低溫鍛煉提高水稻秧苗耐低溫能力的生理和分子機制研究

徐青山 魏倩倩，2 孔亞麗 潘 林，3 朱練峰田文昊 張均華，* 朱春權，*

（1中國水稻研究所，水稻生物育種全國重點實驗室，浙江 杭州 310006；2安徽大學資源與環(huán)境工程學院，安徽 合肥 230039；3牡丹江師范學院生命科學與技術學院，黑龍江 牡丹江 157000）

水稻（Oryza sativaL.）是我國重要的糧食作物之一。據(jù)國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)顯示，2020 年全國早稻種植面積為0.71 億畝，雙季稻種植面積為1.43 億畝，兩者種植面積占水稻種植總面積的47.22%［1］。而隨著全球氣候變暖，生產(chǎn)上大幅提前水稻播種時間，使單季早稻和雙季早稻育秧期間更易遭受極端低溫天氣的侵擾。因此，提高水稻秧苗的耐低溫能力對確保我國早稻和雙季稻的安全生產(chǎn)有重要意義。

逆境鍛煉是指植株經(jīng)過前期適度的逆境處理后，產(chǎn)生可逆的染色質(zhì)表觀修飾變化，使植物在再次面對嚴重的相同或不同逆境脅迫時產(chǎn)生較強抗性的現(xiàn)象［2］。根據(jù)再次發(fā)生的非生物脅迫的類型及時間，可將非生物逆境鍛煉類型分為四類：當代同種逆境鍛煉效應、當代交叉逆境鍛煉效應、跨代同種逆境鍛煉效應和跨代交叉逆境鍛煉效應［3-4］。與未經(jīng)過鍛煉植株相比，經(jīng)過鍛煉植株的信號調(diào)控物質(zhì)、次級代謝產(chǎn)物、脅迫保護性物質(zhì)等可以更快、更有效地對再次發(fā)生的逆境脅迫產(chǎn)生響應，從而增強植株耐逆性［5-6］。例如，用水稻生長臨界溫度進行低溫鍛煉能通過提高水稻總酚含量、抗氧化酶活性和水稻耐冷基因的表達量來提高水稻抗低溫能力［7］；低溫鍛煉可減輕后期低溫脅迫對荷花地下莖膜系統(tǒng)的傷害、增加細胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量、提高抗氧化酶活性，從而提高荷花的抗寒性［8］。

水稻育秧是水稻生產(chǎn)過程中的重要一環(huán)，提高水稻育秧的抗寒性對于早稻幼苗的發(fā)育至關重要。有關低溫鍛煉提高植物耐低溫能力的研究已有報道，但對于低溫鍛煉提高水稻秧苗耐低溫能力的生理與分子機制研究仍較少。因此，本研究通過基質(zhì)育秧對兩葉一心期的秧苗進行低溫鍛煉處理，常溫恢復2 d 后，再次對秧苗進行低溫脅迫處理，并測定水稻秧苗的生化指標和基因表達，旨在闡明前期低溫鍛煉提高水稻秧苗耐低溫能力的生理與分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以中國水稻研究所提供的傳統(tǒng)秈型早稻中早39作為試驗水稻品種，并用其研發(fā)的無土基質(zhì)（廣西常樂科技股份有限公司）作為育秧基質(zhì)，其中基質(zhì)pH 值為6.39±0.02，電導率為（3.57±0.04） mS·cm-1，容重為（0.29±0.01） g·cm-3，全氮含量為（4.99±0.50） g·kg-1，全磷含量為（2.65±0.37） g·kg-1，全鉀含量為（11.47±0.79） g·kg-1，堿解氮含量為（1 100.63±27.20） mg·kg-1，有機磷含量為（87.60±3.84） mg·kg-1，速效鉀含量為（1 899.73±23.10） mg·kg-1。

1.2 試驗設計

用2.6%的次氯酸鈉處理水稻種子30 min，隨后用去離子水沖洗種子3 遍。將沖洗后的種子放在清水中浸泡48 h，然后用去離子水沖洗種子3次，將種子放置在培養(yǎng)箱中32 ℃催芽24 h。將催芽后的種子均勻的播在七寸秧盤中，每個秧盤播90 g種子，待種子長到兩葉一心期時，將秧苗進行低溫鍛煉1 d，恢復2 d后再次進行為期3 d的低溫脅迫處理，每個處理3個重復（表1）。處理結束后收集水稻樣品用液氮研磨，置于-80 ℃冰箱進行保存，隨后進行生理指標的測定。

