熱應(yīng)激蛋白家族在水生動(dòng)物中的研究進(jìn)展

江逸楠，秦舒蕾，季瑾玉，張瑩瑩，魏文志，楊輝

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇，揚(yáng)州 225007）

1962 年Ritossa 在果蠅（Drosophila melanog aster）幼蟲實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)了熱激蛋白（Heat Shock Proteins,HSPs）[1]。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了高溫能抑制絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的合成，與此同時(shí)也啟動(dòng)了一套新的蛋白合成，此過(guò)程被稱之為熱激反應(yīng)（Heat shock response,HSR）[2]。HSR 是生物體對(duì)外界環(huán)境應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，普遍存在于生物界中，該反應(yīng)過(guò)程中生成的蛋白稱為HSPs[3]。但是，隨著研究成果的不斷積累，HSPs 已經(jīng)不僅僅具有高溫?zé)峒畏矫娴纳飳W(xué)意義。動(dòng)物在應(yīng)對(duì)其他不良因素，如低氧、重金屬污染、活性氧、鹽脅迫以及病菌染毒等逆境條件時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激改變來(lái)適應(yīng)環(huán)境[4]。同時(shí)，HSPs 作為分子伴侶，會(huì)參與蛋白多肽鏈的折疊和組裝、受損蛋白復(fù)性、免疫識(shí)別、細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng)，起到保護(hù)機(jī)體的作用。在正常生理?xiàng)l件下HSPs的表達(dá)量非常低，而在環(huán)境脅迫、病理和生理?xiàng)l件下，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)HSPs 的合成則會(huì)急劇增長(zhǎng)[5]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖為世界各地?cái)?shù)億人提供了食物來(lái)源。隨著水產(chǎn)的集約化養(yǎng)殖使生產(chǎn)力顯著提高，導(dǎo)致了疾病流行，涉及細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等病原體。因此，需要控制疾病暴發(fā)，以維持產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展，滿足人們不斷增加的對(duì)動(dòng)物蛋白日益增長(zhǎng)的需求。目前，用常規(guī)方法（如抗生素）預(yù)防和治療水生動(dòng)物疾病取得的成效有限，且過(guò)量用抗生素會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加，影響藥物的使用效果。疫苗接種已有效控制了許多水產(chǎn)養(yǎng)殖的疾病，但需要結(jié)合良好的管理、營(yíng)養(yǎng)供給和其他疾病控制方法才能實(shí)現(xiàn)。因此，這需要開發(fā)新的方法和技術(shù)，達(dá)到不損害環(huán)境而改善養(yǎng)殖動(dòng)物健康的目的。水生動(dòng)物生活在高溫傳導(dǎo)性的水生環(huán)境中，各種應(yīng)激包括水溫的變化、病原的刺激、水中污染物等都會(huì)影響水生動(dòng)物HSPs 的表達(dá)。可以在魚類的所有生活史階段研究HSPs 的表達(dá)和調(diào)控。本文綜述了水產(chǎn)動(dòng)物HSPs的功能和作用，著重介紹其在水產(chǎn)動(dòng)物免疫病害防控中的重要作用。

1 HSPs 的分類與特征

HSPs 在進(jìn)化中高度保守，同一家族內(nèi)高度同源，這也說(shuō)明其在生物生命活動(dòng)中具有重要的作用。HSPs 家族根據(jù)同源程度及分子量由小到大可分為5 類：sHsps、Hsp60、Hsp70、Hsp90 和Hsp110[2,6]。它們一般多分布在細(xì)胞質(zhì)和部分細(xì)胞器如線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，少量分布于細(xì)胞核內(nèi)。HSPs 是分子伴侶，有助于多肽折疊和寡聚化，保護(hù)蛋白質(zhì)免受不可逆變性、重折疊或受損蛋白質(zhì)降解，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到膜結(jié)合細(xì)胞區(qū)室中，有助于抗病。水產(chǎn)養(yǎng)殖期間疾病控制主要關(guān)注的是HSP 家族的Hsp70，但sHsps、Hsp90 和Hsp60 以及Hsp40 似乎也可以改善病原體感染[7-10]。HSP 家族如Hsp90 和Hsp70 對(duì)其他細(xì)胞蛋白的折疊和組裝至關(guān)重要[11]。它們和其他分子伴侶也參與調(diào)節(jié)折疊、易位和聚集之間的動(dòng)力學(xué)分配，在免疫、凋亡和炎癥反應(yīng)中具有更廣泛的作用[12]。sHsps 為結(jié)構(gòu)紊亂蛋白質(zhì)的ATP 非依賴性結(jié)合提供寡聚平臺(tái)，防止細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性。然而，這些伴侶家族的主要功能是通過(guò)ATP 驅(qū)動(dòng)的變構(gòu)重排來(lái)結(jié)合和折疊新生蛋白。盡管每個(gè)伴侶的分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同，但HSPs可以通過(guò)形成伴侶蛋白、共伴侶蛋白和輔助蛋白的細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)起到協(xié)同發(fā)揮作用。

