FLS基因調(diào)控玉蘭與紫玉蘭花色形成的機(jī)制研究

吳 超 戴夢(mèng)怡 張 超 石從廣 任明杰 馬晶晶，* 申亞梅，*

（1浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江省園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023）

玉蘭屬（Yulania）植物是園林綠化中應(yīng)用廣泛的觀花植物，該屬植物花色豐富，主要有白色、紫色、紅色、黃色、粉紅色等。特異花色是玉蘭屬植物最重要的觀賞形狀之一，也是玉蘭屬新品種改良及培育的重要目標(biāo)之一。影響植物花色的色素主要有三類(lèi)：類(lèi)黃酮、類(lèi)胡蘿卜素和甜菜堿［1］。類(lèi)黃酮是影響花色的主要物質(zhì)，自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過(guò)10 000種類(lèi)黃酮化合物，根據(jù)其結(jié)構(gòu)性質(zhì)可以分為6 個(gè)亞類(lèi)：黃烷酮類(lèi)、黃酮類(lèi)、異黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)、原花青素類(lèi)和花青素類(lèi)［2-3］。玉蘭屬植物花被片中影響花色的類(lèi)黃酮化合物包含2 種花青素苷元（矢車(chē)菊素和芍藥花素）和3 種黃酮醇苷元（鼠李糖苷、葡萄糖苷和蘆丁糖苷）［4］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，矢車(chē)菊素和芍藥花素分別使玉蘭屬植物花被片呈現(xiàn)紫紅色和紫色，而黃酮醇作為一種助色素，發(fā)揮輔助著色作用［5-6］。

黃酮醇代謝途徑起始于苯丙氨酸，是類(lèi)黃酮化合物代謝途徑的一個(gè)分支［7］。黃酮醇合成酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS）是重要的節(jié)點(diǎn)酶，與二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）競(jìng)爭(zhēng)共同底物二氫黃酮醇，影響黃酮醇合成支路對(duì)代謝流的競(jìng)爭(zhēng)能力，進(jìn)而影響黃酮醇的積累［8］。當(dāng)類(lèi)黃酮代謝流主要流向黃酮醇合成支路時(shí)，會(huì)極大影響花青素苷合成支路，造成花青素苷的積累過(guò)少，引起花色變化［9-10］。Holton 等［11］在矮牽牛（Petunia hybrida）中首次克隆出FLS基因，發(fā)現(xiàn)反義表達(dá)能顯著減少花瓣中黃酮醇含量，花瓣顏色明顯加深；在煙草（Nicotiana tabacum）中轉(zhuǎn)錄后沉默PhFLS基因，黃酮醇含量減少25%～93%［12］。在其他物種中FLS的功能得到進(jìn)一步驗(yàn)證，如王族海棠（Malus spectabilisRoyalty）和火焰海棠（M.spectabilisFlame）葉片中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)McFLS基因，黃酮醇含量顯著上升，花青素含量顯著下降［13］；在蘋(píng)果（Malus domestica）愈傷組織中過(guò)表達(dá)MdFLS1顯著增加了黃酮醇含量，而花青素含量明顯降低［14］。玫瑰（Rosa rugosa）RrFLS1［15］、桃（Prunus persica）PpFLS［15］、茶（Camellia sinensis）CsFLS［16］、菊花（Chrysanthemum morifolium）CmFLS［17］、楊梅（Myrica rubra）MrFLS［18］在煙草中過(guò)表達(dá)，煙草花冠顏色變淺，黃酮醇含量顯著增加，花青素苷含量明顯減少。由此可見(jiàn)，F(xiàn)LS基因具有調(diào)控植物組織黃酮醇積累的功能，從而影響花青素苷合成支路的代謝流分配，在植物組織的呈色機(jī)制中發(fā)揮重要作用［19］。