表1 試驗設計Table 1 Experimental design

1.3 基質(zhì)指標測定

基質(zhì)pH值和電導率在10∶1的水土比下振蕩30 min后用便攜式pH/離子/溶解氧多參數(shù)測定儀（上海梅特勒-托利多有限公司）進行測定；基質(zhì)樣品用H2SO4-H2O2消煮后，全氮磷鉀含量分別采用半微量凱氏法、鉬睇抗比色法和火焰光度計法進行測定；堿解氮含量采用堿解擴散法測定；有機磷含量（NaHCO3浸提）用鉬睇抗比色法測定；速效鉀含量（NH4OAc 浸提）用火焰光度計法進行測定［9］。

1.4 植株指標測定

1.4.1 秧苗素質(zhì)考察 每個秧盤隨機選取20 株處理過后的秧苗，分別量取其根長、株高、葉齡和根數(shù)。取10 株秧苗，莖部并攏量取莖基寬，同時稱取20 株秧苗的地上部干重和地下部干重［10］。

1.4.2 水勢和根系活力測定 葉片水勢采用WP4C

露點水勢儀（美國METER公司）進行測定，根系活力采用氯化三苯基四氮唑法測定［11］。

1.4.3 葉綠素含量和光系統(tǒng)II 熒光量子效率測定葉綠素含量采用95%的乙醇提取，隨后在470、649 和665 nm下比色，通過以下公式計算葉綠素a（chlorophyll a，Chl a）和葉綠素b（chlorophyll b，Chl b）含量［12］：

式中，A649、A665分別為葉綠素提取液在649和665 nm處的吸光值。

最大光化學效率（maximum photochemistry efficiency，F(xiàn)v/Fm）和實際光化學效率（actual photochemical efficiency，ΦPSⅡ）采用PAM-2500 便攜式調(diào)制葉綠素熒光儀（德國WALZ公司）測定［13］。

1.4.4 丙二醛含量及抗氧化酶活性測定 丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法進行測定［9］；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用高錳酸鉀滴定法進行測定［14］；過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性采用氮藍四唑法進行測定［15］；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）和抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性采用蘇州科銘生物技術有限公司的檢測試劑盒測定。

1.4.5 耐冷基因相對表達量測定 將水稻幼苗葉片剪下，加入液氮充分研磨，取0.05 g置于2 mL無菌離心管中，加入1 mL TRIzol和0.2 mL氯仿，搖勻，冰置5 min，隨后4 ℃下13 000 r min-1離心5 min，取上層水液置于新的無菌離心管中。隨后加入0.5 mL 異丙醇，搖勻冰置10 min后，4 ℃下13 000 r min-1離心5 min，棄去上清液，再向其中加入1 mL 75%的乙醇將沉淀清洗，4 ℃下13 000 r min-1離心5 min 后，棄去乙醇，室溫干燥RNA沉淀后向其中加入0.2 mL 的滅菌去離子水溶解RNA沉淀，此時溶液即為RNA 提取液。RNA 提取后，用NanoPhotometer-N50（德國Implen公司）檢測總RNA的純度和含量，用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA的完整性。然后使用PrimeScript 逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）將其逆轉錄成cDNA。最后，采用Sybgreen（日本TaKaRa 公司）進行實時熒光定量PCR。以OsHistone為內(nèi)參基因，所選基因的引物和內(nèi)參引物詳見表2。

表2 本研究所用引物序列Table 2 The sequences of primers used in the present study

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SAS9.2軟件進行統(tǒng)計分析（單因素方差分析），均數(shù)采用Tukey 法檢驗統(tǒng)計學差異。采用Origin2018 軟件繪制圖表，圖、表中不同字母表示處理間均值在P<0.05水平上有統(tǒng)計學差異。

2 結果與分析

2.1 秧苗形態(tài)

由圖1 可知，與常溫處理相比，直接低溫脅迫的秧苗因出現(xiàn)生理性失水而使葉片卷曲，而經(jīng)過低溫鍛煉后的秧苗遭受低溫脅迫時，葉片未出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象，說明低溫鍛煉維持了秧苗體內(nèi)水分代謝平衡，避免了水稻在低溫脅迫下的生理性失水現(xiàn)象。

圖1 不同處理對水稻秧苗形態(tài)的影響Fig.1 Effect of different treatments on rice seedling morphology

2.2 秧苗素質(zhì)

由表3可知，與常溫處理（N+N、E+N）相比，低溫處理（N+C、E+C）下秧苗的株高、根長、葉齡、莖基寬和地下部干重整體顯著下降，根數(shù)和地上部干重也存在下降趨勢，但差異不顯著。而經(jīng)過低溫鍛煉的水稻，在對其再次進行為期3 d 的低溫脅迫后（E+C），其地下部干重較直接進行低溫脅迫處理（N+C）顯著提高8.36%，其余參數(shù)與直接低溫脅迫處理相比并無顯著差異。