sHsps 主要存在于植物中，依據(jù)其在細(xì)胞內(nèi)的定位，可將sHsps 分為五大類：兩類定位于細(xì)胞質(zhì)，即胞質(zhì)I 類和胞質(zhì)Ⅱ類；其它三類分別定位于線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。在最適生長(zhǎng)溫度下檢測(cè)不到sHsps，而經(jīng)過(guò)熱激誘導(dǎo)后，sHsps 的合成量迅速增加。通常情況下，sHsp 單體由一個(gè)保守的α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域（側(cè)翼為氨基末端序列和羧基末端延伸部分）組成，組裝成低聚物[13-15]。當(dāng)環(huán)境壓力傳遞時(shí)，sHsps 釋放的蛋白質(zhì)要么自發(fā)重折疊，要么在依賴ATP 的HSP 如Hsp70 發(fā)生重折疊[16]。當(dāng)暴露于應(yīng)激條件下，sHsps 的主要作用是保護(hù)蛋白質(zhì)免于不可逆變性。

Hsp60 是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的HSP，由兩個(gè)背對(duì)背放置的環(huán)組成，每個(gè)環(huán)都由8～9 個(gè)不同但相關(guān)的ATP水解單體組成。這些單體由3 個(gè)功能域組成[17]。Hsp60 通過(guò)疏水鍵、極性鍵和帶電荷的氨基酸殘基與許多不同的底物結(jié)合。底物通常在折疊后期與Hsp60 結(jié)合，并在ATP 水解和ADP+Pi 解離時(shí)釋放。細(xì)胞骨架蛋白-肌動(dòng)蛋白和微管蛋白依賴Hsp60進(jìn)行正確折疊[18,19]。Hsp60 具有使感染期間變性的蛋白質(zhì)重折疊的能力，并可能與無(wú)脊椎動(dòng)物免疫應(yīng)答中涉及的肽和蛋白質(zhì)相互作用。

Hsp70（分子量大約在72～80 kDa）是研究最廣泛的HSP。與其他HSPs 功能相似，Hsp70 不僅作為分子伴侶在跨膜運(yùn)輸、轉(zhuǎn)位、蛋白質(zhì)復(fù)合物組裝和分解等方面發(fā)揮重要作用[20]，而且被誘導(dǎo)的Hsp70可作為細(xì)胞因子參與機(jī)體的先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)[21]。環(huán)境、生理和病理原因可調(diào)控Hsp70的合成。Hsp70 可參與機(jī)體的免疫調(diào)控反應(yīng)。當(dāng)受到免疫刺激時(shí)，Hsp70 的表達(dá)量迅速增高[22-24]。有研究指出，腫瘤細(xì)胞分泌的Hsp 復(fù)合肽能激活機(jī)體的免疫響應(yīng)[25]。Hsp70 也能抑制細(xì)菌表位導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。Hsp70 能顯著增加調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（Regulatory cells,Treg）的免疫活性，達(dá)到下調(diào)炎性因子表達(dá)的目的，提高Hsp70 的表達(dá)可治療或緩解多種免疫疾病。

