貴定縣某養(yǎng)鵝場雛鵝死亡病例診斷

張美蘭，冉崇波，杜小敏

貴定縣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心，貴州貴定 551300

隨著畜牧業(yè)大力發(fā)展，各種鵝類傳染病流行情況越來越復(fù)雜，發(fā)病率也不斷升高，其中大腸桿菌病、沙門氏菌病和葡萄球菌病等為近年來雛鵝常見的傳染病[1,2]。貴定縣鵝場飼養(yǎng)的4 日齡鵝苗中，部分出現(xiàn)精神沉郁、神態(tài)恍惚、機(jī)體消瘦、羽毛污濁、食欲減少或廢絕、飲水增多、肛門周圍及后軀被糞便污染、拉白痢等癥狀。養(yǎng)殖戶憑以往經(jīng)驗最開始采用青霉素治療，但患病雛鵝病情不見好轉(zhuǎn)，反而持續(xù)惡化。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

貴定縣某鵝場患病雛鵝相關(guān)病料。

1.2 實驗主要試劑與儀器

試劑：草酸銨結(jié)晶紫，蒸餾水，碘液，乙醇，番紅，Marker，MIX，PBS，模板，引物，LB 液體培養(yǎng)基，TBE、1.2%瓊脂糖凝膠。

儀器：PCR 自動擴(kuò)增儀（TC-412），超凈工作臺（SW-CJ-2D），恒溫?fù)u床，自動雙重純水整流器（SZ-93 型），DYY-10 型（ECP3000）三恒電泳儀；SYGENE 凝膠成像儀。

2 實驗方法

2.1 臨床癥狀與病理變化觀察

對患病雛鵝進(jìn)行臨床癥狀觀察，將雛鵝呈仰臥式固定在解剖臺上，依次檢查內(nèi)部各個器官的病理變化。

2.2 細(xì)菌分離鑒定

2.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純培養(yǎng)

用接種環(huán)蘸取少許病料，在瓊脂表面進(jìn)行來回劃線，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后觀察。然后接種于普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板和麥康凱平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)。

2.2.2 細(xì)菌染色鏡檢

涂片、干燥、固定、革蘭氏染色、鏡檢后詳細(xì)觀察。

2.2.3 生化試驗

將微量生化反應(yīng)管內(nèi)液體搖晃均勻后撇成兩段，用接種環(huán)挑取純化后的細(xì)菌接種到有字體標(biāo)識的反應(yīng)管內(nèi)，另一只作為對照組，做好標(biāo)記依次排列在凹孔泡沫板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

2.2.4 PCR 鑒定

2.2.4.1 16S rRNA 基因序列分析

由貴州大學(xué)動物疫病研究室提供細(xì)菌通用引物序列，上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；下游引物1492R ：5'-TACGGTTACCTTGTTACGA CTT -3'。

利用16S rRNA 通用引物對分離培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行擴(kuò)增和測序，將分離菌株命名為GD。試驗采用50 μL 體系。上、下游引物分別為2.5/μL，MIX 25/μL，模板5/μL，超純水15/μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火為1 min，72 ℃延伸2 min，共30 個循環(huán)，72 ℃終延伸5 min,最后4 ℃保存。

2.2.4.2 特異性引物PCR 擴(kuò)增

挑取單個菌落，接種LB 液體培養(yǎng)基，作好標(biāo)記放置37 ℃搖床培養(yǎng)12 h，取菌液用貴州大學(xué)動物疫病研究室提供的大腸桿菌特異性引物上游引物F:5'-GCAAACAGGATTAGATACCC-3'；下游引物R:5'-CAGCCATGCAGCACCTGTCTCAC-3'進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，試驗采用50 μL 體系。上游引物2.5/μL，下游引物2.5/μL，MIX 25/μL，模板5/μL，超純水15/μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性40 s，57 ℃時退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35 個循環(huán)，72 ℃終延伸7 min，最后4 ℃保存。