表3 不同處理對水稻秧苗素質(zhì)的影響Table 3 Effect of different treatments on the quality of rice seedlings

2.3 水稻葉片水勢及根系活力

由圖2 可知，與常溫處理（N+N）相比，低溫處理（N+C）下水稻葉片的水勢和根系活力分別顯著下降81.56%和18.22%，但經(jīng)過低溫鍛煉的水稻，在對其再次進行低溫脅迫后（E+C），其根系活力較直接低溫脅迫處理（N+C）顯著提升70.39%，同時，葉片的水勢提高6.20%，但差異并不顯著。

圖2 不同處理對水稻秧苗葉片水勢和根系活力的影響Fig.2 Effect of different treatments on leaf water potential and root activity of rice seedlings

2.4 葉綠素含量和光系統(tǒng)Ⅱ量子熒光效率

由圖3 可知，與常溫處理（N+N）相比，低溫處理（N+C）下水稻葉片的葉綠素a、葉綠素b含量、ΦPSⅡ和Fv/Fm顯著降低。而經(jīng)過低溫鍛煉的秧苗，再次面對低溫脅迫時（E+C），其葉片葉綠素a、葉綠素b 含量、ΦPSⅡ和Fv/Fm較直接低溫脅迫處理（N+C）的秧苗分別顯著提高15.89%、13.61%、32.11%和19.07%。

圖3 不同處理對水稻秧苗葉片葉綠素含量和光系統(tǒng)II量子熒光效率的影響Fig.3 Effect of different treatments on chlorophyll content and photosystem II quantum fluorescence efficiency of rice seedling leaves

2.5 抗氧化酶活性及丙二醛含量

由表4 可知，與常溫處理（N+N）相比，低溫脅迫處理（N+C）顯著提高了水稻體內(nèi)CAT、SOD 活性和MDA 含量。而經(jīng)過低溫鍛煉的秧苗，再次面對低溫脅迫時（E+C），其GPX、APX、CAT 和POD 活性較直接低溫脅迫處理（N+C）秧苗分別顯著提高13.68%、13.28%、13.27%和17.83%，同時MDA 含量顯著降低25.87%。

表4 不同處理對水稻秧苗抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響Table 4 Effect of different treatments on antioxidant enzyme activity and malondialdehyde content of rice seedlings

2.6 耐冷基因相對表達量

由圖4 可知，與常溫處理（N+N）相比，低溫脅迫處理（N+C）顯著提高了耐冷基因OsTrx23的相對表達量，而耐冷基因OsLti6a、OsLti6b和OsCOIN的相對表達量則顯著降低。經(jīng)過低溫鍛煉的秧苗，再次面對低溫脅迫時（E+C），其耐冷基因OsTrx23、OsLti6a、OsLti6b和OsCOIN的相對表達量較直接低溫脅迫處理（N+C）整體顯著提高1.17、0.15、0.58和1.26倍。

圖4 不同處理對水稻秧苗耐冷基因相對表達量的影響Fig.4 Effect of different treatments on the relative expression of cold tolerance genes in rice seedlings

3 討論

3.1 低溫鍛煉對低溫脅迫下水稻秧苗吸收水肥能力的影響

在低溫寡照下，植株的根系活力會顯著降低，根系的代謝過程也會遭到破壞；發(fā)育不良的根系不僅不利于養(yǎng)分和水分吸收，更會阻礙養(yǎng)分和水分向地上部運輸［16］。在本試驗中，低溫脅迫會使水稻秧苗出現(xiàn)生理性失水，導致植株水勢顯著降低，而經(jīng)過低溫鍛煉的秧苗再次遭受低溫脅迫時，其葉片形態(tài)并不會發(fā)生失水卷曲，而是仍然保持伸展狀態(tài)（圖1）。同時，低溫脅迫還會使秧苗根系發(fā)育不良，根系活力嚴重下降，而經(jīng)過低溫鍛煉的秧苗再次遭受低溫脅迫時，其根系活力會顯著增加（圖2）。由此推測低溫鍛煉可能通過提高水稻秧苗的根系活力來提高根系的吸水能力，使低溫脅迫下的秧苗維持正常的水分代謝平衡，促使低溫脅迫下的水稻秧苗葉片仍維持較高的水勢。