Hsp90 是生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的胞質(zhì)蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能。Hsp90 也是在細(xì)胞正常生理?xiàng)l件下或應(yīng)激誘導(dǎo)下大量產(chǎn)生的一種ATP 依賴的二聚體，由3 個(gè)結(jié)構(gòu)域的單體組成。在真核生物中，Hsp90 主要分布于胞質(zhì)、核質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及葉綠體等。線粒體中Hsp90 的同系物為腫瘤壞死因子受體關(guān)聯(lián)蛋白（tumor necrosis factor receptor-associated protein 1,TRAP1）。Hsp90α 的非傳統(tǒng)方式分泌可由低氧刺激和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFα 引起，可使Hsp90α 成為潛在的創(chuàng)傷愈合劑。Hsp90 可以調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中近100 種蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)大多數(shù)與細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用相關(guān)。Hsp90 在機(jī)體的各個(gè)方面都發(fā)揮著重要的作用，包括：蛋白質(zhì)運(yùn)輸、免疫調(diào)節(jié)和抗原遞呈等。因此，研究Hsp90的功能將為水產(chǎn)動(dòng)物疾病的治療提供全新思路。

2 水產(chǎn)動(dòng)物HSPs 的表達(dá)調(diào)節(jié)

2.1 環(huán)境應(yīng)激影響HSPs 的表達(dá)

HSPs 的表達(dá)受多種非生物和生物因素的影響。通常，溫度的變化，尤其是熱應(yīng)激刺激，可明顯誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種類型的HSP[26,27]。如高溫脅迫可提高日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）Hsp60 和Hsp 90 的表達(dá)量[28]。低溫脅迫也會(huì)誘導(dǎo)黃姑魚（Nibea albiflora）、黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）等的HSP 含量上升[29,30]。水體鹽度變化也會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生HSP，相關(guān)內(nèi)容已經(jīng)在斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）、菲律賓簾蛤（Ruditapes philippinarum）、達(dá)氏鰉（Huso dauricus）、馬氏珠母貝（Pinctada martensi）、射肋珠母貝（Pinctada radiata）和金烏賊（Sepiaesculenta）等有研究報(bào)道[31-35]。與鹽度變化應(yīng)激有關(guān)的滲透壓變化，同樣可誘導(dǎo)大鱗大馬哈魚（Oncorhynchus tshawyt scha）和大西洋鮭（Salmo salar）相關(guān)HSPs 的表達(dá)變化[36,37]。環(huán)境污染物同樣只是誘導(dǎo)水產(chǎn)動(dòng)物HSPs 表達(dá)的因子。暴露于環(huán)境污染物中（包括農(nóng)藥、重金屬、有機(jī)物等）可以檢測(cè)到各種HSPs 水平的升高[38-40]，如鳙（Aristichthys nobilis）經(jīng)亞硝酸鹽氮脅迫后，可誘導(dǎo)其體內(nèi)Hsp70 表達(dá)量的升高[41]；經(jīng)重金屬Cd、Pb 暴露后，可誘導(dǎo)褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）Hsp70 的表達(dá)[42]。也有研究顯示，經(jīng)過(guò)鉛的脅迫，日本沼蝦的Hsp60 和Hsp90 mRNA 表達(dá)量降低[43]。太平洋真寬水蚤（Eurytemora pacifica）經(jīng)銅、鋅、鎘離子脅迫后Hsp70 于1/8 的LC50濃度時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值[44]。魚類的HSP 被認(rèn)為是農(nóng)藥毒性的潛在生物標(biāo)識(shí)[39]。水體中溶氧量變化同樣影響水生生物HSPs 表達(dá)量，如低氧脅迫后，野生蛤仔、斑馬蛤、白蛤、白斑馬蛤4 種蛤仔的HSPs 表達(dá)量均提高[45]。在低氧脅迫后，斑馬魚（Danio rerio）鰓中HSPs 基因的表達(dá)量升高，顯著高于心臟、皮膚等組織[46]。有研究指出，激素可以調(diào)節(jié)魚類的HSPs 水平[47]。甲狀腺激素可使牙鲆（Paralichthys olivaceus）Hsp90α 表達(dá)量上調(diào)[48]。升高皮質(zhì)醇水平可抑制鮭（Oncorhynchus keta）鰓中Hsp30 的表達(dá)、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）肝臟和鰓中Hsp70 的表達(dá)以及羅非魚（Oreochromis mossambicus）鰓中Hsp70 的表達(dá)[49-51]。也有研究指出外源性地添加生長(zhǎng)激素分泌促進(jìn)劑海沙瑞林（Hexarelin）和催乳素藥理興奮劑舒必利（Sulpiride），可以顯著抑制黃錫鯛（Sparus sarba）Hsp70 的表達(dá)[52,53]。因此，各種非生物因素包括溫度、鹽度、環(huán)境污染物、激素等的刺激，均能夠顯著影響HSPs 的表達(dá)水平，但是關(guān)于HSPs 是否能作為可靠性強(qiáng)的環(huán)境污染物生物標(biāo)識(shí)還需要進(jìn)一步的探討。

