甘草次酸對(duì)咳嗽變異性哮喘小鼠Th1/Th2 平衡影響的研究

陳秋玲，周 蓓，李燕玲，林 惠，吳燕春，劉 含

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一種特殊類型哮喘，無喘息、氣急及哮鳴音等典型哮喘的癥狀和體征［1］，通常以刺激性干咳作為唯一或主要臨床表現(xiàn)，是中國(guó)兒童慢性咳嗽的最常見病因之一［2］。本病遷延難愈、容易復(fù)發(fā)，患兒發(fā)展成典型哮喘的概率高［3］。目前CVA 發(fā)病機(jī)理尚不明確，大部分學(xué)者認(rèn)為CVA 存在氣道平滑肌的異常收縮、支氣管痙攣和黏液腺體分泌亢進(jìn)，其病理改變以氣道高反應(yīng)性、持續(xù)的氣道炎癥反應(yīng)以及氣道重塑為特點(diǎn)［4］，涉及多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子共同參與和相互作用，主要以T 輔助細(xì)胞2（Th2）效應(yīng)細(xì)胞活化、免疫球蛋白E（IgE）的生成和嗜酸性粒細(xì)胞（Eos）增多為特征［5，6］。治療上國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有診療指南強(qiáng)調(diào)確診后即按經(jīng)典哮喘長(zhǎng)期規(guī)范治療［7，8］。臨床治療主要以糖皮質(zhì)激素聯(lián)合β2受體激動(dòng)劑為主，可達(dá)到預(yù)期治療效果，但長(zhǎng)期使用也存在副作用和局限性。

甘草（glycyrrhiza uralensis）是世界上最古老和最常用的藥物之一，在中外古籍中均有記載［9］。在中國(guó)，甘草作為藥物最早收錄于漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，有“國(guó)老”的美譽(yù)，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛及調(diào)和諸藥等廣泛且良好的藥效作用，因此在神經(jīng)、消化、呼吸、心血管等系統(tǒng)疾病中均有應(yīng)用。在CVA 的中醫(yī)治療方面，有研究顯示甘草是處方中詞頻最高的藥物［10］，有其不可或缺的藥理作用。

甘草次酸（glycyrrhetinic acid，Cas 號(hào)471-53-4，分子式C30H46O4，圖1），是甘草的主要活性成分，已被證明具有減輕氣道炎癥、改善氣道重塑、鎮(zhèn)咳等作用［11-13］。本研究通過建立咳嗽變異性哮喘小鼠模型，通過給藥后觀察甘草次酸對(duì)Th1/Th2 平衡的影響，為其臨床治療咳嗽變異性哮喘提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1 甘草次酸Fig 1 Glycyrrhetinic acid

1 材料

1.1 動(dòng)物

48 只幼齡BALB/c 雌性小鼠（4～6 周齡，14～16 g），購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004），飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)屏障系統(tǒng)環(huán)境內(nèi)，晝夜節(jié)律12 h，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，自由攝食、飲水。本研究方案經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理與福利委員會(huì)批準(zhǔn)（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理號(hào)：DW20220422-160）。

1.2 藥物與試劑

甘草次酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.6%，批 號(hào)：110723-201715）；卵 蛋 白（美 國(guó)Sigma-Aldrich，SLCB8249）；氫氧化鋁（天津市大茂化學(xué)試劑廠，20170523）；醋酸潑尼松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)201215）；小鼠OVA-sIgE ELISA 試劑盒（上海江萊實(shí)業(yè)股份有限公司，貨號(hào)：032210ZF234050324）；T-bet（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：13700-1-AP）；IFN-γ（Abcam，貨號(hào)：ab171081）；Gata3（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：66400-1-Ig）；IL-4（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：66142-1-Ig）；IL-13（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨 號(hào)：AF7254）；β-actin（Bioworld，貨 號(hào)：BS6007M）；二抗-羊抗鼠辣根過氧化物酶（Bioworld，貨號(hào)：BS12478）；二抗-羊抗兔辣根過氧化物酶（Bioworld，貨號(hào)：BS13278）。

