流速對草魚幼魚抗氧化性能的影響

朱杰胄，梁驍，李婧鈺，湯蓉，李莉，李大鵬，張曦

（1.嘉興市漁業(yè)管理服務站，浙江 嘉興 314050；2.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實驗教學示范中心，長江經(jīng)濟帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室，湖北 武漢 430070；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學院水生生物研究所，浙江 杭州 310021）

近年來，隨著人類合理膳食營養(yǎng)意識的普及，對高營養(yǎng)價值的蛋白需求日益增加。魚類的主要食用部分肌肉是富含多不飽和脂肪酸（PUFA）和平衡氨基酸的優(yōu)質蛋白源[1]。但在魚類養(yǎng)殖過程中容易遭受氧化應激，大量產(chǎn)生的活性氧ROS 會導致DNA、類固醇成分以及細胞膜不飽和脂質的過氧化，損傷器官[2]。而魚類肌肉中這種脂質氧化會損失膜功能和流動性，最終導致魚體營養(yǎng)的缺失，影響魚體的生長及品質[3]。

生物和非生物因素影響魚類抗氧化防御反應。魚類的行為和環(huán)境因素，例如食物種類、溫度、溶解氧、環(huán)境毒素、寄生蟲等，均可以增強或減弱抗氧化能力[4]。酶促抗氧化防御主要是由SOD、GSH-Px 以及CAT 完成。其中CAT 和GSH-PX 是機體酶促抗氧化系統(tǒng)中的重要酶類，用以清除體內過量的ROS[5,6]。SOD 通過促進O2-轉變?yōu)镠2O2的方式來清除體內的O2-[7]。T-AOC 用以衡量機體的抗氧化能力，反映其清除自由基的能力[8]。游泳運動是貫穿魚類生活史的行為運動，對維持魚類生命活動具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，游泳訓練能促進養(yǎng)殖魚類的生長，通過適宜的水流速度可誘導養(yǎng)殖魚類游泳運動，提高攝食及非特異性免疫等[10-13]，而這均與機體抗氧化能力的提升密切相關[4]。對軟骨魚類與硬骨魚類的研究發(fā)現(xiàn)，魚類抗氧化能力取決于游泳性能的強弱，而不是其進化關系[14]?？梢姡斡具\動對養(yǎng)殖魚類抗氧化能力有直接影響[15]，因此，越來越多的研究著眼于通過游泳訓練提升魚類養(yǎng)殖品質。

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國重要的淡水養(yǎng)殖種類，2021 年淡水養(yǎng)殖魚類總產(chǎn)量為2 586.38 萬t，其中草魚的產(chǎn)量為557.1 萬t，占比約21.5%[16]。如何能夠更好更高效地養(yǎng)殖高品質草魚是水產(chǎn)養(yǎng)殖關注的重點問題之一。當前草魚可以通過流道養(yǎng)殖、工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖誘導其進行逆流游泳來養(yǎng)殖。相關研究多側重于流速運動訓練促進草魚的長生[17]，但肝臟、肌肉是草魚易受ROS 損傷的組織，不同強度的運動訓練對草魚不同肌肉部位有何影響尚未明確報道。本試驗采用封閉循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，探討了不同水流刺激對草魚幼魚的長期運動訓練，對草魚幼魚紅肌、腹肌、尾肌、肝臟抗氧化能力的影響，旨在確定草魚適宜流速范圍，為草魚流道養(yǎng)殖模式提供基礎數(shù)據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗用草魚體質量（92.76±6.63）g，來源于湖北省黃岡市團鳳縣百容良種場，在“華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院教學實習基地”完成整個實驗魚的養(yǎng)殖過程。

利用總蛋白、相關抗氧化能力測定試劑盒和酶標儀，測定草魚紅肌、腹肌、尾肌以及肝臟的相關抗氧化酶酶活和總抗氧化能力；利用RNA 提取試劑盒、cDNA 合成試劑盒、PCR 擴增試劑盒和實時熒光定量PCR 儀，完成草魚紅肌、腹肌、尾肌以及肝臟的相關抗氧化基因的熒光定量PCR 實驗。

1.2 方法

1.2.1 實驗魚飼養(yǎng)