2.2 病原微生物感染刺激水生動(dòng)物HSPs 的表達(dá)

生物因素影響HSP 的表達(dá)主要指病原微生物的感染。病原微生物在自然環(huán)境中會(huì)對(duì)水生動(dòng)物的健康產(chǎn)生有害影響。強(qiáng)毒病原體可能通過(guò)釋放溶解細(xì)胞的物質(zhì)來(lái)?yè)p壞細(xì)胞內(nèi)的成分，改變細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并誘導(dǎo)HSPs。病原暴露引起的炎性病理改變了細(xì)胞水平的生理過(guò)程，如離子調(diào)節(jié)和酸堿平衡等。宿主免疫細(xì)胞（吞噬細(xì)胞和粒細(xì)胞）釋放細(xì)胞外物質(zhì)，例如活性氧、陽(yáng)離子肽、溶菌酶和細(xì)胞因子，它們是各種HSPs 的已知誘導(dǎo)劑，均可誘導(dǎo)HSPs 的表達(dá)。

目前已有大量研究報(bào)道了關(guān)于細(xì)菌性病原感染誘導(dǎo)水生動(dòng)物HSPs 的表達(dá)。溶藻弧菌（V.alginolyticus）感染羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii），會(huì)在24 小時(shí)內(nèi)增加肝胰腺中Hsp70 表達(dá)量[54]。嗜水氣單胞菌感染中華鱘（Acipenser sinensis）后，其脾臟與腎臟中Hsp70 表達(dá)量升高[55]。吉富羅非魚在感染無(wú)乳鏈球菌后，可誘導(dǎo)其肝臟中Hsp70 的表達(dá)[56]。鰻弧菌在急性感染虹鱒和鯛后，肝臟中Hsp70 的表達(dá)在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到峰值[57]。溶藻弧菌（V.alginolyticus）是三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）乳化病的主要病原體，在感染后的3 h、12 h和24 h 內(nèi)，均顯著誘導(dǎo)Hsp70 的表達(dá)[58]。哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）能誘導(dǎo)斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）Hsp90 的表達(dá)上調(diào)[59]。南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）在感染金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和溶藻弧菌后，能夠誘導(dǎo)鰓和血淋巴HSP 相關(guān)蛋白表達(dá)量上調(diào)[60]。溶藻弧菌的感染能夠引起南美白對(duì)蝦Hsp60 和Hsp70 的表達(dá)變化[61]。在雙殼類菲律賓蛤仔中，鰻弧菌的感染能夠瞬間促進(jìn)血細(xì)胞合成sHsps（VpsHSP-1 和VpsHSP-2），保護(hù)病原體暴露時(shí)發(fā)生變性的蛋白質(zhì)[62]。砂海螂（Mya arenaria）感染燦爛弧菌（Vibrio splendidus）后，血細(xì)胞中的Hsp90 表達(dá)在1 h 后顯著上調(diào)，但是，2 h 和3 h 后，表達(dá)量又有所降低[63]。還在文蛤（Meretrix meretrix）中發(fā)現(xiàn)一種組成型的Hsp71，在副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的感染下，肝胰腺和鰓中的表達(dá)量增加了2 倍[64]。鰻弧菌感染后8h，海灣扇貝（Argopecten irradians）體內(nèi)Hsp70 的表達(dá)量持續(xù)升高，并保持了16 h。大部分研究表明，在水產(chǎn)病原細(xì)菌的感染下HSPs 的表達(dá)都會(huì)上調(diào)，這暗示著HSPs 與水產(chǎn)動(dòng)物的免疫防御功能緊密相聯(lián)。