1.3 主要儀器

壓縮霧化機(jī)（百瑞醫(yī)療科技（常州）有限公司，型號(hào)：BRM-085Ⅱ）；通用電泳儀（BIO-RAD，型號(hào)：PowerPac）；超靈敏多功能成像儀（GE，型號(hào)：Amersham Imager 800 Fluor system）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（BioTek Instruments，Inc.，型 號(hào)：Biotek Epoch 2）；熒光正置顯微鏡（Olympus Corporation，型號(hào)：BX53）。

2 方法

2.1 建立小鼠咳嗽變異性哮喘模型

將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、醋酸潑尼松組、甘草次酸高劑量組、甘草次酸中劑量組和甘草次酸低劑量組，每組8 只。配制致敏劑：取適量生理鹽水，加入氫氧化鋁，充分混勻后得到氫氧化鋁凝膠；在上述凝膠中加入OVA，獲得致敏劑（OVA：1 mg/mL，氫氧化鋁：20 mg/mL）。

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，除空白對(duì)照組外，其余各組于第1、8、15 天腹腔注射0.2 mL 致敏劑，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水。第22 天開始，除空白對(duì)照組外，其余小鼠置于自制的透明霧化箱，通入3%OVA 溶液進(jìn)行霧化激發(fā)。該操作每天實(shí)施1 次，每次30 min，持續(xù)14 d［14-16］。

2.2 給藥

各組小鼠在霧化激發(fā)階段給予藥物干預(yù)，按0.2 mL/10 g 灌胃給藥。甘草次酸高、中、低劑量組的各相應(yīng)濃度分別設(shè)為：20 mg/kg，10 mg/kg 及5 mg/kg，醋酸潑尼松組的藥物濃度為：5 mg/kg，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量生理鹽水。所有給藥均在霧化前30 min 進(jìn)行，1 次/d，持續(xù)14 d。

2.3 小鼠哮喘行為學(xué)觀察

末次霧化30 min 后，觀察各組小鼠的哮喘行為并評(píng)分［17，18］。小鼠哮喘發(fā)作可表現(xiàn)為：精神異常（易驚、煩躁不安或反應(yīng)遲鈍、精神萎靡）、呼吸急促、口唇紫紺、腹肌抽搐、呼吸困難（弓背、腹式呼吸）、抓鼻等，評(píng)分表見表1。

表1 小鼠哮喘行為學(xué)評(píng)分表Tab 1 Mouse asthma behavioral scoring table

2.4 計(jì)算肺臟指數(shù)

記錄小鼠體質(zhì)量。結(jié)扎小鼠肺右主支氣管，分離小鼠右肺，記錄小鼠右肺質(zhì)量，計(jì)算肺臟指數(shù)。小鼠肺臟指數(shù)=右肺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）

2.5 ELISA 法檢測(cè)肺泡灌洗液中OVA-sIgE 的含量

小鼠左肺注入0.1 mL 生理鹽水，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），重復(fù) 2 次。將所得支氣管肺泡灌洗液于4 ℃、2 000 r/min 離心5 min，取上清液保存于-80℃，待進(jìn)一步檢測(cè)。嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒進(jìn)行BALF 中OVA 特異性免疫球蛋白E（OVAsIgE）的檢測(cè)。

2.6 HE 染色觀察肺組織病理學(xué)改變

切除右肺下葉，將其固定在4%多聚甲醛溶液小瓶中。蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肺組織病理學(xué)改變。

將固定好的右肺組織進(jìn)行石蠟包埋、切片。二甲苯溶液和無水乙醇溶液進(jìn)行脫蠟，用乙醇進(jìn)行梯度洗脫，操作重復(fù)兩遍。入蒸餾水中5 min 后取出。蘇木素染液中浸潤(rùn)20 min，流水沖洗15 min，放入1%鹽酸乙醇溶液浸泡至肺組織切片變紅。伊紅染液中浸潤(rùn)5 min，流水沖洗，用低到高濃度乙醇脫水，二甲苯溶液至透明，中性樹膠封片。

