鵝源金黃色葡萄球菌分離鑒定及其診治分析

呂順燕,江琳,王喜,李珂,常志順,信愛(ài)國(guó)*

(1.昆明市東川區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南 昆明 654100; 2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所,云南 昆明 650224; 3.瑞麗市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南 瑞麗 678600)

葡萄球菌(Staphylococcus)是一種革蘭氏陽(yáng)性菌,菌體多呈葡萄串狀樣排列,無(wú)運(yùn)動(dòng)性,無(wú)鞭毛,不會(huì)形成芽孢。該菌廣泛分布在土壤、空氣、飼料、飲水及飼養(yǎng)環(huán)境中,健康鵝的羽毛、皮膚表面、腸道以及糞便中。鵝葡萄球菌病多數(shù)病例由金黃色葡萄球菌引起傳染性關(guān)節(jié)炎,主要通過(guò)直接接觸或通過(guò)皮膚、損傷的黏膜及呼吸道等途徑感染[1]。鵝葡萄球菌病臨床癥狀主要有急性和慢性兩種:急性病例主要是一個(gè)月至兩個(gè)半月的雛鵝較為多發(fā),常表現(xiàn)為發(fā)病急、死亡率高,精神沉郁,食欲不振,翅膀無(wú)力下垂、羽毛蓬松,胸腹部皮下充血、水腫,一般病程為2～6 d,常發(fā)生敗血癥死亡[2];慢性病鵝常在跗、趾、掌關(guān)節(jié)處表現(xiàn)發(fā)炎腫脹以及站立困難、伏地不愿行動(dòng)、跛行和腹瀉等,因久臥導(dǎo)致胸部龍骨上發(fā)生漿液性滑膜炎,病程可達(dá)2～3周,最后因難以采食而極度饑渴死亡[3]。鵝葡萄球菌病通過(guò)空氣傳播,感染能力強(qiáng)、致死率高,近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。

2022年10月,東川區(qū)某養(yǎng)鵝場(chǎng)雛鵝出現(xiàn)精神不振、關(guān)節(jié)腫大、跛行等癥狀,后陸續(xù)發(fā)生死亡,對(duì)送檢的3批次病鵝進(jìn)行診斷,最終確診為致病性金黃色葡萄球菌感染。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2022年10月,東川區(qū)某養(yǎng)鵝場(chǎng)自外地購(gòu)進(jìn)雛鵝4 000只,飼養(yǎng)10 d后,出現(xiàn)精神不振、關(guān)節(jié)腫大、跛行、腹瀉等癥狀,陸續(xù)死亡400只,死亡率達(dá)10%。經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查及病理剖檢后,采集樣品送至云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行診斷。實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物科技(北京)有限公司,2×San Taq PCR Mix購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司,LB肉湯、LB瓊脂、微量生化鑒定管購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,抗生素藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將病鵝剖檢后,無(wú)菌采集其腦組織、關(guān)節(jié)腔膿液、肝臟等分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中,經(jīng)過(guò)37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后,從平板上挑取單個(gè)典型菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)并保存,然后將純化培養(yǎng)后的細(xì)菌劃線接種于含血瓊脂的平板并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,觀察細(xì)菌血瓊脂平板生長(zhǎng)情況及細(xì)菌形態(tài)。

1.4 細(xì)菌生化鑒定

按照細(xì)菌微量生化鑒定管使用說(shuō)明書,挑取具有典型的金黃色有透明溶血環(huán)的菌體接種于不同的生化管中,37 ℃恒溫培養(yǎng)一定時(shí)間后,按說(shuō)明書進(jìn)行觀察并判定反應(yīng)結(jié)果。

1.5 細(xì)菌16S rRNA鑒定

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書,提取分離菌基因組DNA。參照文獻(xiàn)[4]對(duì)細(xì)菌16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果采用DNA Star 6.0軟件拼接,得到細(xì)菌相應(yīng)16S rRNA序列,將序列提交GenBank進(jìn)行Blast比對(duì),并利用 MEGA 7.0 根據(jù) NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,確定細(xì)菌的種屬分類。