除了細(xì)菌性病原外，病毒感染也影響水產(chǎn)動(dòng)物HSPs 的表達(dá)。CyHV-2 病毒感染后，可誘導(dǎo)異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）肝臟中Hsp70 表達(dá)上調(diào)[65]。經(jīng)草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）感染后，草魚的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（Cytokine-Induced Killer，CIK）中Hsp70 表達(dá)量上調(diào)[66]。WSSV 感染抑制了凡納濱對(duì)蝦鰓、腸、血細(xì)胞和肌肉中Hsp60 的表達(dá)，而促進(jìn)了鰓、肝胰腺、血細(xì)胞、腸、類淋巴和肌肉中Hsp90 的表達(dá)[67]。感染W(wǎng)SSV 后，中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）和鋸緣青蟹（Scylla serrata）肝胰腺中Hsp70 的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，但是，鋸緣青蟹血淋巴中Hsp90 的表達(dá)被抑制[68,69]。諾達(dá)病毒（Nodaviridae）感染斜帶石斑魚時(shí)，Hsp90 的表達(dá)也會(huì)增加[70]。大菱鲆彈狀病毒（Scophthalmus maximus rhabdovirus，SMRV）會(huì)上調(diào)牙鲆胚胎細(xì)胞系中三種hsp40 基因的表達(dá)，顯著刺激PoHsp40A4，減弱PoHsp40B6 和PoHsp40B11 的產(chǎn)生[71]。傳染性造血器官壞死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV）在感染鮭胚胎細(xì)胞系CHSE-214 時(shí)，Hsp90 的高表達(dá)量暗示著HSP與魚類疾病之間的關(guān)系[72]。這種病原微生物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物HSPs 的誘導(dǎo)表達(dá)更多是宿主本身針對(duì)病原入侵的一種防御反應(yīng)，也表明HSPs 與水產(chǎn)動(dòng)物的多種免疫抗病功能相關(guān)。

3 HSPs 與水生動(dòng)物免疫的關(guān)系

最初，HSP 對(duì)細(xì)胞應(yīng)激源的反應(yīng)被認(rèn)為是短期的功能性反應(yīng)，具有一系列基本的細(xì)胞保護(hù)功能[12]。然而，現(xiàn)在越來(lái)越多的研究認(rèn)為，HSPs 在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起重要作用[12,73,74]。特別是在T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中，HSPs 可充當(dāng)細(xì)胞間信號(hào)分子，誘導(dǎo)多種細(xì)胞類型改變其活性，產(chǎn)生炎性產(chǎn)物，如細(xì)胞因子和黏附素。細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性HSP 是潛在的危險(xiǎn)信號(hào)[75]，因?yàn)樗鼈冊(cè)诟鞣N應(yīng)激條件下被上調(diào)，由應(yīng)激、感染、壞死或腫瘤細(xì)胞釋放，而不是從凋亡細(xì)胞釋放。釋放出來(lái)的HSP 可以通過(guò)受體介導(dǎo)的相互作用向抗原呈遞細(xì)胞傳遞成熟信號(hào)肽。在哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答中，特定的HSP 是先天性和特異性免疫的有效誘導(dǎo)劑。它們激活樹突細(xì)胞和自然殺傷T 細(xì)胞，增加抗原對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的呈遞，增強(qiáng)T 細(xì)胞和體液對(duì)其特異性抗原的應(yīng)答[76]。同樣，細(xì)胞外內(nèi)源性HSP 可以觸發(fā)核因子NF-κB向巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞核的易位[77]。

目前對(duì)水生動(dòng)物胞外內(nèi)源性HSP 的影響尚未有全面的研究。然而，HSPs 是最古老和高度保守的蛋白質(zhì)之一，推測(cè)內(nèi)源性HSPs 也將作為危險(xiǎn)信號(hào)，可以激活動(dòng)物體內(nèi)的先天性和/或適應(yīng)性免疫反應(yīng)，保護(hù)動(dòng)物免受（病原性）應(yīng)激。HSPs 對(duì)水生動(dòng)物免疫有影響。通過(guò)冷熱應(yīng)激誘導(dǎo)增加了鹵蟲（Artemia）Hsp70 表達(dá)的個(gè)體，在受到坎氏弧菌（Vibrio campbelii）感染后其存活率顯著高于對(duì)照組[78,79]。通過(guò)RNAi 敲除鹵蟲胚胎的Hsp70，其在坎氏弧菌感染下的存活率顯著低于對(duì)照組[80,81]；增強(qiáng)了翡翠股貽貝（Perna viridis）Hsp70 的表達(dá)，能夠有效防止溶藻弧菌（V.alginolyticus）感染[82]。通過(guò)短時(shí)間的熱應(yīng)激增加了斑節(jié)對(duì)蝦Hsp70 的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)與鰓相關(guān)病毒的抗性[83]。

