弓形蟲(chóng)雞尾酒DNA 疫苗的免疫保護(hù)作用研究

何金靈，杜榮起，鄭淇月，宋淇淇，張東超，通信作者，金天明

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392；2. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300192）

弓形蟲(chóng)又稱剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii，T. gondii），于1908 年由法國(guó)學(xué)者在北非剛地梳趾鼠的肝脾單核細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)[1]，是嚴(yán)格的專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)，幾乎能夠侵染所有溫血?jiǎng)游锏挠泻思?xì)胞[2]。弓形蟲(chóng)病傳播范圍廣，全球約有30%的人口遭受弓形蟲(chóng)威脅[3-4]。雖然大多數(shù)人感染弓形蟲(chóng)癥狀輕微或無(wú)癥狀，但當(dāng)機(jī)體在免疫缺陷情況下（如艾滋病人、器官移植病人或放射治療病人）或妊娠期婦女在孕期感染弓形蟲(chóng)將會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，甚至引發(fā)死亡[5-6]。還有研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲(chóng)感染也可能會(huì)導(dǎo)致自閉癥、精神分裂、精神抑郁等精神性疾病[7-8]。此外，弓形蟲(chóng)病還會(huì)給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展[9]。目前，乙胺嘧啶和磺胺嘧啶聯(lián)合用藥是治療弓形蟲(chóng)病最有效的策略。然而，藥物具有明顯的副作用，且僅能殺滅速殖子階段弓形蟲(chóng)[10]。因此，目前亟需研制安全且有效的弓形蟲(chóng)疫苗來(lái)防控弓形蟲(chóng)病。

棒狀體蛋白（ROPs）是弓形蟲(chóng)入侵宿主早期分泌的一類重要蛋白。其中，ROP5 蛋白是在弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中合成的，可以與ROP17結(jié)合；將ROP5 敲除后弓形蟲(chóng)強(qiáng)毒株將失去毒力，這表明ROP5 是弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中關(guān)鍵的毒力因子[11]。ROP9 蛋白在弓形蟲(chóng)入侵過(guò)程中發(fā)揮重要作用，弓形蟲(chóng)ROP9 基因缺失可導(dǎo)致弓形蟲(chóng)感染力下降[12]。ROP17 能夠磷酸化宿主細(xì)胞的Irgb6 并阻斷其向弓形蟲(chóng)納蟲(chóng)泡聚集，從而使弓形蟲(chóng)逃避巨噬細(xì)胞清除，是ROP2 家族中重要的毒力因子之一[13]。而且，此三種蛋白均具有較好的致病性和免疫原性。因此，ROP5、ROP9 和ROP17可以作為弓形蟲(chóng)疫苗的候選抗原。

本研究通過(guò)構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pVAX1-ROP5、pVAX1-ROP9 和pVAX1-ROP17，混合制成雞尾酒DNA 疫苗，免疫小鼠，檢測(cè)小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，評(píng)估疫苗對(duì)小鼠免疫后攻蟲(chóng)保護(hù)效果。研究結(jié)果將為弓形蟲(chóng)新型疫苗研發(fā)提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 載體、細(xì)胞、蟲(chóng)株和感受態(tài)細(xì)胞

大腸桿菌感受態(tài)DH5α 購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，pVAX1 載體和HE293 細(xì)胞由天津農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，引形蟲(chóng)RH株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)申邦教授惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

48 只18～20 g健康的雄性SPF級(jí)昆明小鼠[許可證編號(hào)：SCXK（京）2017-0005]，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.3 主要試劑

DNA 限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、EcoR I 和BamHⅠ購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。2×TaqMaster Mix 酶、DL2502marker、T4DNA 連接酶均購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司。RIPA 裂解液和Lip2000 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、Flag 標(biāo)簽鼠單克隆抗體IgG均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。小鼠IL-6 ELISA 檢測(cè)試劑盒、小鼠IFN-γ ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中 ROP5（GenBank：EF466101.1）、ROP9（GenBank：XM_002366831.2）和ROP17（GenBank：XM_002365031.1）的基因CDS 序列，分別設(shè)計(jì)其特異性引物，在5＇端添加保護(hù)性堿基和酶切位點(diǎn)序列，下游引物添加標(biāo)簽序列（見(jiàn)表1），引物序列及目的基因CDS 序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成的目的基因連接至pMD19-T 載體。

