河鲀毒素及其在河鲀體內(nèi)積累研究進展

張瀚元，李衛(wèi)東，張海恩，劉英杰

（1.中國水產(chǎn)科學研究院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水生動物基因組學重點實驗室，北京 100141；2.唐山海都水產(chǎn)食品有限公司河北省海水魚產(chǎn)業(yè)技術研究院，河北 唐山 063000）

河鲀?nèi)赓|(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，是我國重要的特色海水養(yǎng)殖魚類，但因體內(nèi)含有毒性極強的河鲀毒素（tetrodotoxin,TTX），一度成為禁食魚類。2016 年9月5 日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國家食品藥品監(jiān)督管理總局聯(lián)合下發(fā)了《關于有條件放開養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀加工經(jīng)營的通知》。紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）和暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）是我國河鲀的兩個主要養(yǎng)殖物種，成為首批有條件放開的河鲀物種。有條件放開是指消費者食用的河鲀應當是有經(jīng)備案的河鲀魚源基地加工企業(yè)加工后，可追溯、有檢驗合格證的產(chǎn)品。被檢河鲀產(chǎn)品的TTX 含量以鮮品計不得超過2.2 mg/kg。隨著我國養(yǎng)殖河鲀市場的有條件放開，河鲀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展迎來新的機遇和挑戰(zhàn)。近幾年河鲀產(chǎn)量位居我國海水魚養(yǎng)殖產(chǎn)量前十位[1]；我國也是世界上最大的養(yǎng)殖河鲀生產(chǎn)國，占全球養(yǎng)殖總量的88%[2]，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α５玊TX 的毒素來源和機制不清晰，致使食用河鲀?nèi)源嬖谝欢ǖ陌踩[患。TTX 廣泛分布于多種不同進化水平的生物中，是一種鈉離子通道類海洋神經(jīng)毒素。近年來，關于河鲀TTX 來源和積累的研究已有一定進展，為深入研究河鲀積累代謝TTX 的調(diào)控機制提供了理論基礎。本文綜述了TTX 的特征分布、檢測方法、毒性機制及其在河鲀體內(nèi)積累的研究進展，展望了今后的研究方向，為防控養(yǎng)殖河鲀TTX 積累提供參考。

1 TTX 的特性、分布和檢測方法

1.1 TTX 的理化特性

TTX 是一種氨基全氫喹唑啉化合物的海洋生物神經(jīng)毒素，分子量小、生物活性高、毒性強、作用機理獨特。TTX 的分子結構復雜，含有籠形原酸酯結構，碳環(huán)中的每個碳原子均具有不對稱取代（圖1）。TTX 呈弱堿性，微溶于水和濃酸，極易溶于稀酸溶液，不溶于無水乙醇、乙醚、苯等有機溶劑。其純品為無嗅無色固體結晶，易吸濕潮解，在環(huán)境溫度下穩(wěn)定，在堿水溶液中易分解，在80 ℃～100 ℃、濃度5%的氫氧化鉀溶液中可分解為無毒的C9 堿，即2-氨基-6-羥甲基-8-羥基-喹唑啉[3]。

圖1 河鲀毒素的基本結構[4]Fig.1 Basic structure of tetrodotoxin

TTX 與其天然存在的衍生物共存，目前已報道的TTX 結構衍生物有20 余種[5]，且新的衍生物種類仍在不斷被發(fā)現(xiàn)[6]，常見的衍生物種類見表1[4]。TTX 及其衍生物的毒性大小與分子中羥基的數(shù)量和位置有關[7]。羥基在衍生物中的氫鍵供體作用，其更易與鈉離子通道結合，使羥基衍生物的毒性比TTX 更高，11-oxoTTX 的毒性是TTX 的4～5 倍[8]。而TTX 的脫氧衍生物，如 5-deoxyTTX 和5,6,11-trideoxyTTX 等，其羥基數(shù)量較少降低了與鈉離子通道的結合能力，毒性低于TTX。TTX 及其衍生物在含毒動物體內(nèi)可同時存在數(shù)種，衍生物多來自于TTX 的代謝或生物合成[9]。