除了宿主HSPs 在介導(dǎo)免疫應(yīng)答中的作用外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，微生物HSPs 經(jīng)常是病原體本身的主要抗原之一。宿主對(duì)病原微生物的感染可能導(dǎo)致HSPs 合成增加。HSPs 是引發(fā)大部分免疫反應(yīng)的突出抗原。在許多感染中，特別是Hsp60 和Hsp70 可以刺激產(chǎn)生高水平的抗體應(yīng)答。Hsp60 和Hsp70 家族的成員是許多蠕蟲、原生動(dòng)物和細(xì)菌感染中抗體的主要靶點(diǎn)。結(jié)合時(shí)，Hsps 激活TLR，將炎性信號(hào)傳遞給先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，達(dá)到促進(jìn)抗病的效果。外源性的HSPs 能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞表達(dá)和分泌細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6 和黏附分子，如E-選擇素和細(xì)胞間細(xì)胞黏附分子可以激活NF-κB 和Toll/IL-1 信號(hào)通路，產(chǎn)生針對(duì)感染的免疫應(yīng)答[21,84]。一種外源性原生動(dòng)物的重組Hsp70 能夠激活金魚巨噬細(xì)胞，刺激促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，誘導(dǎo)金魚巨噬細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的一氧化氮反應(yīng)[85,86]。

蝦和雙殼貝類缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。它們清除病原體的能力取決于先天性免疫的細(xì)胞和體液機(jī)制的合作。大量研究指出，水生無(wú)脊椎動(dòng)物感染細(xì)菌后血細(xì)胞中HSPs 的表達(dá)量提高，這種提高與血淋巴中的抗菌肽和吞噬活性緊密相關(guān)。但是，這些抗菌肽相關(guān)基因的表達(dá)與HSPs 的直接聯(lián)系還尚不清楚。HSPs 被認(rèn)為是通過(guò)修復(fù)損傷或保護(hù)自身免受自氧化引起的自溶和凋亡來(lái)維持吞噬細(xì)胞[87]。在脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）的刺激下，草魚（Ctenopharyngodon idella）體內(nèi)的hsp70 基因在12種免疫相關(guān)組織中均表達(dá)增強(qiáng)，故Hsp70 的釋放有助于草魚的免疫抗病[88]。在適應(yīng)性免疫過(guò)程中，HSPs 可能通過(guò)組裝主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex,MHC）-肽復(fù)合體在抗原呈遞中發(fā)揮不可或缺的作用，如激活T 細(xì)胞以破壞或協(xié)同殺死病原體和受感染的功能障礙細(xì)胞[89,90]。因此，HSPs 廣泛參與到水生動(dòng)物的先天性免疫和獲得性免疫中，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫中發(fā)揮重要的作用。對(duì)HSPs 功能的研究，也將有助于揭示保護(hù)水產(chǎn)動(dòng)物的策略。

4 調(diào)控HSPs 增強(qiáng)水生動(dòng)物的抗病能力

4.1 促進(jìn)水生動(dòng)物HSPs 的表達(dá)

眾多的研究表明，提高機(jī)體HSPs 的合成有助于增強(qiáng)水生動(dòng)物在病原微生物感染和應(yīng)激條件下的成活率。而刺激HSPs 表達(dá)的常用方案是短暫的非致死性熱休克，并在非應(yīng)激條件下孵育數(shù)小時(shí)[91]。非致死性熱休克會(huì)激活HSPs 的轉(zhuǎn)錄和合成，HSPs可保護(hù)機(jī)體抵抗隨后的應(yīng)激源，但關(guān)于HSPs 在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用研究較少。探索有效的非應(yīng)激性HSPs 的誘導(dǎo)方法對(duì)于水生動(dòng)物疾病防控有著潛在的價(jià)值。