表1 目的基因的引物序列及PCR條件

1.5 重組真核表達(dá)質(zhì)粒 pVAX1-ROP5/ROP9/ROP17 構(gòu)建

利用選取的DNA 限制性內(nèi)切酶BamH I/Xho I、BamH I/EcoR I 和BamH I/Xho I 分別雙酶切質(zhì)粒pMD-ROP5、pMD-ROP9、pMD-ROP17 和真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1，再根據(jù)膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的基因和pVAX1 載體片段。使用T4DNA 連接酶將回收的目的基因與pVAX1 載體片段連接，并轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取單克隆，進(jìn)行菌液PCR 并測(cè)序驗(yàn)證陽(yáng)性菌。菌液PCR反應(yīng)體系為：1 μL 上游引物F、1 μL 下游引物R、10 μL 2×Taq Master mix、6 μL ddH2O、2 μL 菌液。設(shè)置PCR 條件：94 ℃預(yù)變性5 min，｛94 ℃變性30 s，退火45 s（退火溫度見(jiàn)表1），72 ℃延伸1 min｝，共30 個(gè)循環(huán)，72℃總延伸10 min。將構(gòu)建成功的真核表達(dá)載體分別命名為pVAX1-ROP5、pVAX1- ROP9 和pVAX1-ROP17。

1.6 目的蛋白在真核細(xì)胞中表達(dá)驗(yàn)證

利用質(zhì)粒大提試劑盒分別提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒pVAX1-ROP5、pVAX1-ROP9 和pVAX1-ROP17。取24 μL Lip2 000 分別與4 μg 上述質(zhì)?；靹蚝?，轉(zhuǎn)染至長(zhǎng)有80% HEK293 細(xì)胞的6 孔培養(yǎng)板中，48 h 后加入胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min 離心10 min收集細(xì)胞。用含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液冰上裂解細(xì)胞，制備蛋白樣品。各蛋白樣品進(jìn)行Western blot 檢測(cè)，F(xiàn)lag 標(biāo)簽小鼠單克隆抗體作為一抗，小鼠抗GADPH 單克隆抗體為內(nèi)參蛋白的一抗；HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠作為二抗。

1.7 疫苗混合免疫小鼠

將48 只小鼠隨機(jī)分成3 組，每組16 只，分別為混合免疫組（pVAX1-ROP5、pVAX1-ROP9和pVAX1-ROP17 質(zhì)粒按照1∶1∶1 混合免疫）、空載體組（pVAX1 質(zhì)粒免疫）和生理鹽水組。免疫組和空載體組按照100 μg/只的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行腿部肌肉注射，生理鹽水組進(jìn)行等體積肌肉注射。初次免疫后四周，加強(qiáng)免疫一次。

1.8 血清中抗體水平分析

免疫后，每?jī)芍芪布獠裳淮?，分離血清。從小鼠體內(nèi)收集并純化弓形蟲(chóng)速殖子5×108個(gè)，加入5 mL 1×PBS 重懸蟲(chóng)體，利用超聲破碎儀破碎蟲(chóng)體，獲得全蟲(chóng)抗原，將濃度稀釋為5 μg/mL包被ELISA 酶標(biāo)板。利用間接ELISA 方法檢測(cè)血清中抗體水平，在波長(zhǎng)450 nm 下測(cè)定吸光度值。

1.9 淋巴細(xì)胞增殖分析

加強(qiáng)免疫后兩周，取每組6 只小鼠，處死后，采集脾臟研磨，收集脾細(xì)胞，制成密度為1×107個(gè)/mL 脾細(xì)胞。按照1×105個(gè)細(xì)胞/100 μL/孔將各組脾細(xì)胞加入96 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3 孔重復(fù)。各組分別加入50 μL 全蟲(chóng)抗原刺激，并將96 孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，利用CCK8試劑盒和酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450，并計(jì)算增殖指數(shù)（SI）。

1.10 細(xì)胞因子檢測(cè)

按照1.9 中方法體外培養(yǎng)脾淋巴細(xì)胞，利用全蟲(chóng)抗原刺激脾淋巴細(xì)胞，并收集脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液。利用細(xì)胞因子ELISA 檢測(cè)試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液中IFN-γ 和IL-6 細(xì)胞因子的水平。

1.11 免疫小鼠的攻蟲(chóng)保護(hù)效果

收集和純化感染弓形蟲(chóng)RH 株的小鼠腹腔中的蟲(chóng)體，計(jì)數(shù)后并用1×PBS 將蟲(chóng)體重懸。小鼠加強(qiáng)免疫后14 天，分別對(duì)各組10 只小鼠按500 個(gè)/只的計(jì)量腹腔注射蟲(chóng)體，每日觀察小鼠的狀態(tài)和存活情況。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖，利用雙因素方差分析各免疫組間抗體水平差異，單因素方差分析各免疫組間淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子水平差異，免疫小鼠攻蟲(chóng)后的生存曲線利用Logrank（Mantel-Cox test）和 Gehan-Breslow-Wilcoxon test 方法統(tǒng)計(jì)分析?！?*”表示P＜0.01，為差異極顯著；“*”表示P＜0.05，為差異顯著；P＞0.05，為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