表1 河鲀毒素的常見衍生物種類[4]Tab.1 Common derivatives of tetrodotoxin

1.2 TTX 的分布

TTX 最早于1964 年在鲀科魚類中被發(fā)現(xiàn)，因此被命名為Tetrodotoxin[10]。隨后幾十年，在一系列不同進化水平的生物如藻類、寄生蟲、軟體動物、甲殼動物、棘皮動物、兩棲動物等體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了TTX及其衍生物[11]，含TTX 的代表性生物見表2。不同生境條件下河鲀的TTX 含量差異顯著，河鲀的種間、種內(nèi)、性別、個體和組織器官間TTX 含量都存在顯著差異[12]。Jang 等[13]發(fā)現(xiàn)，河鲀體內(nèi)的TTX 主要蓄積于肝臟和卵巢，但肌肉、血液及其他組織器官中也能夠檢測到。在河鲀的組織器官中，毒素含量較高的為肝臟和卵巢，其次是脾臟、血液和皮膚，精巢和肌肉中的毒素含量較低[14,15]。

表2 含TTX 的代表性生物分布Tab.2 The distribution of representative organisms with tetrodotoxin

1.3 TTX 的檢測方法

根據(jù)我國現(xiàn)行的食品安全國家標準[26]，TTX 檢測方法主要有小鼠生物法（Mouse Bioassay,MBA）、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、液相色譜-熒光檢測法（liquid chromatography-fluorescence,LC-FLR）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）。MBA 法應用廣泛、方法直觀、操作簡便，是中國和日本等國家檢測TTX 含量的公認方法。但該方法的重復性差、靈敏度低，與TTX 共存的無機鹽或疏水大分子氨基酸可明顯降低TTX的相對毒力，導致結果偏低。ELISA 法是免疫檢測法的一種，基于抗原抗體的高度特異性結合和酶的高效催化作用，對樣品中的TTX 進行定性或定量分析，廣泛應用在食品安全領域。采用我國現(xiàn)行標準ELISA 法測定TTX，檢出限可達3 μg/kg，定量限為10 μg/kg。ELISA 法特異性強，基于該方法開發(fā)的試劑盒，適用于養(yǎng)殖場、水產(chǎn)品市場TTX 的現(xiàn)場快速檢測。液相色譜法（liquid chromatography,LC）是一種常用的儀器檢測方法，也是分析領域最廣泛使用的技術手段之一。熒光檢測法（fluorescence,FLR）是較早建立的定量檢測TTX 的儀器分析方法。該法原理是：TTX 經(jīng)強堿水解生成的熒光衍生物在一定范圍內(nèi)與TTX 濃度呈良好的線性關系，可通過測定衍生物含量來定量分析TTX。LC-FLR 法測定TTX 檢出限為50 μg/kg，定量限為150 μg/kg。受方法原理所限，該法需要將TTX 衍生后才能測定，前處理較復雜，檢出限偏高。LC-MS/MS 法與LC-FLR 法相比，不需要進行衍生化即可測定TTX?，F(xiàn)行國標測定標準LC-MS/MS 法測定TTX，檢出限可達1 μg/kg，定量限為3 μg/kg。該法靈敏度高、選擇性好，適用于測定復雜樣品基質(zhì)中的痕量TTX 殘留，也可用于其他檢測方法檢出陽性樣品的二次驗證[27]。除以上介紹的四種國標檢測法外，還有離體組織法、組織培養(yǎng)法、生物檢測器法、免疫層析法、熒光分光光度法和色譜法等多種TTX 檢測方法。

