綿羊精液常溫保存主要面臨的問題有稀釋液的滲透壓和pH 值、微生物和活性氧（ROS）造成的損傷。精液稀釋液一般包括能源物質(zhì)、緩沖物質(zhì)、抗菌物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)等。

1.1 能源物質(zhì)

能源物質(zhì)主要為糖類，精液稀釋液中常用的糖類包括葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、海藻糖等。有研究發(fā)現(xiàn)，糖類物質(zhì)混合添加比單用某一種糖效果更好[7]。穆秀明等[8]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊精液常溫保存稀釋液葡萄糖-蔗糖-檸檬酸鈉比葡萄糖-乳糖-檸檬酸鈉的效果要好，說明使用蔗糖的效果比乳糖好；徐振軍等人在絨山羊精液常溫保存的試驗(yàn)中得出稀釋液含蔗糖效果更好[9]。張良斌等[10]對肉羊鮮精常溫保存技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn)種公羊精液與稀釋液1∶3 比例混合，海藻糖含量為2 g 時(shí)，精子活率在4 d 連續(xù)測試的活率高于其他含量濃度的活率，并且精子活率的降幅相對穩(wěn)定，在第4 d 高于50%以上，也符合實(shí)際生產(chǎn)需要。

對能源物質(zhì)進(jìn)行改良和革新，是羊精液保存技術(shù)中的研究熱點(diǎn)之一。卵黃也可作為能源物質(zhì)，為精子的代謝提供能量，維持精子活性、保證精子膜以及保護(hù)頂體的完整性，張小剛等[11]提到稀釋液中添加10%卵黃可為精子提供營養(yǎng)。卵黃為大分子非滲透性物質(zhì)可以調(diào)節(jié)稀釋液滲透壓，使精子所處環(huán)境更加適宜。卵磷脂、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白(HDL)是卵黃中的主要物質(zhì)，而卵磷脂和LDL 具有保護(hù)精子的作用。張柳明等[12]研究發(fā)現(xiàn)隨精液保存時(shí)期變化，添加卵黃的濃度也應(yīng)相應(yīng)改變，可能是精液保存初期營養(yǎng)物質(zhì)較為充足，而高濃度卵黃會改變精液濃度使?jié)B透壓發(fā)生改變，降低精子質(zhì)量；精液保存后期營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，需要高濃度卵黃為其提供充足營養(yǎng)。但在添加卵黃的同時(shí)還應(yīng)承擔(dān)相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)槁腰S是動物源性物質(zhì)，可能存在未知的生物學(xué)感染，可能會有某種毒素等，也會因?yàn)轱曫B(yǎng)條件的不同、品種的不同，造成卵黃的性能不穩(wěn)定[13]。

1.2 緩沖物質(zhì)

緩沖液作用是調(diào)節(jié)并保持稀釋液在精子所適宜的pH 范圍內(nèi)，綿羊精液pH 值約在6.7～6.8，當(dāng)精子處于弱酸環(huán)境時(shí)代謝受到抑制能量消耗減少，所以稀釋液pH 值等于或略小于精液pH 值會延長精子存活時(shí)間，但精子糖酵解過程中會產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，pH 值驟降，精子受損，所以通常添加一些緩沖物如碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、三羥基甲氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）等[14]。檸檬酸鈉是目前廣泛應(yīng)用的緩沖劑，稀釋液中加入3%的檸檬酸鈉，可以保持羊精液pH 值的相對穩(wěn)定。Tris 是生化實(shí)驗(yàn)中常用的緩沖劑，具有良好的緩沖能力和滲透性，毒性較低，一定程度上使精液pH 趨于堿性，維持精子活動，利于提高精子存活率。EDTA 可以用作螯合劑，與稀釋液中Ca2+等有害重金屬離子發(fā)生螯合反應(yīng)，避免其與頂體結(jié)合，提高精子成活率[15,16]。

1.3 抗菌物質(zhì)

由于采精器械未滅菌，未達(dá)到無菌操作標(biāo)準(zhǔn)，在精液采集和保存過程中，公畜精液可能會受到外源致病菌的污染[17]。所以加入適量的抗菌物質(zhì)可抑制細(xì)菌的生長，降低有害細(xì)菌的存活率。傳統(tǒng)使用的抗生素有青霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、硫酸慶大霉素、林可霉素等，在公羊精液稀釋液中，加入青霉素和鏈霉素或慶大霉素可滅活布魯氏菌和放線桿菌，使抗生素配伍使用效果更好。但隨著細(xì)菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，傳統(tǒng)抗生素作用減弱，一些新型抗菌劑相繼出現(xiàn)，主要是具有抗菌能力的肽類或蛋白質(zhì)[18]。比如抗菌肽，綠原酸等物質(zhì)逐步在稀釋液中應(yīng)用。還有HEL-75 蛋白，能夠通過劑量依賴方式在精液保存中殺死大腸桿菌，而不影響精子的活力和受精能力。

