氮離子注入對(duì)金蓮花種子發(fā)芽率及幼苗生理特性的影響

曹天光 張新旭 秦 壘 王 慧 耿金鵬

（河北工業(yè)大學(xué)生物物理研究所，天津 300401）

金蓮花（Trollius chinensisBunge）為毛茛科（Ranunculaceae）金蓮花屬多年生草本植物，分布于華北、東北等地區(qū)的海拔1 800 m 以上的高山草甸［1］，其花、莖、葉均可入藥，主要藥用成分為黃酮類(lèi)及生物堿類(lèi)化合物［2］，有良好的清熱去毒、抗菌消炎等作用［3-4］，已被選為預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征疾?。?］和新型冠狀病毒肺炎［6］的中藥處方成分。目前由于過(guò)度采摘利用，野生金蓮花資源已經(jīng)非常稀少，而人工栽培存在種質(zhì)資源匱乏、種源繁殖系數(shù)低和品質(zhì)下降等問(wèn)題，產(chǎn)量不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。此外，金蓮花喜冷涼濕潤(rùn)環(huán)境、根系淺、怕干旱、忌水澇，使人工栽培和引種繁殖面臨著一系列問(wèn)題［7-8］。因此，利用現(xiàn)代育種技術(shù)對(duì)金蓮花進(jìn)行品質(zhì)改良，對(duì)豐富金蓮花種質(zhì)資源以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求具有重要意義。

離子束注入誘變育種技術(shù)利用加速的氣體離子（等離子體）轟擊生物材料，使之發(fā)生遺傳變異，從而創(chuàng)制出新的品種［9］。離子注入裝置的示意圖如圖1 所示。與傳統(tǒng)的X、γ 射線(xiàn)等輻射技術(shù)相比，離子束誘變具有作用效應(yīng)局部、可控［10］、損傷輕、存活率和突變率高等特點(diǎn)［11-12］，已越來(lái)越多地應(yīng)用于谷物［13］、經(jīng)濟(jì)作物［14］、花卉［15］等植物的誘變育種。

圖1 離子注入裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of ion implantation machine

前人研究表明，一定劑量的離子注入可刺激植物的生長(zhǎng)發(fā)育。例如，張紅等［16］研究發(fā)現(xiàn)，低能量低劑量的氮離子注入可以增加大豆種子的活力，提高其發(fā)芽率。趙子睿等［17］發(fā)現(xiàn)30 keV 氮離子注入毛葉山桐子種子可顯著增加種子發(fā)芽率、幼苗株高、冠幅、葉片數(shù)等表觀(guān)性狀。李海金等［18］發(fā)現(xiàn)，低劑量氮離子注入紅小豆種子，顯著提升了紅小豆的株高、單株莢數(shù)等農(nóng)藝性狀。離子注入作為一種非生物脅迫，會(huì)使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），這些ROS 會(huì)攻擊生物大分子［19］，引起蛋白質(zhì)、核酸等的損傷。植物體會(huì)啟動(dòng)自身的保護(hù)系統(tǒng)，誘導(dǎo)抗氧化系統(tǒng)的活性，進(jìn)行自我修復(fù)，清除ROS，緩解氧化損傷［20］。同時(shí)抗氧化能力的增強(qiáng)有助于提高生物體抵御逆境的能力，從而保證正常的生理代謝［21］。吳座功等［22］將氮離子注入蒙古黃芪種子后，通過(guò)分析抗氧化酶發(fā)現(xiàn)，低劑量的離子注入有利于抗氧化酶的活化，促進(jìn)種子萌發(fā)。張紅等［16］發(fā)現(xiàn)，一定劑量的氮離子注入大豆種子后，其植株的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性，可溶性蛋白含量都表現(xiàn)出明顯增加現(xiàn)象。黃洪云等［23］認(rèn)為氮離子注入能有效提高干旱脅迫下玉米幼苗葉片脯氨酸含量、SOD 和POD 活性，從而增強(qiáng)玉米葉片的抗旱性。然而，關(guān)于氮離子注入對(duì)金蓮花生長(zhǎng)發(fā)育的影響，目前鮮有研究報(bào)道。