將草魚放在直徑1 m、水深78 cm 的塑料圓柱魚缸暫養(yǎng)2 個月（4—6 月），期間溶氧水平保持在7 mg/L，水溫大約在22 ℃～24 ℃之間。在飼養(yǎng)期間，每天投喂草魚2 次。然后進行為期70 d 的養(yǎng)殖試驗，將草魚分別在0 bl/s（對照組）、0.5 bl/s、1 bl/s 和1.5 bl/s 流速下，每組3 個平行養(yǎng)殖缸，每缸14 尾魚，實驗設計參考前期研究成果[18]。

1.2.2 樣品采集與測定

訓練結束后，每缸隨機取9 尾魚，生長相關數(shù)據(jù)參考已發(fā)表研究結果[18]。采樣魚用MS-222（140 mg/L）麻醉，每尾草魚采集游泳運動相關的紅肌、腹肌、尾肌以及肝臟組織，置于液氮中速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)相關試劑盒說明書測定總蛋白質濃度、T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px 酶活?？偟鞍踪|濃度采用BCA 法，T-AOC 采用ABTS 法，SOD 采用羥胺法，CAT 采用鉬酸銨法，GSH-Px 采用酶促反應及顯色反應兩步進行測定。

基因表達量測定根據(jù)已發(fā)表的文獻獲得引物序列[19]，交由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列表見表1。根據(jù)試劑盒說明書指示提取RNA、cDNA 的合成和熒光定量PCR 的擴增來完成實驗，使用TRIpure Reagent TRIpure Reagent 試劑盒提取RNA，使用試劑盒HifairⅢ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 進行逆轉錄，使用PCR擴增試劑盒HieffqPCR SYBRGreen Master Mix（LowRox）進行熒光定量。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用2-ΔΔCt法來計算抗氧化基因的相對表達量，在檢測實驗數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性后，使用SPSS 21 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和顯著檢驗，用鄧肯檢驗法（Duncan）進行多重比較分析，當差異在P＜0.05 時被認為具有統(tǒng)計學意義，圖中以不同小寫英文字母表示顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同游泳速度對草魚紅肌抗氧化能力的影響

不同游泳速度下草魚紅肌抗氧化基因cat、gpx和sod 表達量有顯著性差異（P＜0.05，圖1）。同0 bl/s流速組相比，0.5 bl/s 與1 bl/s 流速下草魚紅肌抗氧化基因cat 和gpx 表達量顯著降低（P＜0.05），但與1.5 bl/s 流速組無顯著差異（P＞0.05）。不同游泳速度處理下草魚紅肌的CAT、GSH-Px 和T-AOC 活性無顯著性差異（P＞0.05），而SOD 有顯著性差異（P＜0.05），1.5 bl/s 流速下草魚紅肌SOD 活性顯著低于其他流速組（P＜0.05，圖2）。

圖1 草魚紅肌抗氧化基因表達量Fig.1 Relative expression levels of antioxidant gene transporters of grass carp red muscle

圖2 草魚紅肌抗氧化酶活性Fig.2 Antioxidant enzyme activities of grass carp red muscle

2.2 不同游泳速度對草魚腹肌抗氧化能力的影響

不同游泳速度下草魚腹肌抗氧化基因cat、gpx和sod 表達量無顯著性差異（P＞0.05，圖3）。不同游泳速度處理下草魚腹肌的CAT 活性和T-AOC 無顯著性差異（P＞0.05），而GSH-Px 和SOD 有顯著性差異，1 bl/s 流速下草魚腹肌GSH-Px 活性顯著高于其他流速組；1.5 bl/s 流速下草魚腹肌SOD 活性顯著高于其他流速組（P＜0.05，圖4）。

圖3 草魚腹肌抗氧化基因表達量Fig.3 Relative expression levels of antioxidant gene transporters in grass carp abdominal muscle

圖4 草魚腹肌抗氧化酶活性Fig.4 Antioxidant enzyme activities of grass carp abdominal muscle

2.3 不同游泳速度對草魚尾肌抗氧化能力的影響

不同游泳速度下草魚尾肌抗氧化基因cat、gpx和sod 表達量無顯著性差異（P＞0.05，圖5）。不同游泳速度處理下草魚尾肌的CAT、GSH-Px、SOD 和T-AOC 均無顯著性差異（P＞0.05，圖6）。

圖5 草魚尾肌抗氧化基因表達量Fig.5 Relative expression levels of antioxidant gene transporters in grass carp caudal muscle