化學(xué)性誘導(dǎo)劑也可以促進(jìn)水生動(dòng)物HSPs 的表達(dá)。姜科、天南新科植物根莖中提取的二酮類化合物——姜黃素（Curcumin），是姜黃屬植物姜黃的主要成分，可在K562 細(xì)胞中誘導(dǎo)Hsp70 表達(dá)[92]。其添加至飼料中后投喂，可誘導(dǎo)草魚體內(nèi)Hsp70 的表達(dá)[93]。來(lái)源于仙人掌中的TEX-OE 是一種有效的內(nèi)源性HSPs 非應(yīng)激誘導(dǎo)劑[94]。通過(guò)浸泡或作飼料添加劑應(yīng)用的Pro-Tex 可加速魚類和貝類體內(nèi)HSPs的表達(dá)，增強(qiáng)應(yīng)激耐受力[95,96]。Pro-Tex 可作為誘導(dǎo)Hsp70 表達(dá)的增強(qiáng)劑，通過(guò)誘導(dǎo)不同的免疫因子來(lái)增強(qiáng)波斯鱘（Acipenser persicus）對(duì)嗜水氣單胞菌ATCC7966 的抵抗能力[97]。額外添加TEX-OE 也能夠增加Hsp72 的釋放與表達(dá)[98]。雖然TEX-OX 多應(yīng)用于減少魚類運(yùn)輸過(guò)程中產(chǎn)生的應(yīng)激，增加魚類的耐受力，但是，越來(lái)越多的研究表明，TEX-OX 也可以增強(qiáng)魚類的抗病免疫力[99]。闡明TEX-OE 等生物活性化合物的免疫調(diào)節(jié)作用，具有重要的基礎(chǔ)和應(yīng)用意義。

芍藥苷來(lái)自草本植物芍藥，可增強(qiáng)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Hsp70 的表達(dá)，是TEX-OE 的替代品。芍藥苷誘導(dǎo)海拉細(xì)胞（HeLa Cells）產(chǎn)生耐熱性，這種效應(yīng)要在42 ℃下熱休克2 h 而產(chǎn)生增強(qiáng)效果[100]。生物活性化合物雷公藤紅素是一種來(lái)自中草藥雷公藤的醌甲基化三萜，可增加HeLa 細(xì)胞中Hsp70、Hsp40 和Hsp27 的合成[101]。五味子乙素（Sch B）是中藥五味子中最具活性的二苯并環(huán)辛二烯，其以劑量依賴性方式提高小鼠肝臟Hsp70 的表達(dá)，來(lái)達(dá)到治療的目的[102]。香芹酚來(lái)自牛至屬物種的油，可引起Hsp70 表達(dá)并促進(jìn)T 細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性Hsp70 的識(shí)別[103]。一些抗癌藥物能升高外泌體中Hsp60、Hsp70和Hsp90 的含量，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的免疫活性[104]。以上是目前所報(bào)道的可作為HSP 誘導(dǎo)劑的相關(guān)物質(zhì)，可能用于控制水產(chǎn)動(dòng)物疾病的新策略中。

4.2 外源性HSPs 給藥

有研究指出，用富含HSP 的細(xì)菌喂養(yǎng)水生生物是控制水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的一種新方法。向鹵蟲飼喂能夠大量表達(dá)DnaK（即Hsp70 的等價(jià)物）的大腸桿菌，在受到坎氏弧菌感染時(shí)，其存活率顯著高于對(duì)照組[79]。而這可能與通過(guò)飼喂富含DnaK 的細(xì)菌，刺激鹵蟲的酚氧化酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)[105]。向鹵蟲飼喂富含Hsp70 的酵母，可增強(qiáng)鹵蟲對(duì)坎氏弧菌的耐受能力[106]。體內(nèi)注射重組細(xì)菌的HSPs、DnaK 和GroEL蛋白能夠保護(hù)花科米奇魚（Xiphophorus maculatus）免受魯氏耶爾森氏菌（Yersinia ruckeri）的侵害[107]。雖然目前在水生動(dòng)物中，關(guān)于HSPs 外源性給藥方式的研究較少，但研究和開發(fā)新型給藥途徑，提高機(jī)體HSP 的含量，來(lái)增強(qiáng)抗病力的目的是可行的。