目前對(duì)玉蘭花色調(diào)控機(jī)制的研究主要集中于花青素苷［5-6，20］，而黃酮醇的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此，本研究通過(guò)測(cè)定玉蘭和紫玉蘭花被片黃酮醇含量變化，并對(duì)黃酮醇合成途徑關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因FLS的表達(dá)模式及功能進(jìn)行分析，以期為木蘭科植物花色形成機(jī)制及新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇浙江省杭州市浙江農(nóng)林大學(xué)東湖校區(qū)25 年生玉蘭與紫玉蘭實(shí)生苗為試驗(yàn)材料。分別于2020 年2—9 月陸續(xù)采集玉蘭和紫玉蘭花蕾期、露色期、初開(kāi)期、半開(kāi)期、盛開(kāi)期的最外輪的花被片（圖1）及老葉、嫩葉、莖和根。采集材料后立即放入液氮中，再轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中保存。每份樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

圖1 玉蘭與紫玉蘭五個(gè)不同的開(kāi)花時(shí)期Fig.1 Different stages of flowering in Y. denudata and Y. liliiflora

黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品槲皮素3-O-蕓香糖苷（蘆?。┵?gòu)自上海源葉生物科技有限公司；pMD?18-T 載體購(gòu)自TaKaRa 有限公司（日本）；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101 購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；過(guò)表達(dá)載體pORE_R4 和煙草NC89（N.tabacumNC89）無(wú)菌苗均由浙江農(nóng)林大學(xué)浙江省園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 花被片中黃酮醇提取與含量測(cè)定

分別稱取0.1 g玉蘭與紫玉蘭各開(kāi)花時(shí)期凍存的花被片樣品，利用液氮研磨至粉末，加入1.5 mL 提取液（2%甲酸、70%甲醇），搖勻，在4℃條件下10 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，使用0.22 μm 有機(jī)過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾，后裝入1.5 mL進(jìn)樣瓶。

黃酮醇定量分析采用ACQUITY UPLCH-Class 超高效液相色譜儀（Waters，美國(guó)），采用C18 色譜柱（粒徑1.8 μm，2.1 mm?100 mm，Waters，美國(guó)），進(jìn)樣體積2 μL，流速0.4 mL·min-1，色譜柱溫度設(shè)置為35℃。流動(dòng)相A相為0.3%甲酸水，B相為純乙腈，C相為純甲醇，D 相為10%甲醇。洗脫梯度：0 min，95% A，5% B；2 min，82% A，18% B；10 min，70% A，30% B；11 min，10% A，90% B；12 min，95% A，5% B；16 min，95% A，5% B。在350 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)黃酮醇組分，得到色譜圖。

使用外標(biāo)法得出玉蘭與紫玉蘭花被片中黃酮醇含量。黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品為槲皮素3-O-蕓香糖苷（蘆?。Ｍㄟ^(guò)外標(biāo)法，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成5、50、125、250、500、1 000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)各濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析。以標(biāo)準(zhǔn)品的不同梯度濃度作為橫坐標(biāo)，各濃度對(duì)應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=10 533x+12 592。隨后根據(jù)所測(cè)樣品的分析結(jié)果中所得到的各個(gè)峰面積，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)的濃度，以此計(jì)算每克凍存的花被片中所含有的黃酮醇含量。

1.3 FLSs基因克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)已有的玉蘭與紫玉蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank SRA accession： PRJNA922720、PRJNA922723），查找黃酮醇合成酶基因序列，分別命名為YdFLS、YlFlS，使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。用混合的5 個(gè)時(shí)期花被片cDNA 為模板進(jìn)行特異克隆。PCR 的反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Premix Taq 10 μL，ddH2O 6 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，10 ℃保持。使用瓊脂糖凝膠DNA 提取試劑盒（TaKaRa，日本）對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收。將切膠回收的產(chǎn)物連接到pMD?18-T 載體，后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性篩選并進(jìn)行菌檢，將陽(yáng)性菌液進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，確定基因的最終序列。