分別對(duì)構(gòu)建的3 種重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證。產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示：pVAX1-ROP5經(jīng)BamH I 和Xho I 雙酶切后，約在1 686 bp 左右出現(xiàn)目的條帶，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)與目的基因ROP5 片段大小完全一致，且無(wú)堿基突變、缺失和增添（圖1A）。pVAX1-ROP9 和pVAX1-ROP17 質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，與pVAX1-ROP5 相似，分別獲得1 128 bp和1 836 bp 大小的條帶，經(jīng)測(cè)序與預(yù)期ROP9 和ROP17 基因片段大小均相符，且無(wú)堿基突變、缺失和增添（圖1B 和圖1C）。

圖1 重組真核表達(dá)載體的雙酶切與PCR 鑒定結(jié)果

2.2 目的蛋白表達(dá)驗(yàn)證

重組質(zhì)粒pVAX1-ROP5、pVAX1-ROP9 和pVAX1-ROP17 轉(zhuǎn)染至HEK293 細(xì)胞后，Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分別在約為62、41 和68 kDa 處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期蛋白分子量大小相符（圖2）。且內(nèi)參蛋白GAPDH 在各轉(zhuǎn)染細(xì)胞中均可檢測(cè)到。

圖2 重組真核表達(dá)質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中表達(dá)的Western blot 驗(yàn)證

2.3 抗體水平檢測(cè)

抗體檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初次免疫時(shí)，混合疫苗組（pVAX1-ROP5/ROP9/ROP17）與生理鹽水組和空載體組（pVAX1）小鼠之間的抗弓形蟲(chóng)抗體IgG 水平差異不顯著（P＞0.05，圖3）；在初次免疫后28天及加強(qiáng)免疫后14 天，混合疫苗組小鼠產(chǎn)生的抗弓形蟲(chóng)抗體IgG 水平均極顯著高于生理鹽水組和空載體組（P＜0.01）。在整個(gè)免疫過(guò)程中，生理鹽水組和空載體組相比，其小鼠產(chǎn)生的抗弓形蟲(chóng)抗體IgG 水平差異均不顯著（P＞0.05，圖3）。

圖3 小鼠免疫后的抗體水平

2.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖分析

小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)全蟲(chóng)抗原刺激后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)混合疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞的SI 值極顯著高于空載體組和生理鹽水組（P＜0.01），且空載體組與生理鹽水組之間差異不顯著（P＞0.05，圖4）。

圖4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平

2.5 細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果

加強(qiáng)免疫14 天后，利用ELISA 試劑盒檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)全蟲(chóng)抗原刺激后產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平。結(jié)果顯示：混合免疫組小鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ 的水平極顯著高于空載體組和生理鹽水組（P＜0.01，圖5A），與其相似，混合免疫組小鼠淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-6 的水平極顯著高于空載體組和生理鹽水組（P＜0.01，圖5B）。無(wú)論是IFN-γ 還是IL-6 水平，在空載體組和生理鹽水組之間差異均不顯著（P＞0.05，圖5A 和圖5B）。

圖5 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)全蟲(chóng)抗原刺激后產(chǎn)生的IFN-γ（A）和IL-6（B）水平測(cè)定結(jié)果

2.6 免疫小鼠的攻蟲(chóng)保護(hù)效果

生理鹽水組和空載體組小鼠在攻蟲(chóng)后第8～10 天內(nèi)全部死亡；而混合疫苗組小鼠攻蟲(chóng)后12天內(nèi)均無(wú)死亡，從第13 天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，直至第19 天全部死亡（圖6）。混合疫苗組小鼠平均存活時(shí)間（16.1±2.07）比空載體組小鼠（9.2±0.74）和生理鹽水組小鼠（9.0±0.77）的平均存活時(shí)間極顯著延長(zhǎng)（P＜0.01）。而且，空載體組和生理鹽水組小鼠之間平均存活時(shí)間差異不顯著（P＞0.05，圖6）。

圖6 免疫小鼠攻蟲(chóng)后的生存曲線

3 討論

弓形蟲(chóng)病是由弓形蟲(chóng)引起的一種全世界范圍內(nèi)的人獸共患食源性寄生蟲(chóng)病，嚴(yán)重威脅著人類和動(dòng)物的健康，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫是預(yù)防和控制傳染病的有效方法[14]。目前，Toxovax?是唯一商品化的弓形蟲(chóng)疫苗，但僅能應(yīng)用于綿羊[15]。當(dāng)前弓形蟲(chóng)疫苗研發(fā)面臨著諸多問(wèn)題，如滅活疫苗免疫保護(hù)力低下、弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)、亞單位疫苗免疫原性低、基因缺失疫苗不成熟等[15]。因此，研發(fā)新型弓形蟲(chóng)疫苗是防控弓形蟲(chóng)病的新思路。本研究構(gòu)建了新型弓形蟲(chóng)雞尾酒DNA 疫苗，并對(duì)其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)、細(xì)胞免疫反應(yīng)及免疫后攻蟲(chóng)保護(hù)效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

