以蘆葦為碳源進(jìn)行靈芝液體菌種發(fā)酵條件的優(yōu)化

劉靜雯，辛世紀(jì)，王竟夷，連潔，黃亮，班立桐

（天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300392）

靈芝（Ganoderma lucidum），屬于多孔菌科（Polyporaceae）靈芝屬（GanodermaKarst.），為一種珍貴的藥用真菌[1-2]。靈芝液體發(fā)酵不僅可以獲得靈芝的主要活性成分，且發(fā)酵后的菌絲體也具有很高的應(yīng)用價(jià)值，經(jīng)干燥處理后的菌絲體可作為輔料加工制成各種保健食品[3]。液體發(fā)酵技術(shù)具有周期短、易操作、成本低等優(yōu)點(diǎn)，通過液體發(fā)酵技術(shù)獲得靈芝菌體更加便利、成本更低，對(duì)于靈芝工廠化生產(chǎn)更便捷[4-5]。

天津市濕地總面積為248 784.8 hm2，占天津市域總面積的20. 9%[6]，其中蘆葦濕地為濕地的重要組成部分。蘆葦具有生長(zhǎng)速度快[7]，耐鹽性高[8]的特點(diǎn)，在維持濕地生態(tài)系統(tǒng)平衡和物種多樣性方面起著重要作用[9]。近年來隨著人類不合理地利用，以蘆葦為造紙?jiān)牧系漠a(chǎn)業(yè)逐漸轉(zhuǎn)型，蘆葦失去了其主體利用價(jià)值，引發(fā)了資源浪費(fèi)和水體富營(yíng)養(yǎng)化[10]等問題。因此，如何科學(xué)、合理利用蘆葦資源，緩解生態(tài)建設(shè)與經(jīng)濟(jì)效益的矛盾是當(dāng)前亟需要解決的問題。

蘆葦秸稈中富含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素[11]，可作為靈芝生長(zhǎng)所需碳源。將蘆葦秸稈應(yīng)用到靈芝液體培養(yǎng)中，優(yōu)化靈芝液體培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，根據(jù)菌絲體產(chǎn)量?jī)?yōu)化其發(fā)酵工藝，既解決了蘆葦資源浪費(fèi)、污染環(huán)境的問題，又為靈芝液體培養(yǎng)提供了新的原料，為蘆葦-靈芝液體發(fā)酵技術(shù)的開發(fā)提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

泰山靈芝G8，保藏于天津農(nóng)學(xué)院食用菌研發(fā)中心。

1.1.2 秸稈來源及處理

蘆葦秸稈來源：天津市薊州區(qū)于橋水庫前置庫。

水稻秸稈來源：遼寧省遼陽市燈塔市。

玉米、小麥秸稈來源：天津市寧河區(qū)優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)示范中心基地。

秸稈預(yù)處理：105 ℃殺青2 h，后80 ℃烘干至恒重，自然冷卻至室溫后，粉碎過60目篩備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，KH2PO41 g，MgSO40.5 g，VB10.1 g，瓊脂20 g。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖3%，蛋白胨1%，KH2PO40.15%，MgSO40.075%，pH 自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲干重測(cè)定

取樣經(jīng)濾紙過濾，將過濾所得菌絲置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，計(jì)算菌絲干重。

1.2.2 菌絲生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

接種后靜置1 d 后放至25 ℃，150 r/min 搖床培養(yǎng)。于第4 天開始取樣，計(jì)算菌絲干重。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲干重為縱坐標(biāo)繪制菌絲生長(zhǎng)曲線，并根據(jù)生長(zhǎng)曲線確定取樣時(shí)間。

1.2.3 單因素篩選

（1）秸稈種類：分別添加蘆葦、水稻、玉米、小麥秸稈，添加量為0.5%，7 d 后測(cè)定菌絲干重。

（2）蘆葦秸稈添加量：分別添加0%、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%蘆葦秸稈，測(cè)定菌絲干重，以確定最佳蘆葦秸稈添加量。

（3）pH：設(shè)置不同pH 梯度，分別為3、4、5、6、7，測(cè)定菌絲干重，確定最佳pH。

（4）氮源篩選：分別添加10 g/L 的蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、酵母浸粉進(jìn)行靈芝液體培養(yǎng)，7 d 后測(cè)定菌絲干重。

（5）氮源添加量：確定酵母浸粉為最佳氮源，分別添加不同氮源添加量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，7 d 后測(cè)定菌絲干重。