表1 玉蘭和紫玉蘭FLS基因克隆、表達(dá)和構(gòu)建載體引物Table 1 Primers for cloning FLS gene，expression analysis and vectors construct of Y. denudata and Y. liliiflora

利用ProtParam 在線網(wǎng)站（https：//web. expasy. org/protparam/）分析FLSs 氨基酸組成、理論分子量和等電點(diǎn)；利用ProtScale 在線網(wǎng)站（https：//web. expasy. org/protscale/）預(yù)測(cè)FLSs 蛋白的親疏水性；利用CLC Sequence 8.0 對(duì)YdFLS 與YlFLS 的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；利用在線網(wǎng)站NCBI CD-search（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）對(duì)FLSs氨基酸保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；利用SOPMA網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat. pl？page=npsa_sopma. html）對(duì)FLSs進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.4 FLSs多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

使用CLC Sequence 8 軟件對(duì)YdFLS 和YlFLS 進(jìn)行多序列比對(duì)；通過(guò)MEGA 11 軟件的鄰接法（neighborjoining method，NJ）對(duì)YdFLS、YlFLS、蘆筍（Asparagus officinalis）AoFLS、洋蔥（Allium cepa）AcFLS、水仙（Narcissus tazetta）NtFLS、參薯（Dioscorea alata）DaFLS、沉水樟（Cinnamomum micranthum）CmFLS、芒果（Mangifera indica）MiFLS、茶（Camellia sinensis）CsFLS、馬鈴薯（Solanum tuberosum）StFLS、蘋(píng)果（M. domestica）MdFLS、葡萄（Vitis vinifera）VvFLS、擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtFLS 建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并采用Bootstrap 法（重復(fù)1 000次）評(píng)估檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 FLSs表達(dá)分析

利用RNAperp Plant Kit 試劑盒（諾和致源，北京）提取玉蘭和紫玉蘭花、莖、嫩葉、老葉和根的總RNA，使用Reverse Transcriptase M-MLV（TaKaRa，日本）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物（表1）。選用望春玉蘭MdTEF作為內(nèi)參基因［21］。qRT-PCR 反應(yīng)使用LightCycler 480Ⅱ熒光定量?jī)x（Roche，瑞士），反應(yīng)體系共10 μL：上下游引物各0.4 μL，cDNA 模板2 μL，BCG qPCR Master Mix熒光染料（百凱基生物，北京）5 μL，ddH2O 2.2 μL。兩步法擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃持續(xù)5 s，60 ℃持續(xù)1 min，95 ℃持續(xù)15 s。采用2-△△Ct方法計(jì)算玉蘭和紫玉蘭不同組織和不同發(fā)育階段花被片的FLSs基因的表達(dá)量。

1.6 FLSs亞細(xì)胞定位

利用同源重組的方法構(gòu)建pORE_R4-YdFLS 和pORE_R4-YlFLS 重組質(zhì)粒，后將兩個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101 中。選擇陽(yáng)性菌液于發(fā)根農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中28 ℃ 200 r·min-1過(guò)夜震蕩培養(yǎng)，用侵染液重懸菌體至OD600=0.1，28 ℃黑暗環(huán)境震蕩3 h 待用。選擇外表無(wú)破損的洋蔥（A. cepa），28 ℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)2～3 d。利用去針頭的1 mL無(wú)菌注射器將侵染液注射至洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，28 ℃條件下暗培養(yǎng)3 d，使用Axio Imager A2正置熒光顯微鏡（ZEISS，德國(guó)）觀察綠色熒光蛋白（green fluorscent protein，GFP）成像。