當(dāng)前弓形蟲(chóng)疫苗研制有多種類型且免疫策略各異，對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效果各有不同。目前，對(duì)于弓形蟲(chóng)雞尾酒疫苗研制已有報(bào)道，疫苗均表現(xiàn)出較好的免疫效果。KHOSROSHAHI 等[16]用構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1-SAG1-ROP2 和pIL-12 混合免疫小鼠，能夠刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫，且Th1 型細(xì)胞免疫水平（IFN-γ和IL-2 細(xì)胞因子水平）顯著高于單基因?qū)φ战M。王燕娟等[17]將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pShuttle-SAG1、pLVXZsgreenMIC3 和pLVX-rfp-ROP2 混合免疫小鼠，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平顯著高于單基因免疫組小鼠。RAHIMI 等[18]利用構(gòu)建的pcROM4、pcGRA14及佐劑CaPNs 混合免疫小鼠，與單基因?qū)φ战M相比，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的體液免疫，而且小鼠接種弓形蟲(chóng)RH 強(qiáng)毒株后，明顯延長(zhǎng)了存活時(shí)間。本研究將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-ROP5、pVAX1-ROP9 和pVAX1-ROP17 混合免疫小鼠，加強(qiáng)免疫一次后，能夠極顯著提高小鼠抗弓形蟲(chóng)的特異性抗體和細(xì)胞因子水平，極顯著延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間，本疫苗的免疫保護(hù)效果與上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似。

弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白在蟲(chóng)體入侵過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其中，ROP5 是弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的一個(gè)重要毒力因子，研究發(fā)現(xiàn)，用pROP5/ROP7 重組DNA疫苗免疫小鼠可激發(fā)小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并能減少小鼠腦包囊和延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間[19]。ROP9 是弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的早期分泌蛋白，小鼠免疫pVAX1-TgROP9 DNA 疫苗，不但能夠誘導(dǎo)高抗體水平和分泌大量IFN-γ、IL-2，而且接種T. gondiiRH 速殖子小鼠的存活時(shí)間也明顯延長(zhǎng)[20]。ROP17 在弓形蟲(chóng)入侵宿主過(guò)程中與ROP5 和ROP18 協(xié)同發(fā)揮免疫作用，逃避宿主細(xì)胞的殺傷作用， 利用 DNA 疫苗 p3 ×Flag-CMV-14-ROP17 免疫小鼠，可誘導(dǎo)小鼠的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，且可顯著延長(zhǎng)接種強(qiáng)毒RH株弓形蟲(chóng)小鼠的存活時(shí)間[21]。本研究分別將上述三種基因構(gòu)建至真核表達(dá)載體，研制新型雞尾酒DNA 疫苗，以期獲得更優(yōu)的免疫保護(hù)效果。

細(xì)胞免疫在抗弓形蟲(chóng)感染中，尤其是急性感染的早期起到重要作用，感染或適應(yīng)性免疫可刺激機(jī)體T 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生多種細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-6 以及IL-12等）[15]。尤其Th1 型T 淋巴細(xì)胞分泌的IFN-γ 能夠抑制弓形蟲(chóng)繁殖、激活巨噬細(xì)胞、上調(diào)NK 細(xì)胞以及促進(jìn)B 細(xì)胞分泌特異性抗弓形蟲(chóng)抗體，在宿主清除弓形蟲(chóng)感染過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[22]。IFN-γ 還可以上調(diào)免疫相關(guān)GTP 酶和鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白表達(dá)，后者可破壞弓形蟲(chóng)的納蟲(chóng)泡[23]。此外，Th2 型T 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)程中起到調(diào)節(jié)作用，如IL-6 可調(diào)節(jié)B 細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，增強(qiáng)CTL、NK 細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。本研究中雞尾酒DNA 疫苗免疫小鼠，可激發(fā)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力，并且能夠刺激小鼠產(chǎn)生高水平的IFN-γ 和IL-6，此結(jié)果為免疫小鼠產(chǎn)生高水平抗體和免疫小鼠攻蟲(chóng)后存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)提供佐證。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了弓形蟲(chóng)雞尾酒DNA 疫苗pVAX1-ROP5/ROP9/ROP17，免疫小鼠后，能夠激發(fā)小鼠的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并增強(qiáng)小鼠對(duì)弓形蟲(chóng)感染的抵抗能力。