2 TTX 的作用機制

2.1 TTX 對非耐受動物的致毒機制

TTX 是典型的神經(jīng)鈉離子通道阻斷劑[28]和“門控調(diào)控毒素”中的一種，通過阻遏神經(jīng)和肌肉的傳導發(fā)揮毒理作用[29]：毒素被機體吸收進入血液后，能夠高度特異性地與鈉離子通道受體結合，抑制可興奮膜電壓依賴性鈉離子通道的開放，抑制產(chǎn)生動作電位，使神經(jīng)肌肉迅速喪失興奮性，導致以神經(jīng)和肌肉麻痹為主要代表的生理機能障礙，嚴重時可導致血管運動神經(jīng)和呼吸神經(jīng)中樞麻痹而死亡[30]。TTX 的活性基團是1,2,3 位的胍氨基和C-4,9,10 位的羥基，胍基在生理pH 下質(zhì)子化形成的正電活性區(qū)域，與鈉離子通道受體蛋白的負電性羥基相互作用，阻礙離子進入通道[31]。TTX 對神經(jīng)細胞的鈉離子通道敏感性比對心肌和骨骼肌的鈉離子通道敏感性要高很多，且只阻滯可興奮細胞膜的電壓依賴性通道，對靜息電位、靜息膜電位和延遲整復等作用不明顯[32]?；谄渥饔脵C制，在醫(yī)學上已將TTX用于鎮(zhèn)痛、麻醉、抗癌、心血管疾病、神經(jīng)障礙等多種疾病治療的研究[33,34]。

2.2 TTX 耐受動物的免疫機制

河鲀對TTX 的免疫耐受是長期自然選擇的結果[35]，這也使河鲀在生理功能上產(chǎn)生了相應的適應性進化。多項研究表明，TTX 在河鲀體內(nèi)的積累可能具有多種生理行為功能，如作為對捕食者的天然防御、繁殖季節(jié)的交配引誘劑、對受精卵和幼魚的天然防護以及壓力緩解物質(zhì)等[36-38]。河鲀對TTX 的免疫耐受主要取決于其毒素結合位點的一個氨基酸突變[39]。TTX 結合位點位于鈉離子通道內(nèi)高度保守的P-loop 成孔區(qū)。該區(qū)域內(nèi)含有與TTX 高度親和的芳香性氨基酸。在TTX 非耐受動物體內(nèi)，鈉離子通道的α 亞基上存在TTX 受體，當攝入TTX后，毒素與其門孔附近的氨基酸殘基結合，阻止鈉離子進入細胞內(nèi)，引起中毒。而具有毒性的鲀科魚類，在該區(qū)域發(fā)生了芳香性氨基酸向非芳香性氨基酸的置換，顯著影響了與TTX 結合的靈敏度，從而大幅降低TTX 對河鲀鈉離子通道的影響。對紅鰭東方鲀、綠河鲀（Tetraodon nigroviridis）和斑馬魚（Danio rerio）的基因序列圖譜的比較發(fā)現(xiàn)，該置換發(fā)生在Nav1.4 通道的401 位點，取代為一個折疊程度更高的不飽和氨基酸[40]。對豹紋東方鲀（Takifugu pardalis）骨骼肌Nav1.4 通道cDNA 的研究發(fā)現(xiàn)，取代的不飽和氨基酸為天冬酰胺。將該不飽和氨基酸通過基因工程方法移植到小鼠骨骼肌Nav1.4 通道處，隨著移植的不飽和氨基酸折疊程度增高，小鼠耐受TTX 的能力也相應提高[41]。最近，Li 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，麻痹性貝類毒素（Paralytic shellfish toxin,PST）的致毒機理與TTX 相同，雙殼貝類的免疫耐受位點也與河鲀Nav1 中相似（圖2），反映出河鲀和雙殼貝類在面對鈉離子通道海洋生物毒素壓力選擇了分子水平的趨同進化。

圖2 海洋動物鈉離子通道Nav1 具有TTX 或PST 抗性的氨基酸位點（紅色高亮）[42]Fig.2 Amino acids resistant to TTX or PST in sodium channel Nav1 of marine animals（highlighted in red）