（6）溫度：分別設(shè)置不同溫度為23、25、27、29、31 ℃，7 d 后測(cè)定菌絲干重。

（7）轉(zhuǎn)速：分別設(shè)置不同轉(zhuǎn)速為110、130、150、170、190 r/min，7 d 后測(cè)定菌絲干重。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素篩選試驗(yàn)確定以酵母浸粉為氮源，以蘆葦秸稈添加量、氮源添加量、pH 值為研究因素，設(shè)計(jì)L9（33）的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝菌絲生長(zhǎng)曲線

靈芝菌絲隨時(shí)間生長(zhǎng)情況如圖1 所示。由圖1可見，0～6 d 為生長(zhǎng)遲緩期，6～7 d 為快速生長(zhǎng)期，菌絲生長(zhǎng)迅速，7 d 后進(jìn)入穩(wěn)定期。根據(jù)菌絲生長(zhǎng)曲線確定最佳取樣時(shí)間為第7 天。

圖1 靈芝生長(zhǎng)曲線

2.2 單因素篩選試驗(yàn)

2.2.1 添加不同秸稈對(duì)靈芝生長(zhǎng)的影響

由圖2 可知，添加不同種類的秸稈作為培養(yǎng)基碳源對(duì)靈芝生長(zhǎng)產(chǎn)生不同影響，其中添加蘆葦秸稈的培養(yǎng)基中靈芝菌絲干重大于其他處理，菌絲干重大小順序依次為：蘆葦秸稈（4.33 g/L）＞水稻秸稈（3.82 g/L）＞對(duì)照組（3.73 g/L）＞小麥秸稈（3.3 g/L）＞玉米秸稈（2.1 g/L）。因此，選擇蘆葦秸稈作為培養(yǎng)基碳源。

圖2 不同秸稈碳源對(duì)菌絲干重的影響

2.2.2 蘆葦秸稈添加量對(duì)泰山靈芝液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響

碳源作為靈芝生長(zhǎng)最主要的營(yíng)養(yǎng)部分，對(duì)其生長(zhǎng)進(jìn)程起著十分關(guān)鍵的作用。由圖3 可見，隨著蘆葦秸稈添加量的增加，菌絲干重呈先升高后降低的趨勢(shì)，在蘆葦秸稈添加量為0.3%～1.0%時(shí)，菌絲產(chǎn)量較高，當(dāng)蘆葦秸稈添加量為0.5%時(shí)，菌球數(shù)量較多且大小均勻，菌絲干重達(dá)到最大值，為10.92 g/L。故選擇蘆葦秸稈添加量為正交試驗(yàn)的因素。

圖3 蘆葦秸稈添加量對(duì)菌絲干重的影響

2.2.3 pH 對(duì)泰山靈芝液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖4 所示，在pH＝5 時(shí)，泰山靈芝菌絲產(chǎn)量高于其他pH 條件下的菌絲干重，菌絲產(chǎn)量達(dá)到最高，為11.47 g/L，故選擇pH 為正交試驗(yàn)的因素之一。

圖4 pH 對(duì)菌絲干重的影響

2.2.4 氮源對(duì)泰山靈芝液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖5 可知，靈芝液體發(fā)酵時(shí)對(duì)各種氮源的利用情況不同，其中尿素、硝酸銨利用效率較低，而靈芝菌絲對(duì)于遲效的有機(jī)氮源如蛋白胨與酵母浸粉的利用效率更高，其中，以酵母浸粉為氮源的組別菌絲干重最高，達(dá)11.57 g/L。因此，酵母浸粉更加有利于靈芝菌絲的生長(zhǎng)。

圖5 不同氮源種類條件下菌絲干重

2.2.5 氮源添加量對(duì)泰山靈芝液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖6 可知，當(dāng)酵母浸粉添加量為1%時(shí)對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)最有利，菌絲干重最高為11.58 g/L。菌絲在不同氮源條件下的生長(zhǎng)速率以及在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物含量不同。因此，篩選合適的氮源對(duì)于提高靈芝菌絲產(chǎn)量十分重要，故選擇氮源添加量作為正交試驗(yàn)的研究因素。

圖6 酵母浸粉添加量對(duì)菌絲干重的影響

2.2.6 轉(zhuǎn)速對(duì)泰山靈芝液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響

轉(zhuǎn)速的改變可以導(dǎo)致溶氧與剪切力的變化，溶氧對(duì)菌體生長(zhǎng)和積累代謝產(chǎn)物都有較大影響，溶氧過低過高都會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)造成不良影響[12]，而攪拌剪切力對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響也十分顯著[13]。由圖7 可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速為150 r/min 時(shí)，最適宜菌絲生長(zhǎng)，此時(shí)菌絲干重達(dá)10.48 g/L。