1.7 FLSs功能驗(yàn)證

通過(guò)葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法［22］，將含重組pORE_R4-YdFLS質(zhì)粒、pORE_R4-YlFLS 質(zhì)粒和空載體pORE_R4 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液分別侵染煙草，在含有100 mg·L-1Kana和800 mg·L-1Carb 的篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行分化和生根，T0代轉(zhuǎn)基因植株用于功能驗(yàn)證。使用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）法提取轉(zhuǎn)基因煙草的DNA，進(jìn)行陽(yáng)性苗鑒定。對(duì)陽(yáng)性苗植株的表型和黃酮醇合成酶基因表達(dá)進(jìn)行分析。使用超高效液相色譜技術(shù)（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）測(cè)定煙草花冠中黃酮醇的含量，方法同1.2。參照Stevenson 等［23］的方法提取煙草花冠中花青素苷，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定530 和657 nm處的吸光值并計(jì)算花青素苷含量：

花青素苷含量=（A530-0.25?A657）/花冠質(zhì)量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

黃酮醇含量、花青素苷含量和基因表達(dá)分析使用SPSS 21.0 軟件并采用單因素方差Duncan 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著差異性分析（P<0.05）；使用Origin 2021、SigmaPlot 14.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉蘭與紫玉蘭花瓣黃酮醇含量分析

使用UPLC 系統(tǒng)在波長(zhǎng)350 nm 處檢測(cè)玉蘭與紫玉蘭五個(gè)花開(kāi)放時(shí)期花被片中黃酮醇的含量（圖2-A），并分別對(duì)玉蘭與紫玉蘭五個(gè)不同開(kāi)花時(shí)期黃酮醇的含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，玉蘭在花蕾期黃酮醇含量最低，后逐漸升高，至初開(kāi)期最高，且顯著高于其他階段，隨后降低，盛開(kāi)期有所回升；紫玉蘭黃酮醇含量在花蕾期最高，且顯著高于其他階段，隨著花開(kāi)放，黃酮醇含量持續(xù)下降（圖2-B）。除此之外，紫玉蘭花被片黃酮醇含量從露色期起低于玉蘭（圖2-B）。

圖2 玉蘭與紫玉蘭初開(kāi)期UPLC色譜圖（A）和不同時(shí)期黃酮醇含量圖（B）Fig.2 The initial stage UPLC chromatogram （A） and different flowering stages flavonol content of Y. denudata and Y. liliiflora （B）

2.2 FLSs克隆及生物信息學(xué)分析

YdFLS與YlFLS的ORF 序列均為1 008 bp，編碼335個(gè)氨基酸殘基；YdFLS蛋白質(zhì)分子式為C1728H2672N444O501S10，相對(duì)分子質(zhì)量為38.003 5 kDa，理論等電點(diǎn)為9.72，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為35.97，脂肪系數(shù)為86.96，總平均親水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）值為-0.368，屬于穩(wěn)定蛋白；YlFLS 蛋白質(zhì)分子式為C1726H2670N444O506S10，相對(duì)分子質(zhì)量為38.057 46 kDa，理論等電點(diǎn)為5.17，該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為38.98，脂肪系數(shù)為85.22，GRAVY值為-0.404，屬于穩(wěn)定蛋白。

YdFLS與YlFLS的ORF 重復(fù)率為98.51%（圖3-A），氨基酸重復(fù)率為98.21%（圖3-B），對(duì)YdFLS 和YlFLS 氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果表明具有3 個(gè)相同的保守結(jié)構(gòu)域，PLN02704 為黃酮醇合成酶結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明其具有合成黃酮醇合成酶的功能；20GFell_Oxy 表明屬于20G-FeII 加氧酶家族；Pcbc 表明屬于α-同戊二酸依賴性雙加氧酶超家族（圖3-C），差異的氨基酸不影響其保守結(jié)構(gòu)域；對(duì)其進(jìn)行二級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，二者二級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)基本一致（圖3-D）。以上結(jié)果表明，YdFLS 與YlFLS 功能基本一致，F(xiàn)LS基因在玉蘭屬植物中具有序列保守性。