PCR 擴(kuò)增期間，用錐形瓶配置1.2%瓊脂糖溶液，微波爐加熱至透明，搖勻后倒入電泳板中靜置約20 min，冷卻后把瓊脂糖塊放入電泳槽中，倒入適量的1×TBE 緩沖液，分別取10 μL D2000Marke 和PCR 產(chǎn)物用于加樣，進(jìn)行電泳35 min 后，取出瓊脂糖凝膠，放置于電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)中成像。

2.2.5 藥敏試驗

用鑷子夾取藥敏紙片平放于瓊脂平板表面，輕壓貼緊，做好標(biāo)記，于37 ℃恒溫箱培育24 h，取出觀察測定藥物的抑菌大小。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 臨床癥狀與病理觀察

患病雛鵝機(jī)體瘦弱，精神萎靡，食欲衰退，呼吸障礙，目腫流淚，雙腿軟弱無力，羽毛松亂污濁，脫水，排白色或綠色糞便，排泄物中混有未消化的飼料，肛門周圍羽毛被糞水污染，干涸后阻礙排糞。通過解剖觀察發(fā)病雛鵝，肝臟腫大，變黃，出血；臟器表面有淡黃色的纖維素性滲出物；腸內(nèi)容物堆積，腸內(nèi)產(chǎn)氣。

3.2 細(xì)菌分離鑒定

觀察到普通瓊脂平板和鮮血瓊脂平板上皆有菌落生長，呈乳白色、扁平、光滑、圓潤、邊緣整齊的中小菌落，在麥康凱瓊脂平板上長出粉紅色菌落；染色鏡檢為兩端鈍圓、中等大小的革蘭氏陰性桿菌。

3.3 生化試驗

分離菌株能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵棉子糖、山梨醇、木糖試驗為陽性。

3.4 PCR 鑒定

3.4.1 16S rRNA 基因序列分析

凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物片段1 451 bp大小一致。將PCR 產(chǎn)物切膠回收后測序，測序之后拼接得到有效完整序列,將其命名為GD。而后與NCBI 上其他參考株16S rDNA 基因進(jìn)行序列相似性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果顯示GD 菌株與大腸桿菌的NR_114042 序列的score 值為2433，相似度97.63%，同源性較好，根據(jù)得到的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及Bootstrap 值可以看出，GD 菌株與大腸桿菌菌株的親緣關(guān)系最近，菌株GD 應(yīng)同屬于大腸桿菌。

3.4.2 特異性引物PCR 擴(kuò)增

特異性引物PCR 擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物片段275 bp 大小一致。

3.5 藥敏試驗

所測藥物中，對丁胺卡那和米諾環(huán)素高度敏感，對氧氟沙星、環(huán)丙沙星和多西環(huán)素中度敏感，新霉素、慶大霉素、四環(huán)素和頭孢唑林等不敏感。

4 討論

鵝大腸桿菌病是由條件致病性大腸埃希氏桿菌引起的局部或全身發(fā)病的細(xì)菌性傳染性疾病，包括大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌性肉芽腫、氣囊炎和肝周炎等一系列疾病[3，4]。這些疾病可獨立發(fā)生，也可混合感染或繼發(fā)其它疾病共同流行[5]。飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)條件、應(yīng)激等因素都可誘發(fā)該病的發(fā)生，且發(fā)病急，發(fā)病率較高，常發(fā)生在春冬和秋末季節(jié)，是危害養(yǎng)鵝業(yè)的主要細(xì)菌性傳染病之一[6,7]。該病的主要傳播源是患病雛鵝和帶菌雛鵝；傳播途徑主要為呼吸道、消化道、交配等感染[8]；發(fā)病原因多為鵝舍環(huán)境衛(wèi)生差、空氣污濁灰塵多、不重視消毒預(yù)防等[9]。應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、保持干凈衛(wèi)生飼養(yǎng)環(huán)境、做好免疫接種，有效預(yù)防該病流行[10，11]。

5 結(jié)論

5.1 觀察患病雛鵝的臨床癥狀與病理變化，并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、16 SrRNA 基因擴(kuò)增和特異性PCR 擴(kuò)增，診斷結(jié)果為大腸桿菌感染所致。

5.2 由藥敏試驗得知，對該鵝場可選用丁胺卡那、米諾環(huán)素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等進(jìn)行預(yù)防治療。