2.7 Western Blot 檢測(cè)肺組織中T-bet、IFN-γ、Gata3、IL-4 及IL-13 的蛋白表達(dá)

將適量蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑加入組織裂解液中，混勻后即得裂解緩沖液。取適量右肺上葉，冰上勻漿后加入上述裂解緩沖液中，于冰上裂解30 min 提取總蛋白，隨后于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集離心后的上清液，并加入適量上樣緩沖液，并在100 ℃下加熱10 min。取約10 μg 經(jīng)降解的樣品進(jìn)行凝膠電泳、濕法轉(zhuǎn)印后，將膜取出，于無蛋白快速封閉液中封閉10 min，后分別加入T-bet（1∶500 v/v）、IFN-γ（1∶2 000 v/v）、Gata3（1∶5 000 v/v）、IL-4（1∶1 000 v/v）、IL-13（1∶1 000 v/v）或β-actin（1∶10 000 v/v 的初級(jí)抗體中4℃孵育8～10 h。經(jīng)TBST 洗滌后，用二抗（抗鼠或抗兔，1∶20 000 v/v）常溫孵育膜1 h。采用化學(xué)發(fā)光試劑盒浸泡蛋白條帶，置于超靈敏成像系統(tǒng)中進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。采用Image J 軟件進(jìn)行條帶密度計(jì)算。

2.8 數(shù)據(jù)處理

采用Prism 8.0（GraphPad，USA）軟件進(jìn)行單因素方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以從至少三次獨(dú)立測(cè)試獲得的或median（IQR）表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)

末次霧化30 min 后觀察小鼠哮喘行為，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組小鼠毛發(fā)柔順光澤，精神狀態(tài)較好，活動(dòng)次數(shù)頻繁，呼吸節(jié)律均勻平穩(wěn)，幾乎無哮喘行為學(xué)表現(xiàn)。模型對(duì)照組小鼠則出現(xiàn)毛發(fā)雜亂、呼吸急促、頻繁抓鼻的情況及急躁不安、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍等精神異常行為，哮喘行為學(xué)評(píng)分與空白對(duì)照組相比顯著升高（P＜ 0.01）。醋酸潑尼松組小鼠與模型對(duì)照組相比，哮喘行為有所緩解（P＜ 0.01），精神狀態(tài)稍好，毛發(fā)雜亂程度緩和，活動(dòng)較頻繁，抓鼻頻次降低，呼吸節(jié)律緩和。甘草次酸各給藥組與模型對(duì)照組相比，哮喘行為均有所緩解，精神狀態(tài)稍好，抓鼻頻次降低，呼吸節(jié)律緩和。其中甘草次酸高劑量組哮喘行為學(xué)評(píng)分與模型對(duì)照組相比顯著降低（P＜ 0.05）。各組間小鼠哮喘行為學(xué)評(píng)分統(tǒng)計(jì)見表2。

表2 小鼠哮喘行為學(xué)評(píng)分統(tǒng)計(jì)圖［n=8，median（IQR）］Tab 2 Asthma behavioral scores in mice［n=8，median（IQR）］

3.2 小鼠肺臟指數(shù)

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠肺臟指數(shù)明顯增加（P＜0.01）。給予甘草次酸后，甘草次酸高劑量組和中劑量組的小鼠肺臟指數(shù)明顯降低（P＜0.01），見表3。

表3 小鼠肺臟指數(shù)統(tǒng)計(jì)圖（n=8，）Tab 3 Index of lung（n=8，）

表3 小鼠肺臟指數(shù)統(tǒng)計(jì)圖（n=8，）Tab 3 Index of lung（n=8，）

注：#P＜0.05；##P＜0.01；*P＜0.05；**P＜0.01。

肺臟指數(shù)5.75±0.89 10.63±0.72##6.97±0.73**8.60±0.76##**8.67±1.06##**9.22±1.85##17.85組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組醋酸潑尼松組甘草次酸高劑量組甘草次酸中劑量組甘草次酸低劑量組F給藥劑量(mg/kg)-- 5 2 0 10 5

3.3 肺泡灌洗液中OVA-sIgE 的水平

ELISA 結(jié)果顯示，空白對(duì)照組OVA-sIgE 的水平低，經(jīng)OVA 致敏和霧化激發(fā)后，各組的OVA-sIgE 水平均顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01）。藥物干預(yù)后，與模型對(duì)照組相比，OVA-sIgE 表達(dá)水平均有所下降，其中甘草次酸高劑量組下降明顯，差異有顯著性意義（P＜0.01），見表4。