圖7 轉(zhuǎn)速對(duì)菌絲干重的影響

2.2.7 溫度對(duì)泰山靈芝液體培養(yǎng)菌絲生長(zhǎng)的影響

溫度會(huì)影響微生物的新陳代謝，對(duì)機(jī)體酶促反應(yīng)有極大影響，因此，溫度對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)和代謝物的積累至關(guān)重要[14]。由圖8 可知，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，菌絲干重最高達(dá)11.23 g/L，這與汪金萍等[15]所得28 ℃為最優(yōu)培養(yǎng)溫度的結(jié)果不同。

圖8 溫度對(duì)菌絲干重的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)結(jié)果分析如表2 所示。R值的大小反映了該因子對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度。影響試驗(yàn)結(jié)果的各因素順序?yàn)椋禾J葦秸稈添加量＞pH＞氮源添加量。最佳培養(yǎng)基配方為A2B3C3，即蘆葦秸稈添加量0.5%，酵母浸粉添加量1.5%，pH 為6。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見表3，表明蘆葦秸稈添加量對(duì)靈芝液體培養(yǎng)產(chǎn)菌絲有顯著性差異，氮源添加量、pH 對(duì)靈芝液體培養(yǎng)產(chǎn)菌絲具有極顯著性差異。

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)篩選出的組合進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖9所示。經(jīng)測(cè)定，在組合為A2B3C3的條件下培養(yǎng)，菌絲干重為12.20 g/L，該結(jié)果與基礎(chǔ)培養(yǎng)基結(jié)果相比有所提高，且菌球小而緊實(shí)，分散均勻。

圖9 驗(yàn)證試驗(yàn)

利用液體菌種進(jìn)行栽培試驗(yàn)，由于優(yōu)化后的靈芝液體菌種菌絲產(chǎn)量高、菌球小、分散均勻、萌發(fā)點(diǎn)多，較優(yōu)化前可減少靈芝子實(shí)體栽培所需接種量。優(yōu)化后所需接種量與正常所需接種量出芝情況相同，經(jīng)檢測(cè)，栽培料子實(shí)體平均產(chǎn)量為54.58 g/kg，收獲的靈芝子實(shí)體見圖10。可見本試驗(yàn)篩選的配方可以實(shí)現(xiàn)靈芝的正常出芝，具有良好的推廣價(jià)值。

圖10 靈芝子實(shí)體

3 討論與結(jié)論

靈芝生長(zhǎng)代謝過程中的主要物質(zhì)包含碳源，碳源是構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的基本元素，為菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育提供了基本能量[16]，靈芝菌絲體生長(zhǎng)過程中對(duì)于不同的碳源的利用效率不同[17]。蘆葦秸稈作為一種復(fù)合有機(jī)物質(zhì)，不僅為靈芝菌絲體提供生長(zhǎng)所需的碳源，也為靈芝液體發(fā)酵提供其他所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。低剪切力影響發(fā)酵液混合以及氧傳遞，導(dǎo)致溶氧量降低[18]，從而使菌絲產(chǎn)量降低，加入蘆葦秸稈后搖瓶中的剪切力大大增加，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比菌絲產(chǎn)量顯著提高了135%。真菌生長(zhǎng)過程中離不開氮源，與無機(jī)氮源相比，靈芝對(duì)有機(jī)氮源的利用效率更高，因此氮源的選擇與添加量也是影響靈芝菌絲生長(zhǎng)的重要因素。選擇酵母浸粉作為靈芝液體發(fā)酵的氮源，并通過調(diào)節(jié)酵母浸粉添加量來篩選最適宜靈芝液體發(fā)酵的培養(yǎng)基氮源，這與馮杰等[19]所研究的以酵母自溶粉作為發(fā)酵的氮源最優(yōu)結(jié)果相同。pH 會(huì)對(duì)靈芝細(xì)胞膜的通透性造成影響，在代謝調(diào)控中也發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用，因此，pH 會(huì)導(dǎo)致靈芝液體發(fā)酵中生物量的不同[20-21]。此次通過正交試驗(yàn)篩選出最適宜靈芝液體發(fā)酵的pH 為6，這與凌慶枝等[22]與潘江安等[23]研究發(fā)現(xiàn)菌絲體生長(zhǎng)的最適pH 為偏酸性結(jié)果相近。

本研究首次添加蘆葦秸稈進(jìn)行靈芝液體菌種發(fā)酵培養(yǎng)，條件優(yōu)化后的靈芝菌絲體產(chǎn)量可達(dá)12.20 g/L，是優(yōu)化前的1.51 倍，具有良好的菌絲球形成效果，有助于栽培后的出芝，孢子粉產(chǎn)量也較高。研究結(jié)果為蘆葦秸稈資源利用及靈芝液體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和試驗(yàn)指導(dǎo)。