3 河鲀體內(nèi)TTX 的積累途徑

從產(chǎn)TTX 細菌的多樣性和含TTX 生物在海洋中的廣泛分布來看，TTX 的產(chǎn)生、積累、轉運和轉化具有十分復雜的機制。曾一度認為TTX 是由河鲀產(chǎn)生的，隨著TTX 在不同物種中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，TTX 的起源問題受到更多毒理學家和海洋生物學家的關注[43]。在研究的不斷深入中逐漸形成了三種假說：外源性假說、內(nèi)共生起源假說和內(nèi)源性假說[44,45]。

3.1 通過食物鏈積累TTX

外源性假說認為，河鲀通過食物鏈在體內(nèi)富集TTX[46]。Noguchi 等通過對河鲀進行一系列毒素蓄積、脫毒和毒素分離試驗后，提出了河鲀體內(nèi)TTX是通過食物鏈富集積累而非由其自身產(chǎn)生的觀點：作為TTX 生產(chǎn)者的海洋細菌在生長過程中分泌和積累毒素，被小的浮游生物、食腐生物等初級消費者攝入后，在扁蟲、紐蟲、織紋螺、扇蟹、海星等次級消費者體內(nèi)進一步富集，最終被食物鏈上游的河鲀大量攝食并在體內(nèi)高濃度的積累[47]。此后，Itoi 等發(fā)現(xiàn)，無毒河鲀在飼喂含TTX 餌料一段時間后，能夠?qū)TX 有效積累到特定組織中，驗證了河鲀體內(nèi)TTX 含量能夠隨著飼喂有毒餌料而迅速積累[48,49]。Zhang 等[50]給暗紋東方鲀投喂含毒和去毒餌料飼喂，對其體內(nèi)毒素的積累和消除具有直接作用，且皮膚和肝臟的積累效率最高。胃灌TTX 實驗結果表明，TTX 最初通過消化道進入血液，然后在肝臟中積累，最后隨著血液循環(huán)轉運到全身其他組織和器官當中[51]。這些研究結果無疑都為TTX 的外源性假說提供了有力證據(jù)，但采用高靈敏度的酶聯(lián)免疫法測定未投喂含毒餌料的養(yǎng)殖河鲀，仍能檢測到少量TTX[52]，因此，食物鏈富集并不能全面解釋河鲀體內(nèi)TTX 的來源。

3.2 利用微生物積累TTX

內(nèi)共生起源假說認為，河鲀通過體內(nèi)共生微生物積累TTX，其最直接的證據(jù)是從不同物種中分離出多種產(chǎn)TTX 的共生微生物。自1986 年Noguchi從花紋愛潔蟹（Atergatis floridus）中分離出產(chǎn)TTX弧菌后，相繼從多種海洋生物中分離出弧菌（Vibrio）、假單胞菌（Pseudomonas adaceae）、芽孢桿菌（Bacillus）、交替單胞菌（Alteromonas）、氣單胞菌（Aeromonas）、交替假單胞菌（Pseudoalteromonas）、鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum），及不動桿菌（Acinetobacter）等產(chǎn)TTX 的共生細菌[53-58]。海洋微生物產(chǎn)生具有離子阻斷作用的毒素通常是細菌生長進入穩(wěn)定期后的次級代謝產(chǎn)物。微生物發(fā)酵實驗發(fā)現(xiàn)，菌株發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的TTX 比野生河鲀體內(nèi)的含量要少的多[59]。其原因除了環(huán)境因素和實驗誤差外，主要是河鲀作為產(chǎn)TTX 共生菌的宿主，能夠提供必要的信號分子來誘導其產(chǎn)生更多毒素，因此體外培養(yǎng)實驗結果偏低[60]。微生物發(fā)酵產(chǎn)生的TTX 與經(jīng)食物鏈富集積累在河鲀體內(nèi)的TTX 的結構不同。Matsumura[61]發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌所產(chǎn)生的TTX 雖然具有毒性，但與河鲀體內(nèi)TTX 的單克隆抗體不能發(fā)生反應，說明兩種毒素的結構不完全相同，推測其可能是TTX 的前體或衍生物[61]。該研究結果表明，河鲀體內(nèi)的TTX 并不是直接來自于共生微生物，而可能是TTX 的前體或相似物轉化而來，為TTX 在河鲀體內(nèi)的轉化積累提供了重要證據(jù)。微生物自身的毒素從何而來，是環(huán)境脅迫時相關基因的表達，還是調(diào)節(jié)自身生長生理狀態(tài)的自然產(chǎn)物，目前尚無結論。微生物產(chǎn)TTX 的誘因及機制有待進一步深入研究。