表4 小鼠肺泡灌洗液中OVA-sIgE 水平（n=8，）Tab 4 OVA-sIgE level in BALF（n=8，）

表4 小鼠肺泡灌洗液中OVA-sIgE 水平（n=8，）Tab 4 OVA-sIgE level in BALF（n=8，）

注：#P＜0.05；##P＜0.01；*P＜0.05；**P＜0.01。

OVA-sIgE 水平0.25±0.03 3.18±0.40##2.14±0.65##**2.14±0.72##**2.65±0.42##2.47±0.61##25.59組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組醋酸潑尼松組甘草次酸高劑量組甘草次酸中劑量組甘草次酸低劑量組F給藥劑量(mg/kg)-- 5 2 0 10 5

3.4 小鼠肺組織病理結(jié)果

HE 染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡上皮光滑，肺內(nèi)幾乎未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)OVA 致敏激發(fā)后，模型對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)不規(guī)則，肺泡腔內(nèi)可見炎性分泌物，部分區(qū)域炎癥灶合并成塊。給藥后，甘草次酸各組肺組織結(jié)構(gòu)均有所改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況減輕，見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織HE 染色結(jié)果（100 ×）Fig 2 HE staining results in each group （100 × ）

3.5 小鼠肺組織中T-bet、IFN-γ、Gata3、IL-4、IL-13的蛋白表達(dá)情況

經(jīng)OVA 誘導(dǎo)，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組Th2 相關(guān)蛋白Gata3、IL-4、IL-13 的表達(dá)均顯著升高（P＜ 0.05 或P＜0.01）。給藥后，Th2 相關(guān)細(xì)胞因子蛋白表達(dá)均降低，其中Gata3 在甘草次酸低劑量組下降明顯（P＜0.01），IL-4 在甘草次酸高劑量組下降明顯（P＜0.05），IL-13 在甘草次酸中劑量組和甘草次酸低劑量組均顯著降低（P＜0.05）。

經(jīng)OVA 誘導(dǎo)，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的Th1 相 關(guān) 因 子IFN-γ 的 表 達(dá) 顯 著 降 低（P＜0.01）。給藥后，甘草次酸組的IFN-γ 蛋白表達(dá)均升高，其中甘草次酸高劑量組顯著升高（P＜ 0.05）。而另一相關(guān)因子T-bet 沒有出現(xiàn)對(duì)等趨勢(shì)，見圖3，表5。

表5 Th1/Th2 相關(guān)因子在肺組織中的蛋白表達(dá)情況（）Tab 5 Protein expressions of Th1/Th2 related factors（）

表5 Th1/Th2 相關(guān)因子在肺組織中的蛋白表達(dá)情況（）Tab 5 Protein expressions of Th1/Th2 related factors（）

注：#P＜0.05；##P＜0.01；*P＜0.05；**P＜0.01。

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組醋酸潑尼松組甘草次酸高劑量組甘草次酸中劑量組甘草次酸低劑量組F給藥劑量(mg/kg)IL-13 0.36±0.20 0.96±0.03#0.66±0.11 0.75±0.14 0.45±0.18*0.37±0.28*3.902-- 5 2 0 10 5 T-bet 0.20±0.07 0.86±0.10##0.57±0.06 0.57±0.18 0.65±0.16 0.61±0.29 3.434 IFN-γ 1.54±0.45 0.58±0.11##1.74±0.70**1.32±0.30*0.95±0.31 0.81±0.10 5.454 Gata3 0.45±0.09 1.25±0.11##0.74±0.13*1.13±0.15##0.89±0.13#0.56±0.24**9.020 IL-4 0.48±0.09 1.27±0.08#0.56±0.18*0.56±0.26*0.68±0.31 0.69±0.22 3.733