1.4 抗氧化物質(zhì)

綿羊精液具有抗氧化能力，精液保存時(shí)精子代謝可以產(chǎn)生活性氧，低濃度的活性氧可以提高精子透明帶的結(jié)合能力，提高精子的活力。但當(dāng)活性氧濃度高于精子抗氧化能力的最大值時(shí)，就會破壞核內(nèi)DNA，破壞線粒體結(jié)構(gòu)，縮短精子保存時(shí)間，使精子受精能力下降。精液中的死精子分泌芳香族氨基酸氧化酶，此酶可催化活性氧的生成，死精子越多，此酶濃度越大從而導(dǎo)致存活的精子受到損害，形成惡性循環(huán)?；钚匝趸镏械暮衔锓Q為活性氮（RNS），也會對精子遺傳物質(zhì)和結(jié)構(gòu)造成破壞，所以通常在精液稀釋液中添加外源抗氧化物來阻礙氧化反應(yīng)的發(fā)生、提高精子活性[19]?？寡趸瘎┯忻割惪寡趸瘎┕入赘孰倪^氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和還原型谷胱甘肽（GSH）等 ；非酶類抗氧化劑包括維生素類（維生素C、維生素E、維生素B12等）、激素類（多巴胺、褪黑素等）、氨基酸多肽類（?；撬帷⒈彼?、半胱氨酸等）和多糖中的海帶多糖以及多酚類中的茶多酚等[20]。

1.5 調(diào)節(jié)滲透壓

滲透壓是精子細(xì)胞膜內(nèi)外存在壓力差而產(chǎn)生的，在低滲或者高滲情況下都會使精子形態(tài)發(fā)生改變，如在高滲的情況下，精子大量脫水而皺縮死亡；在低滲條件下，精子尾巴膨脹，開始卷曲，出現(xiàn)質(zhì)膜、頂體破裂等現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)，常溫保存的綿羊精液在滲透壓較高的稀釋液中，其精子活率和質(zhì)膜完整率均優(yōu)于低滲溶液[21]。稀釋倍數(shù)也會對滲透壓產(chǎn)生影響，要把精子密度稀釋到最適合保存精子的狀態(tài)，加入稀釋液精子密度降低，增加精子游動空間，才能更好的吸收稀釋液中的營養(yǎng)物質(zhì)。在實(shí)踐中常用到的稀釋液是經(jīng)過消毒的0.9%氯化鈉溶液，但稀釋倍數(shù)通常在2 倍以下[22]。有研究用葡萄糖-檸檬酸鈉溶液將精液稀釋3 倍，常溫保存12 h 后，精子活力可達(dá)30%，仍具受精能力[23]。

2 綿羊精液低溫保存中的應(yīng)用

低溫保存是在0℃～5℃環(huán)境中暫時(shí)抑制了精子的運(yùn)動，使其代謝緩慢，且有效抑制了有害菌的生長繁殖。有實(shí)驗(yàn)表明，同一只杜泊羊，相同的稀釋液和稀釋倍數(shù)，在20℃～25℃下，8 h 后精子活率為0，而在低溫保存下，72 h 后精子活率仍在80%以上，活力衰減5%以內(nèi)[24]。費(fèi)俊陽等[25]研究發(fā)現(xiàn)，選用薩福克和杜泊公羊精液采用專用稀釋液處理并在0℃冰水混合物狀態(tài)下保存，12 d 內(nèi)精子活率在70%以上，頂體完整率保持在33%以上，滿足生產(chǎn)需要。

2.1 低溫保護(hù)劑

低溫保存稀釋液成分要比常溫保存多一種低溫保護(hù)劑，是因?yàn)楣蚓拥拿舾行院芨撸淤|(zhì)膜磷脂中不飽和脂肪酸含量較多，通常我們認(rèn)為只有在冷凍條件下才會使精子發(fā)生冷休克，實(shí)際上精子在10℃以下很容易受到低溫影響而出現(xiàn)冷休克現(xiàn)象，因此，稀釋液中要添加低溫保護(hù)劑。通常實(shí)踐中使用的保護(hù)劑是丙三醇（甘油），曹訪等[26]在實(shí)驗(yàn)中得出，保護(hù)劑中乙二醇和丙三醇保護(hù)效果較好，其中以5%的丙三醇效果最佳，與孫時(shí)軍等[27]在低溫保護(hù)劑對4℃保存豬精液活率影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果有些不同，孫時(shí)軍等結(jié)果顯示，乙二醇的保護(hù)效果優(yōu)于丙三醇，可能是由于保護(hù)劑的添加量不同造成的偏差，也不排除動物個(gè)體間差異。保護(hù)劑用量不當(dāng)會對精子活力和受精力存在毒害作用，丙三醇黏稠度高，容易影響精子活動，導(dǎo)致精子頂體出現(xiàn)異常，而乙二醇則會導(dǎo)致精子出現(xiàn)尾部畸形，保護(hù)劑添加量過多或過少都會對精子造成毒害。