3.3 河鲀積累TTX 的分子機制

內(nèi)源性假說認為，河鲀本身具有轉化和積累TTX 的能力。Matsumura 等[62]測定發(fā)現(xiàn)，星點東方鲀?nèi)斯な诰雅咛ブ械腡TX 含量，隨著胚胎發(fā)育不斷增加，證實了河鲀在胚胎階段即能產(chǎn)生毒素。Itoi 等[52]通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和免疫組織化學分析發(fā)現(xiàn)，河鲀卵巢內(nèi)的TTX 能夠垂直傳遞給受精卵，并在孵化后以保護層的形式附著于幼魚體表。目前，在河鲀體內(nèi)并未找到分泌毒素的腺體和導管，表明TTX 在河鲀體內(nèi)從頭合成的可能性較小。但河鲀體內(nèi)可能存在著復雜的調(diào)控機制，能將食物鏈富集或共生微生物產(chǎn)生的TTX 及其類似物轉化為河鲀體內(nèi)TTX，并將其轉運積累到不同組織器官當中。研究發(fā)現(xiàn)，河鲀毒素結合蛋白（pufferfish saxitoxin and tetrodotoxin binding protein,PSTBP）在河鲀的TTX 耐受中具有重要功能。PSTBP 是一種從河鲀血漿中分離出來的毒素結合蛋白，能夠作為載體蛋白通過河鲀的血液循環(huán)將TTX 運輸?shù)教囟ńM織，與TTX 轉運密切相關[63]。PSTBP 由兩個與三丁基錫結合蛋白（tributyltin-binding protein type 2,TBT-bp2）序列相似性極高的串聯(lián)結構域組成，TBT-bp 對水生動物具有很高的毒性[64]。然而，Tatsuno 等[65]在無毒養(yǎng)殖河鲀中也發(fā)現(xiàn)了PSTBP 同系物，而在部分有毒野生河鲀中則沒有檢測到PSTBP，表明PSTBP 至少不是調(diào)控TTX 積累的唯一蛋白。據(jù)報道，紅鰭東方鲀肝臟中的纖維蛋白原（fibrinogen-like proteins,FLP）、載脂蛋白（apolipoprotein,APO）、熱休克蛋白家族A（heat shock protein 70,HSP70）、補體C5（complement C5,C5）、白細胞介素6（interleukin 6,IL6）以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的長鏈酯酰輔酶A 合成酶（long-chain acyl-CoA synthetase,ACSL）等基因家族中的基因也與河鲀體內(nèi)TTX 的代謝相關[66-69]。在對河鲀肝臟組織進行核酸雜交和cDNA 末端快速擴增實驗后發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白原基因flp-1、flp-2、flp-3 的表達量與肝臟的毒力水平呈線性關系，推測flp 基因可能與TTX 的積累轉化相關[70]。載脂蛋白基因（apo）是一個編碼多種與血漿脂質(zhì)轉運相關結合蛋白的基因家族。在肌肉注射TTX 實驗中，紅鰭東方鲀體內(nèi)的apoa1、apoe2 和apoh 基因在肝臟中表達上調(diào)[66]。熱休克蛋白家族A 基因（hsp70）在蛋白質(zhì)加工、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)以及減緩細胞應激和凋亡反應中發(fā)揮重要作用[71]。與無毒養(yǎng)殖紅鰭東方鲀相比，野生紅鰭東方鲀肝臟中的白細胞介素6 信號轉導物（interleukin 6 cytokine family signal transducer,il6st）和補體C5（c5）基因的表達水平顯著升高[67]，這些基因通常被認為是先天免疫系統(tǒng)的一部分，參與宿主防御和抗凋亡。ACSL 通常在脂質(zhì)生物合成中發(fā)揮關鍵作用，并可能與認知功能相關。在TTX 浸泡實驗中，紅鰭東方鲀鼻區(qū)和腦組織中均檢測到acsl5 基因表達上調(diào)，表明acsl5 基因在TTX 感知和吸收中可能具有潛在功能[69]。雖然已有以上TTX 相關的蛋白或基因被報道，但基于TTX 調(diào)控機制的復雜性，目前的研究結果仍不足以解釋TTX 耐受動物中TTX 的積累、轉運、轉化和解毒機制。