圖3 肺組織中WB 條帶Fig 3 WB bands of lung tissue

4 討論

CVA 是一種特殊類型的哮喘，刺激性干咳是其唯一或主要的臨床表現(xiàn)。目前，CVA 的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，由于其病理變化與經(jīng)典哮喘相似，CVA 被認(rèn)為是哮喘的不同階段或進(jìn)展之一，建議按照經(jīng)典哮喘方法進(jìn)行長(zhǎng)期規(guī)范治療。由于CVA 患者多為兒童和青少年，處于身體生長(zhǎng)發(fā)育的黃金階段，其獨(dú)特的生理和病理特征給診斷、治療、用藥安全以及維持正常肺功能和發(fā)育帶來了挑戰(zhàn)。目前，許多化學(xué)藥物在治療哮喘方面均有較好的療效，但仍存在全身性副作用過大、費(fèi)用高昂等缺點(diǎn)。

在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)體系中，天然藥物和天然成分在疾病的預(yù)防和治療中發(fā)揮著重要作用，其中一些藥物可能具有良好的抗哮喘作用，且副作用小。本實(shí)驗(yàn)從甘草次酸調(diào)節(jié)Th1/Th2 平衡的角度出發(fā)，對(duì)甘草次酸的免疫調(diào)節(jié)作用及相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行研究。

因OVA 誘導(dǎo)的模型以Th2 響應(yīng)為特征［19］，可提供Th2 細(xì)胞效應(yīng)功能，以探索可能的Th1/Th2 失衡機(jī)制。因此本研究建立了OVA 誘導(dǎo)的CVA 小鼠模型，研究Th1/Th2 在肺組織中的表達(dá)，探討其機(jī)制。結(jié)果顯示，經(jīng)OVA 致敏激發(fā)后，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組哮喘行為學(xué)評(píng)分顯著升高，肺臟指數(shù)明顯升高，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，BALF 中OVA-sIgE 表達(dá)顯著升高，肺組織中Th2 相關(guān)因子Gata3、IL-4 和IL-13 表達(dá)顯著升高，同時(shí)肺組織中Th1 相關(guān)因子IFN-γ 表達(dá)降低。給予甘草次酸后，與模型對(duì)照組相比，甘草次酸各劑量組哮喘行為學(xué)評(píng)分降低，肺臟指數(shù)降低，OVA-sIgE 表達(dá)水平下降，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；肺Th2 相關(guān)細(xì)胞因子蛋白表達(dá)均降低，肺組織Th1 相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ 蛋白表達(dá)顯著升高。臨床研究表示，哮喘患兒存在明顯的Th1/Th2 細(xì)胞因子失衡情況，患者不僅體內(nèi)的IFN-γ 水 平 降 低，IL-4 水 平 較 高［20］，且 外 周 血 中Th1/Th2 細(xì) 胞 比 值 降 低［21］。有 研 究 表 示 當(dāng)Th1/Th2 型免疫應(yīng)答失衡，可分泌大量的細(xì)胞因子，引起異常的免疫反應(yīng)，Th1 細(xì)胞在呼吸系統(tǒng)的功能低下及Th2 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化是哮喘發(fā)病的基礎(chǔ)。Th2 分泌的特征性細(xì)胞因子IL-4 可誘導(dǎo)IgE 產(chǎn)生嗜酸性粒細(xì)胞并在氣管內(nèi)聚集，導(dǎo)致慢性氣道炎癥反應(yīng)［22］；其分泌的另一細(xì)胞因子IL-13 能通過促進(jìn)黏液分泌和加重氣道高反應(yīng)性而加重哮喘［23］，二者皆可反應(yīng)Th2 的免疫應(yīng)答情況。IFN-γ 則是Th1 特征性細(xì)胞因子，能加強(qiáng)Th1 細(xì)胞的應(yīng)答，降低氣道阻力，從而減輕慢性炎癥，當(dāng)Th2 功能亢進(jìn)時(shí)，Th1 被抑制，IFN-γ 因此分泌減少，一定程度上可反應(yīng)Th1 的免疫應(yīng)答情況［24］。

綜上所述，甘草次酸能通過調(diào)節(jié)CVA 小鼠的Th1/Th2 的失衡從而減輕氣道炎癥，這可能是甘草次酸治療CVA 的機(jī)制之一，為開發(fā)基于甘草次酸治療CVA 的免疫調(diào)節(jié)療法提供了依據(jù)。