動物源性物質(zhì)如卵黃、奶類、蜂蜜也可作為精子低溫保護(hù)劑。研究發(fā)現(xiàn)，卵黃是這些保護(hù)劑中效果較好的，因?yàn)槁腰S中含有磷脂的脂蛋白對精子抵抗低溫刺激效果顯著，而且卵黃還可以提供能量[28]。有研究表明，添加卵黃稀釋液在精子低溫保存至第8 d 時(shí)，精子活率仍可達(dá)到輸精標(biāo)準(zhǔn)且對精子DNA 傷害不大[29]。添加卵黃濃度很重要，當(dāng)卵黃濃度過高超出一定范圍時(shí)就會阻礙精子對糖類的利用，卵黃濃度一般在5%～20%，超出可能會影響受胎率。此外，卵黃為動物源性物質(zhì)，可能會被細(xì)菌、病毒等污染，卵黃產(chǎn)生的芳香氨基酸會幫助死精子產(chǎn)生活性氧。目前，大豆卵磷脂為非動物源性物質(zhì)可作為卵黃替代物之一。趙建清等[30]用1.25%濃度的大豆卵磷脂代替卵黃在低溫下保存綿羊精液，延長了精子有效存活時(shí)間，并且比其他四組濃度（2.5%、3.5%、7.5%、10%）保存效果都好。而在添加低劑量大豆卵磷脂稀釋液低溫保存綿羊精液的研究中發(fā)現(xiàn)，添加0.5%濃度的大豆卵磷脂的效果更優(yōu)[31]。另有研究發(fā)現(xiàn)，添加0.375%的大豆卵磷脂可以代替卵黃在綿羊精液低溫保存中的作用，保存效果較好[32]。胡傳水等[33]采用1.5%的大豆卵磷脂替代卵黃低溫下保存豬精液，可以較好地維持精子活力和延長精子的有效保存時(shí)間。使大豆磷脂濃度差異的原因可能有：生產(chǎn)廠家的不同、不同批次的大豆磷脂效果不同、物種間的差異等。

2.2 其他物質(zhì)

精子低溫保存時(shí)，除了添加抗生素、營養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化劑等物質(zhì)之外，還應(yīng)該添加一些增強(qiáng)精子保護(hù)功能并且安全的物質(zhì)，例如海藻糖、牛血清蛋白、褪黑激素、肝素等。

海藻糖屬于非還原性雙糖，是天然雙糖中最穩(wěn)定的一類，在高滲和低滲透壓以及高溫和低溫等惡劣條件下，可在細(xì)胞表面形成保護(hù)膜，能有效地保護(hù)精子不受損害。鄒宇銀等[34]研究表明，在稀釋液中加入少量海藻糖，不會直接提高精子活率，但明顯提高精子頂體完整率，頂體完整率可間接反應(yīng)精子功能，頂體中的頂體酶在受精過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。楊文瑾研究發(fā)現(xiàn)[35]，低溫保存牛精液稀釋液中加入一定范圍濃度海藻糖時(shí)，海藻糖的濃度越高，精子活力越強(qiáng)，隨著保存時(shí)間的延長，發(fā)揮的特性就越好。

牛血清白蛋白作為膜的穩(wěn)定劑主要維持精子膜的穩(wěn)定，可以阻止精子質(zhì)膜黏連，也可幫助多數(shù)哺乳動物精子獲能。王彥虎等[36]研究表明，在4℃條件下，添加3 g/L 牛血清白蛋白效果最佳，可提高湖羊精子質(zhì)膜完整率、精子活率，但添加6 g/L牛血清白蛋白精液保存24 h 之后，會對精子有損傷。

哺乳動物精液在低溫保存過程中易受到低溫打擊而發(fā)生損傷，精子損傷后會加劇活性氧的生成，活性氧過量就會造成質(zhì)膜損傷、線粒體功能異常等。褪黑激素雖在綿羊精液保存中研究較少，但作為一種內(nèi)源抗氧化劑，能夠避免精子受到過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜不受外界損傷。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)精子在低溫保存下，加入褪黑素可顯著提高精液保存效果[37]。肝素可用于牛羊等動物體外獲能及頂體反應(yīng)，稀釋液中加入肝素，精子內(nèi)鈣離子含量明顯增加，促進(jìn)鈣離子的吸收。

3 結(jié)語

精液保存技術(shù)和人工授精技術(shù)的應(yīng)用有效提高了優(yōu)秀種公畜的利用率，精液的保存研究會不斷精進(jìn)，精液稀釋液中的抗氧化、抗菌、營養(yǎng)物質(zhì)、維持滲透壓及酸堿度等物質(zhì)將日益更新。具有受精能力的精子在精液保存中才具有保存的價(jià)值和意義，但這些添加物在不定量情況下混合在一起，是否會影響精子正常的生理生化特性，是否會影響精子受精率以及某些表觀遺傳特性等問題仍處于探索階段。