與TTX 相似的鈉離子通道致毒機制也存在于其他海洋生物毒素中，如廣泛存在于雙殼貝類和河鲀中的麻痹性貝毒（paralytic shellfish toxins,PSTs）、短裸甲藻毒素（brevetoxin,BTX）等。TTX 和PSTs 還經(jīng)常在同一個體中被檢測到[72,73]。因此，鈉通道毒素在耐受動物體內(nèi)可能具有相似的分子機制，參與調(diào)控PSTs、BTX 等相似海洋生物毒素代謝的基因很可能也與TTX 的積累、轉運和轉化調(diào)控相關。已有研究表明，抗氧化、免疫、解毒和抗凋亡相關基因在PST 耐受動物中的誘導表達可能與其耐毒機制相關。其中，與抗氧化防御相關的基因包括谷胱甘肽巰基轉移酶（glutathione S-transferase,GST）[74]、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GPx）[75]、硫氧還蛋白（thioredoxin,TXN）[76]、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）[77]等。已證明，GPxs 在軟體動物的各種細菌感染、先天免疫防御以及化學污染物引起的抗氧化應激中發(fā)揮重要作用[78]。雙殼貝類暴露于PST 后，GST 的解毒和抗氧化酶活性增加，顯示出GST 在減輕PST 毒性方面的潛在功能[79]。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）與抗凋亡、免疫和炎癥相關。扇貝iap 基因可能與肝胰臟和腎臟組織中的耐受相關[80]。已發(fā)現(xiàn)與PSTs 轉運相關的蛋白有溶質(zhì)轉運蛋白（solute carrier,SLC）[81]和ABC 轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter,ABC）[82]。這兩大類膜轉運蛋白可能介導了雙殼貝類對PST 的吸收和外排?；谝陨涎芯炕A，近期有研究首次報道，sod、gst、abc、gpx、txn、iap 和slc 等基因家族的基因可能在紅鰭東方鲀體內(nèi)TTX 的積累、轉運和代謝過程中發(fā)揮重要作用[83]。通過相似鈉通道毒素調(diào)控基因進一步挖掘河鲀體內(nèi)與TTX積累轉運相關的基因，有助于更全面地理解TTX 的調(diào)控機制和河鲀耐受TTX 的適應性進化。

4 總結與展望

隨著河鲀產(chǎn)業(yè)的有條件放開，TTX 檢測技術的不斷提升和新的衍生物相繼發(fā)現(xiàn)，對TTX 在河鲀體內(nèi)的積累途徑有了進一步的理解。雖然現(xiàn)有研究尚不足以全面揭示河鲀體內(nèi)TTX 積累、轉運和代謝的復雜機制，但隨著組學技術的不斷發(fā)展和廣泛應用，利用多組學技術系統(tǒng)挖掘TTX 積累轉運過程中的重要分子途徑和關鍵基因功能，能夠?qū)喻兎e累轉運TTX 的過程有更深入的認識，也有利于揭示河鲀在面對TTX 壓力選擇下的適應性進化機制，為今后通過遺傳改良降低河鲀TTX 的積累提供理論依據(jù)。