3.2 低溫鍛煉對低溫脅迫下水稻秧苗葉綠素含量和光系統(tǒng)II量子熒光效率的影響

與常溫下生長的植株相比，低溫脅迫會通過改變植株的葉片形態(tài)，降低植株葉片的相對生長率、葉面積比率和葉綠素含量來抑制植物的光合作用，最終降低植株生物量［17］。同時，低溫脅迫對水稻早期營養(yǎng)生長的主要生理效應是由光系統(tǒng)II的電子傳遞抑制引起的光抑制，而Fv/Fm是檢測光抑制的典型指標［18］。在本試驗中，通過對不同處理下水稻葉片Chl a、Chl b 含量、Fv/Fm和ΦPSⅡ的測定發(fā)現(xiàn)，與常溫處理的秧苗相比，直接進行低溫脅迫處理的水稻秧苗Chl a、Chl b 含量、Fv/Fm和ΦPSⅡ均顯著降低，而經(jīng)過低溫鍛煉的秧苗再次遭受低溫脅迫時，其Chl a、Chl b含量、Fv/Fm和ΦPSⅡ依然維持較高水平（圖3）。這表明前期低溫鍛煉處理可以通過提高水稻秧苗葉片葉綠素含量、最大光化學效率和實際光化學效率來促進低溫脅迫處理下水稻秧苗的光合作用，同時緩解低溫脅迫給水稻葉片帶來的光抑制，從而使水稻秧苗維持較高的光合特性。

3.3 低溫鍛煉對低溫脅迫下水稻秧苗抗氧化能力的影響

增強抗氧化能力是低溫鍛煉提高植株耐冷性的主要途徑之一［19-22］。前人對紅掌葉片研究發(fā)現(xiàn)，低溫鍛煉可以通過提高SOD 和CAT 活性及增強POD 的穩(wěn)定性來減緩紅掌葉片膜脂過氧化作用以降低電解質(zhì)滲出率，從而提高紅掌的抗寒性，延長紅掌幼苗寒害（4 ℃）致死臨界時間［23］。生育前期經(jīng)過低溫鍛煉的植株較未鍛煉的植株具有較高的能量捕獲和電子傳遞能力，SOD、APX 和CAT 活性增加抑制了光合系統(tǒng)的氧化爆發(fā)，減輕了細胞膜脂過氧化傷害，有助于保持低溫脅迫下植株的光合碳同化能力和膜穩(wěn)定性［24］。在本試驗中，低溫脅迫顯著提高了水稻秧苗GPX、CAT和SOD活性和MDA含量，降低了APX和POD活性。而經(jīng)過低溫鍛煉的秧苗再次遇到低溫脅迫時，其體內(nèi)CAT、APX和POD活性均較直接低溫脅迫處理的秧苗顯著上升，GPX 和SOD 活性也有所上升，但差異不顯著，此外，經(jīng)過低溫鍛煉的秧苗再次遇到低溫脅迫時，其MDA 含量的上升幅度也會降低（表4）。這說明低溫鍛煉處理可以通過增強抗氧化能力提高水稻秧苗的耐冷性。

3.4 低溫鍛煉對低溫脅迫下水稻秧苗耐冷基因表達的影響

低溫鍛煉上調(diào)低溫響應相關基因的表達是提高植株耐低溫性的重要途徑之一。Wang 等［25］發(fā)現(xiàn)低溫鍛煉有效上調(diào)了低溫脅迫下低溫反應基因的表達，導致抗氧化活性和抗氰呼吸能力增加，從而提高小麥植株對低溫脅迫的耐受性。Kosova 等［26］的研究也表明，低溫鍛煉可以通過誘導茉莉酸生物合成酶的基因的表達來誘導內(nèi)源性茉莉酸的產(chǎn)生，進而提高小麥的耐低溫能力。前人研究已證實OsTrx23、OsLti6a、OsLti6b和OsCOIN都參與水稻的耐低溫調(diào)節(jié)［27-30］。本研究通過測定上述基因的相對表達量，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下耐冷基因OsLti6a、OsLti6b和OsCOIN的相對表達量均顯著降低，而經(jīng)過低溫鍛煉的秧苗再次遭受低溫脅迫時，耐冷基因OsLti6a、OsLti6b和OsCOIN相對表達量仍能維持較高水平（圖4）。與OsLti6a、OsLti6b和OsCOIN不同的是，低溫脅迫下耐冷基因OsTrx23的相對表達量會顯著提高，而經(jīng)過低溫鍛煉的秧苗再次遭受低溫脅迫時，OsTrx23的相對表達量會進一步提高（圖4），說明耐冷基因OsTrx23在水稻秧苗的低溫脅迫過程中更加敏感。

4 結論

低溫脅迫會抑制水稻秧苗的生長。前期低溫鍛煉處理可以通過提高低溫脅迫下水稻秧苗的根系活力、葉片水勢、葉綠素含量、光系統(tǒng)II 量子熒光效率、抗氧化酶CAT、APX和POD活性及耐冷基因Oslti6a、Oslti6b、OsCOIN和OsTrx23的相對表達量，同時降低MDA 含量來增強水稻秧苗的耐低溫能力。