4.3 HSPs 作為疫苗用于水產(chǎn)養(yǎng)殖

現(xiàn)已證實(shí)，用細(xì)菌來(lái)源的HSPs 作為抗原蛋白可作為有效的抗病疫苗，為水生動(dòng)物健康養(yǎng)殖提供一定的保障。目前關(guān)于HSPs 作為疫苗的研發(fā)已有系統(tǒng)地報(bào)道[108,109]。在大西洋鮭（Salmo salar）中注射病原鮭立克次氏體（Piscirickettsia salmonis）的Hsp60和Hsp70 重組蛋白，顯著降低了鮭感染此病原的死亡率[110]。將鮭立克次氏體的Hsp60 和Hsp70，以及鮭鞭毛蛋白FlgG 的重組蛋白混合作為疫苗，能夠保護(hù)鮭免受立克次氏敗血癥（Rickettsial septicaemia,SRS）的侵害，其效率高達(dá)95%以上[111]。給虹鱒注射嗜冷黃桿菌（Flavobacterium psychrophilum）Hsp60和Hsp70 的重組蛋白和DNA 疫苗，只有rHsp70 疫苗的保護(hù)效果較好[112]。細(xì)菌的DnaJ 作為Hsp40 的同源物也可作為疫苗進(jìn)行篩選。在尖吻鱸（Lates calcarifer）中，通過(guò)重組表達(dá)了4 種美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種（Photobacterium damselae subsp.）的HSP（Hsp90、Hsp70、Hsp33 和DnaJ）作為蛋白疫苗，其保護(hù)效率分別為48.28%、62.07%、51.72%和31.03%[113]。Hsp33 更適合作為美人魚發(fā)光桿菌的疫苗保護(hù)劑。愛德華氏菌的DnaJ 重組蛋白可護(hù)牙鲆抵抗這種革蘭氏陰性病原體，與未免疫對(duì)照相比，存活率提高62%[114]。刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）Hsp70 的C-端重組蛋白，通過(guò)包裹在殼聚糖納米顆粒中作為疫苗，可達(dá)到95%以上的保護(hù)效率[115]。這些研究中表明，病原體來(lái)源的HSP 是水產(chǎn)養(yǎng)殖中理想的候選疫苗，能夠減少水生動(dòng)物病害的發(fā)生。

HSPs 也可作為疫苗佐劑的候選物。當(dāng)合成肽與HSPs 共價(jià)連接時(shí)，它們能顯著增加機(jī)體的免疫應(yīng)答[116]。這種特性在Hsp70、Hsp110 和Hsp170 中均有報(bào)道[117]。HSP 能夠與抗原呈遞細(xì)胞（Antigen-presenting cells,APC）相互作用。HSP-肽復(fù)合物被APC 攝取，出現(xiàn)在APC 的MHC 分子上，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子、趨化因子和NO，可以上調(diào)樹突狀細(xì)胞上共刺激分子的表達(dá)[118]。這些作用涉及受體參與、信號(hào)傳導(dǎo)以及NF-κB向巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞核的易位。HSP 伴侶肽通過(guò)Toll 樣受體（Toll-like receptors,TLR）、凝集素樣氧化LDL 受體和CD91 等特異性受體進(jìn)入APC[119]，通過(guò)增加MHC 的I 類和II 類分子的抗原展示來(lái)誘導(dǎo)T 細(xì)胞[120]。目前還沒有研究在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用HSPs 作為疫苗佐劑。盡管如此，這些HSPs 在開發(fā)針對(duì)病毒或細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的疫苗中具有特殊的重要性。

5 結(jié)論

水生動(dòng)物能夠產(chǎn)生sHSPs、Hsp70、Hsp60 和Hsp90 等多種蛋白，保護(hù)機(jī)體免受各種應(yīng)激損傷。通過(guò)發(fā)揮分子伴侶的功能，調(diào)節(jié)新生蛋白質(zhì)的折疊，防止不可逆的蛋白質(zhì)變性，幫助受損蛋白質(zhì)重折疊或消除受損蛋白質(zhì)。在水產(chǎn)動(dòng)物中，HSPs 不僅可以作為某些水環(huán)境污染物的生物標(biāo)識(shí)，而且HSPs 的累積量與其環(huán)境應(yīng)激的耐受水平呈正相關(guān)。HSPs還廣泛參與水產(chǎn)動(dòng)物免疫調(diào)控過(guò)程，增強(qiáng)HSPs 的表達(dá)，有助于提高水產(chǎn)動(dòng)物的抗病能力。外源性的HSPs 還可作為疫苗，刺激宿主先天性免疫的體液和細(xì)胞來(lái)提高對(duì)病原體的抵抗力。HSPs 也可作為疫苗佐劑，在開發(fā)水生生物的有效疫苗中有重要作用。因此，HSPs 可作為水生動(dòng)物的一個(gè)重要靶位點(diǎn)，調(diào)控HSPs 表達(dá)和功能，能增強(qiáng)水生動(dòng)物的抗應(yīng)激能力，對(duì)病害防治起到重要作用。