圖3 YdFLS與YlFLS生物信息學(xué)分析圖Fig.3 The bioinformatics analysis of YdFLS with YlFLS

2.3 FLSs多序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

氨基酸序列分析表明，YdFLS 和YlFLS 都具有相對(duì)保守的二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）底物特異結(jié)合位點(diǎn)：苯丙氨酸132（Phe132）、苯丙氨酸134（Phe134）、賴氨酸202（Lys202）、苯丙氨酸293（Phe293）、絲氨酸295（Ser295）；2-氧代戊二酸（2-oxoglutarate）結(jié)合位點(diǎn)：精氨酸287（Arg287）、絲氨酸289（Ser289）；亞鐵離子（Fe2+）結(jié)合位點(diǎn)：組氨酸221（His221）、天冬氨酸223（Asp223）以及FLS特異性基序“SxxTxLVP”（x 代表任意的氨基酸殘基）（圖4）。玉蘭與紫玉蘭FLS氨基酸序列高度保守的結(jié)合位點(diǎn)與其他物種的FLS 蛋白相似，推測(cè)其與其他物種FLS 的功能一致。

圖4 YdFLS、YlFLS與其他植物FLSs氨基酸序列的比對(duì)Fig.4 The amino acid sequence homology alignment in YdFLS，YlFLS with other plants

為了進(jìn)一步探究FLSs 的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，本研究利用13 個(gè)物種的FLS 蛋白序列建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示YdFLS 和YlFLS 與樟科植物沉水樟CmFLS聚為一類(lèi)，表明其親緣關(guān)系較近（圖5）。

圖5 YdFLS、YlFLS蛋白與其他植物FLS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree in YdFLS，YlFLS with other plants

2.4 FLSs組織特異性和時(shí)空表達(dá)分析

為了探究FLS基因在玉蘭、紫玉蘭的表達(dá)模式，分別對(duì)YdFLS和YlFLS的組織特異性和時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行分析。組織特異性結(jié)果表明，F(xiàn)LSs基因在不同組織中均有表達(dá)，YdFLS在花中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織，其次是嫩葉；YlFLS在嫩葉中表達(dá)量最高，顯著高于其他組織，其次是老葉；FLSs在根中表達(dá)量均極低（圖6-A）。

圖6 玉蘭與紫玉蘭不同組織（A）及不同發(fā)育階段（B）花被片的FLSs基因表達(dá)量Fig.6 Expression of FLSs genes in different tissues （A） and petals at different flowering stages （B） of Y. denudata and Y. liliiflora

時(shí)空表達(dá)分析結(jié)果表明，YdFLS的表達(dá)量隨著花開(kāi)放過(guò)程中逐漸升高，在盛開(kāi)期最高；YlFLS的表達(dá)模式完全相反，在盛開(kāi)期最低（圖6-B）。說(shuō)明FLS基因在玉蘭與紫玉蘭花被片呈色過(guò)程中具有不同的表達(dá)模式。FLSs基因表達(dá)模式的差異影響玉蘭屬花被片黃酮醇物質(zhì)的積累，從而影響玉蘭與紫玉蘭不同花色的形成。

2.5 FLSs亞細(xì)胞定位分析

為了確定FLSs 蛋白在細(xì)胞中的定位，將YdFLS與YlFLS分別構(gòu)建到帶有GFP標(biāo)簽的pORE_R4植物表達(dá)載體中，以pORE_R4空載為對(duì)照。通過(guò)注射洋蔥表皮細(xì)胞觀測(cè)熒光蛋白定位情況，結(jié)果表明，YdFLS 與YlFLS均定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖7）。