圖6 草魚尾肌抗氧化酶活性Fig.6 Antioxidant enzyme activities in grass carp caudal muscle

2.4 不同游泳速度對草魚肝臟抗氧化能力的影響

不同游泳速度下草魚肝臟抗氧化基因cat、gpx和sod 表達量無顯著性差異（P＞0.05，圖7）；肝臟的CAT、GSH-Px 和 SOD 活性無顯著性差異（P＞0.05），而T-AOC 差異顯著，1.0 bl/s 和1.5 bl/s流速下肝臟T-AOC 活性顯著高于0 bl/s 流速組（P＜0.05，圖8）。

圖7 草魚肝臟抗氧化基因表達量Fig.7 Relative expression levels of antioxidant gene transporters in grass carp liver

圖8 草魚肝臟抗氧化酶活性Fig.8 Antioxidant enzyme activities of grass carp liver

3 討論

肝臟與肌肉是養(yǎng)殖魚類維持正常生理代謝的關鍵組織，極易遭受ROS 損傷。適宜的水流速度刺激有利于魚類的生長及生理代謝穩(wěn)態(tài)，而過高的流速也會導致生長和免疫性能的下降[20-22]?；诖?，本研究測定了草魚不同游泳狀態(tài)下紅肌、腹肌、尾肌及肝臟的抗氧化性能，以期明確流速對養(yǎng)殖草魚的影響。

早先研究以1.5 bl/s 或以下的流速對多種魚類訓練，可以提升其紅肌、白肌生長與有氧代謝的能力[9,23]。游泳訓練還可以通過線粒體生物合成途徑影響魚類肌纖維生理代謝過程，對紅肌與白肌生理代謝的作用不盡相同[24,25]，但尚未明確肌肉中抗氧化能力的變化。隨著研究不斷深入，越來越多的報道闡述了流速對養(yǎng)殖魚類肌肉抗氧化性的影響。對虹鱒（Oncorhynchus mykiss）進行不同的運動強度的游泳訓練，中等強度的游泳訓練為2.0 bl/s，訓練時間為每天23.5 h；高強度游泳訓練為3.2 bl/s，每天訓練2 h，訓練10 d 后同未訓練的虹鱒比較，僅高強度訓練可以提升虹鱒紅肌gpx-1 基因表達量，但兩種運動強度對虹鱒白肌、紅肌抗氧化酶活性均無影響[24]。歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla L.）在持續(xù)游泳運動過程中通過增強有氧代謝的方式來抵消ROS 過度產(chǎn)生的影響，但游泳運動對紅肌SOD、CAT 及GSH-Px 活性并無顯著的調節(jié)效果[26]。而不同游泳能力的軟、硬骨魚尾部肌肉組織中CAT、GSH-Px 及SOD 水平具有明顯差異[14]。因此，在1.5 bl/s 流速下，草魚紅肌與腹肌SOD 活性變化的顯著差異表明,該流速下腹肌中清除O2-的能力提升，紅肌中清除O2-的能力減弱，這可能是草魚肌肉有氧代謝適應高流速訓練的結果。而1.0 bl/s 流速顯著提升了腹肌GSH-Px 活性，表明1.0 bl/s 流速下草魚腹肌獲得了更強清除體內過量的ROS 的能力?？梢娺m當?shù)挠斡居柧毧梢杂绊懖蒴~抗氧化途徑來調控肌肉相關生理活動。

魚類組織中肝臟通常具有較高的抗氧化酶活性[27-30]，這在本研究中也有所體現(xiàn)，可以看到肝臟的抗氧化酶活性明顯高于肌肉組織。在其他魚類相關研究中發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）在0 bl/s、0.5 bl/s、1.0 bl/s 和2.0 bl/s 游泳速度下，肝臟T-AOC 和CAT 及SOD 的活性隨游泳速度的增加先增加后降低，在1.0 bl/s 時活性最大[15]。在0 bl/s、1 bl/s、2 bl/s、4 bl/s 不同流速的訓練下，隨著強度的增加，黑鯛（Sparus macrocephalus）肝臟GSH-Px 含量和CAT 活性均呈現(xiàn)上升的趨勢，而其T-AOC 沒有顯著性變化[31]。本研究中，隨著流速增加，草魚肝臟T-AOC 活性逐漸提升，表明清除自由基的能力增強，可見游泳訓練增強了草魚肝臟抗氧化性能。

綜上所述，不同流速下魚類的抗氧化能力的變化或許與魚類種類相關。同時不同流速下草魚各組織中抗氧化能力改變存在差異，這可能是草魚機體調節(jié)能量代謝平衡，以適應不同流速的結果。整體來講，在實際生產(chǎn)中可以適當改變水的流速來促進草魚的生長。