1.6 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下,采用K-B紙片擴(kuò)散法選取頭孢噻肟、強(qiáng)力霉素等18種藥敏試紙對(duì)分離菌株的藥物敏感性進(jìn)行測(cè)定,將藥敏試紙片貼于涂布有適量新鮮菌液的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,放置恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)15h后觀察并測(cè)量抑菌圈大小,判斷標(biāo)準(zhǔn)按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn)

將12只(30±2)g小白鼠按每組4只分成2個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)空白對(duì)照組,2個(gè)試驗(yàn)組分別腹腔注射0.2 mL終濃度為1.2×109CFU/mL的菌液、1.2×1010CFU/mL的菌液,空白對(duì)照組注射同等體積無(wú)菌生理鹽水,分籠正常飼養(yǎng),觀察記錄小鼠發(fā)病及死亡情況,死亡小鼠立即進(jìn)行剖檢,無(wú)菌挑取肝臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀及剖檢變化

不同日齡的發(fā)病鵝均表現(xiàn)為精神不振,腹部伏地、難以正常穩(wěn)定站立,跛行或雙腳一前一后呈滑水狀,部分關(guān)節(jié)腫脹,按壓有波動(dòng)感,關(guān)節(jié)囊內(nèi)有漿液性或膿性滲出物,生長(zhǎng)緩慢形成僵鵝等。初步判斷疑似因飼養(yǎng)管理、飼料營(yíng)養(yǎng)及應(yīng)激等不良因素引起的條件性致病病原體導(dǎo)致發(fā)病。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)過(guò)細(xì)菌分離及單菌落純化培養(yǎng),該細(xì)菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上形成卵圓形、凸起、濕潤(rùn)、表面光滑的菌落,初期呈灰白色,后逐漸變成金黃色。菌株在血瓊脂平板上形成較大的菌落且菌落周圍產(chǎn)生明顯的β溶血環(huán)。革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性,菌體形態(tài)呈葡萄串狀排列,沒(méi)有莢膜,未形成芽孢,符合金黃色葡萄球菌的形態(tài)特性。

2.3 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

分離株在半固體瓊脂無(wú)擴(kuò)散生長(zhǎng)、氰化鉀培養(yǎng)基不生長(zhǎng),山梨醇、尿素等為陰性反應(yīng),乳糖、麥芽糖等為陽(yáng)性反應(yīng)(表1),符合葡萄球菌屬生化特征,初步判斷為金黃色葡萄球菌,命名為YNSA001-2022。

表1 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 細(xì)菌16S rRNA 鑒定結(jié)果

3對(duì)16S rRNA 引物均擴(kuò)增到目的片段(圖1),產(chǎn)物測(cè)序拼接后獲得 1 426 bp 的序列。Blast比對(duì)分析結(jié)果顯示,分離株 16S rRNA 序列與 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中多數(shù)金黃色葡萄球菌參考株的同源性達(dá)100%。用MEGA 7.0根據(jù) NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,以表皮葡萄球菌 (S.epidermidis)和腐生葡萄球菌(S.saprophyticus) 參考株為外源,結(jié)果顯示(圖2),分離菌株16S rRNA 基因與金黃色葡萄球菌參考株聚為一簇,親緣關(guān)系最近,判定分離菌為鵝源金黃色葡萄球菌。

M:DL2000 DNA marker;1-3:依次為16S rRNA基因序列27F-519R段、357F-1115R段和926F-1492R段。

圖2 分離株16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)18種藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果:分離菌株對(duì)頭孢噻肟、阿米卡星等敏感,對(duì)強(qiáng)力霉素、慶大霉素等中度敏感,對(duì)氨芐西林、大觀霉素等具有耐藥性(表2)。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠在接種12h后,開始表現(xiàn)出精神萎靡、被毛雜亂、昏睡呆滯等臨床癥狀,2d內(nèi)全部死亡,對(duì)照組全部健活。從死亡小鼠肝臟分離出的細(xì)菌,經(jīng)鑒定與接種菌株一致。