圖7 FLSs在洋蔥中的亞細(xì)胞定位圖Fig.7 The subcellular localization of FLSs in onion

2.6 YdFLS、YlFLS 轉(zhuǎn)基因煙草表型及基因表達(dá)定量分析

將YdFLS與YlFLS構(gòu)建在超表達(dá)載體pORE_R4上，轉(zhuǎn)化煙草，各獲得轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性苗15棵。YdFLS和YlFLS轉(zhuǎn)基因煙草與野生型和空載型煙草比較，花冠顏色變淺（圖8-A、圖9-A）。qRT-PCR 結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系FLSs基因表達(dá)量明顯高于野生型和空載對(duì)照（圖8-B、圖9-B），說(shuō)明FLSs基因在煙草中超表達(dá)。UPLC試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草花冠中黃酮醇含量相對(duì)于對(duì)照組明顯提高（圖8-C、圖9-C），花青素苷含量相對(duì)于野生型明顯降低（圖8-D、圖9-D）。

圖8 轉(zhuǎn)基因煙草表型（A）、轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)量（B）、花冠黃酮醇含量（C）、轉(zhuǎn)基因煙草花冠花青素苷含量（D）Fig.8 Transformation phenotype （A），expression of YdFLS （B），flavonol content （C），anthocyanin content （D）

圖9 轉(zhuǎn)基因煙草表型（A）、轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)量（B）、花冠黃酮醇含量（C）、轉(zhuǎn)基因煙草花冠花青素苷含量（D）Fig.9 Transformation phenotype （A），expression of YlFLS （B），flavonol content （C），anthocyanin content （D）

3 討論

黃酮醇作為一種重要的輔助色素物質(zhì)，能夠與花青素結(jié)合形成穩(wěn)定的色素結(jié)構(gòu)，影響花瓣的著色；另外還可以單獨(dú)發(fā)揮作用，賦予花瓣白色、淺黃及黃色［24］。它作為類(lèi)黃酮化合物的一類(lèi)，與花青素?fù)碛泄餐那捌诤铣赏緩剑绊懟ㄉ男纬桑?5］。為了探究黃酮醇對(duì)玉蘭屬植物花色形成的作用機(jī)制，本研究利用UPLC技術(shù)測(cè)定玉蘭與紫玉蘭成花過(guò)程中黃酮醇的含量，發(fā)現(xiàn)黃酮醇含量是一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過(guò)程，玉蘭花開(kāi)放過(guò)程中花被片黃酮醇積累表現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，在初開(kāi)期含量最高；而紫玉蘭黃酮醇含量持續(xù)下降，在花蕾期含量最高（圖2）；在花開(kāi)放過(guò)程紫玉蘭黃酮醇積累較早，在花蕾期達(dá)到峰值，此時(shí)含量高于玉蘭，但花蕾期之后紫玉蘭黃酮醇迅速降解，含量明顯低于玉蘭（圖2）。表明黃酮醇的積累可以影響玉蘭屬花被片的著色，且不同植物的黃酮醇的代謝規(guī)律具有很大差異，前人在花色豐富的芍藥花屬、杜鵑花屬植物中發(fā)現(xiàn)了相似的規(guī)律［26-27］。

黃酮醇合成途徑關(guān)鍵基因功能驗(yàn)證是解析黃酮醇調(diào)控花色形成的關(guān)鍵一步。本研究分別從玉蘭與紫玉蘭中克隆出YdFLS與YlFLS基因，氨基酸序列分析結(jié)果表明FLS家族蛋白氨基酸序列保守性較高（圖3、4），在不同物種間生物學(xué)功能具有保守性［28］。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)聚類(lèi)結(jié)果顯示YdFLS 與YlFLS 高度同源，且與沉水樟CmFLS 親緣關(guān)系最近（圖5）。qRT-PCR 結(jié)果表明FLSs基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性，YdFLS在花中表達(dá)量最高，與玉蘭花被片主要呈色物質(zhì)為黃酮醇有關(guān)。YlFLS在嫩葉中表達(dá)量最高，花中表達(dá)較低，推測(cè)是與黃酮醇能保護(hù)幼嫩組織免受紫外光的傷害有關(guān)［29］。在花開(kāi)放不同階段，F(xiàn)LSs具有不同的表達(dá)模式，YdFLS的表達(dá)量持續(xù)上升，在盛開(kāi)期表達(dá)量最高；YlFLS表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式；且從露色期開(kāi)始，YdFLS的表達(dá)量高于YlFLS（圖6），與UPLC 試驗(yàn)結(jié)果一致。表明FLS基因與玉蘭、紫玉蘭花色的形成呈現(xiàn)緊密的聯(lián)系，其表達(dá)量影響著黃酮醇合成支路對(duì)類(lèi)黃酮代謝流的競(jìng)爭(zhēng)能力，進(jìn)而影響黃酮醇的含量，前人在葡萄風(fēng)信子［30］、牡丹［31］中也發(fā)現(xiàn)FLS的表達(dá)量與黃酮醇的含量呈正相關(guān)。

亞細(xì)胞定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FLSs 位于細(xì)胞質(zhì)，說(shuō)明其在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用（圖7）。本研究分別將YdFLS、YlFLS在煙草中過(guò)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因株系花色相對(duì)于對(duì)照組變淺，黃酮醇的含量顯著提高，花青素苷的含量減少（圖8、9），表明FLSs基因的高表達(dá)促進(jìn)了黃酮醇的合成，并抑制了花青素苷的生成，該結(jié)果與茶（CsFLS）［16］、楊梅（MrFLS）［18］轉(zhuǎn)基因表型一致，但在其他植物如擬南芥中發(fā)現(xiàn)FLS具有多個(gè)成員，而且不同成員的表達(dá)模式不一致，功能有所差異，如AtFLS1在花、果中高表達(dá)，其他成員在所有組織中低表達(dá)，其中AtFLS1 蛋白催化活性最強(qiáng)［32］。玉蘭屬中是否存在多個(gè)FLS家族成員，及成員發(fā)揮的功能還有待研究。

以上結(jié)果表明FLS基因既可通過(guò)直接合成黃酮醇（助色素）來(lái)影響花色，又可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)共同底物二氫黃酮醇來(lái)影響花青素苷的合成。FLS基因表達(dá)量影響著黃酮醇支路代謝流的強(qiáng)弱，YdFLS基因高表達(dá)，使得類(lèi)黃酮代謝流主要流向黃酮醇方向，使得玉蘭的花被片呈現(xiàn)白色；而紫玉蘭則相反，YlFLS低表達(dá)，造成代謝流主要流向花青素苷方向，花青素苷大量積累，花被片呈紫色。目前FLS基因已在多種植物中被鑒定，上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也得到初步闡明，如中國(guó)水仙（Narcissus tazetta）中的NtMYB12［33］、蘋(píng)果中的MdNAC9［34］能夠結(jié)合FLS啟動(dòng)子促進(jìn)FLS的表達(dá)，但轉(zhuǎn)錄復(fù)合物對(duì)FLS的調(diào)控機(jī)制仍不清晰。

4 結(jié)論

本研究分析了兩種玉蘭開(kāi)花過(guò)程中花被片黃酮醇含量的變化，結(jié)果表明黃酮醇積累對(duì)玉蘭屬花被片呈色具有重要影響。對(duì)YdFLS 與YlFLS 氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明其序列具有保守性。通過(guò)qRT-PCR 分析FLS基因在兩種玉蘭中的組織和時(shí)空表達(dá)模式，表明FLS表達(dá)模式的不同是造成玉蘭與紫玉蘭花色差異的重要原因之一。分別將YdFLS、YlFLS在煙草中過(guò)表達(dá)，相對(duì)于對(duì)照組，轉(zhuǎn)基因株系花冠花色變淺，黃酮醇含量顯著增加，花青素苷明顯減少，證實(shí)了FLS基因是玉蘭與紫玉蘭黃酮醇合成和積累的關(guān)鍵基因，在玉蘭屬中功能保守。