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種重要的人獸共患病原菌,隸屬于葡萄球菌屬,是一種寄生于宿主體表的條件性致病菌,是食品中的重要微生物檢測(cè)指標(biāo),在自然界中廣泛存在。周厚德等[5]的研究發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌在肉與肉制品中的檢出率較高,達(dá)11.27%,且生肉中的檢出率(19.41%)遠(yuǎn)高于熟肉(4.91%),金黃色葡萄球菌不僅污染畜禽飼養(yǎng)、屠宰、運(yùn)輸和銷售等各個(gè)環(huán)節(jié),在熟肉制品加工、銷售過(guò)程被污染的情況也不少。我國(guó)作為世界上鵝產(chǎn)品生產(chǎn)與消費(fèi)大國(guó),加強(qiáng)鵝養(yǎng)殖生產(chǎn)中各環(huán)節(jié)金黃色葡萄球菌的監(jiān)測(cè),可有效防止該病原菌給人類健康安全帶來(lái)嚴(yán)重危害。氣候突變、潮濕多雨、鵝只受到應(yīng)激、抵抗力下降、皮膚損傷等容易誘發(fā)該病[6]。另外,飼養(yǎng)管理不當(dāng)、孵化室環(huán)境不衛(wèi)生、種蛋消毒不徹底、外殼污穢等易使葡萄球菌通過(guò)蛋殼孔隙進(jìn)入蛋內(nèi),使胚胎感染,小鵝孵化時(shí)由臍帶感染,常因臍炎和發(fā)生葡萄球菌性敗血癥而造成大批死亡,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)持續(xù)健康發(fā)展有一定的影響,該病的死亡率可達(dá)5%～10%[7]。對(duì)鵝葡萄球菌病的診斷,僅僅根據(jù)臨床癥狀、病理剖檢和染色鏡檢是不足以確診的,還需要結(jié)合細(xì)菌分離、細(xì)菌16S rRNA 等分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)診斷才能最終確診。另外,金黃色葡萄球菌對(duì)許多抗生素具有耐藥性,吳瑩瑩[8]對(duì)從住院患者所分離的金黃色葡萄球菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌對(duì)氨芐西林、青霉素和紅霉素等具有耐藥性,本次分離的鵝源菌株同樣對(duì)這些抗生素具有耐藥性。對(duì)分離菌株及時(shí)開展藥物敏感性實(shí)驗(yàn),為該場(chǎng)在診療、防治方面提供了科學(xué)的依據(jù)。同時(shí),科學(xué)防治金黃色葡萄球菌感染對(duì)保障動(dòng)物源性食品安全具有重要的獸醫(yī)公共衛(wèi)生意義。

4 防治措施

4.1 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

對(duì)種蛋及孵化過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格消毒;養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)實(shí)行全進(jìn)全出的單一飼養(yǎng)管理模式,加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和無(wú)菌意識(shí),嚴(yán)格執(zhí)行生物安全防控措施;進(jìn)鵝前應(yīng)對(duì)鵝舍進(jìn)行徹底消毒,進(jìn)鵝后定期進(jìn)行帶鵝消毒。鵝舍應(yīng)保持通風(fēng)干燥,給予全價(jià)飼料及青綠飼料,適時(shí)補(bǔ)充維生素及微量元素,保持水源清潔。適宜的飼養(yǎng)密度,防止擁擠,合理分群,盡量減少應(yīng)激,嚴(yán)防鵝只受傷,適時(shí)清理糞肥及更換墊料,減少疾病傳播;嚴(yán)格淘汰感染動(dòng)物等綜合技術(shù)手段。

4.2 藥物治療

發(fā)病后應(yīng)盡早處理,嚴(yán)格封鎖和消毒,選用敏感藥物對(duì)全群進(jìn)行治療,常用藥物有頭孢噻呋注射液,每千克體重5～6mg,2次/d,肌內(nèi)注射,連用3d;或阿米卡星、新霉素(按說(shuō)明書劑量)等進(jìn)行拌料投喂[9,10]。