因此，本研究以金蓮花種子為材料，通過(guò)低能氮離子注入金蓮花種子，探討氮離子注入對(duì)金蓮花種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響，以期為氮離子注入誘變金蓮花提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金蓮花種子采于河北省承德市圍場(chǎng)滿(mǎn)族蒙古族自治縣，經(jīng)河北工業(yè)大學(xué)耿金鵬副教授鑒定為性狀穩(wěn)定的野生金蓮花種子。

SOD、POD、CAT、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）測(cè)試試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；Trizol，美國(guó)Invitrogen 公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）、TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）測(cè)試試劑盒，日本TaKaRa 公司；三氯乙酸（分析純）、牛血清蛋白（生物技術(shù)級(jí)，96%）、85%磷酸、考馬斯亮藍(lán)G250（分析純）、2-硫代巴比妥酸，阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5424R 冷凍高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf 公司；SpectraMax i3x 酶標(biāo)儀，美國(guó)Moleculer Devices 公司；CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；UV5Nano 超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)Mettler Toledo 公司；TYS-4N植物葉綠素測(cè)定儀，北京中科維禾科技發(fā)展有限公司。

1.3 樣品制備

1.3.1 種子處理 氮離子注入試驗(yàn)在河北工業(yè)大學(xué)生物物理研究所離子注入機(jī)室完成。氮離子注入能量為30 keV，注入劑量為1.0×1015、2.0×1015、3.0×1015、4.0×1015、5.0×1015、6.0×1015、7.0×1015、8.0×1015ions·cm-2。以同批次相同數(shù)量未經(jīng)處理的種子作為對(duì)照。試驗(yàn)挑選顆粒飽滿(mǎn)、大小均勻的金蓮花種子，每組3 次重復(fù)，每重復(fù)500粒。

1.3.2 種子發(fā)芽試驗(yàn) 取經(jīng)過(guò)氮離子注入處理的種子和未經(jīng)過(guò)注入的種子各100粒，3個(gè)重復(fù)。使用赤霉素（600 mg·L-1）浸泡金蓮花種子24 h 打破種子休眠，后用75%乙醇處理30 s，無(wú)菌水沖洗，2%次氯酸鈉消毒20 min，放置于鋪有2 層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中25 °C恒溫培養(yǎng)，每天光照12 h。

1.3.3 幼苗培養(yǎng) 種子萌發(fā)后播種于將其移植于含有草炭土的穴盤(pán)內(nèi)，種植于河北工業(yè)大學(xué)輻照研究基地。每2 d澆水1次，后將其轉(zhuǎn)移至花盆中，2個(gè)月后取葉片，測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.4.1 發(fā)芽指標(biāo) 發(fā)芽第4 天開(kāi)始記錄發(fā)芽數(shù)量，每天觀(guān)察記錄種子的發(fā)芽情況，共培養(yǎng)至16 d。發(fā)芽結(jié)束后計(jì)算種子的發(fā)芽率。

1.4.2 生理指標(biāo)的測(cè)定 取金蓮花幼苗相同部位葉片鮮樣，用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙擦干后用于生理生化指標(biāo)的測(cè)量，SOD、CAT、POD 活性和H2O2含量的測(cè)定參照試劑盒說(shuō)明書(shū)；MDA 含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法；可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法；葉綠素含量（相對(duì)值）測(cè)定采用TYS-4N植物葉綠素測(cè)定儀。

1.4.3 抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè) 采用熒光定量PCR 法檢測(cè)離子注入前后金蓮花幼苗葉片基因的表達(dá)。采集各處理組的葉片樣品并采用Trizol 法提取總RNA，采用PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR分析采用TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。根據(jù)前期測(cè)序結(jié)果篩選Fe/Mn-SOD1、Cu/Zn-SOD1、CAT3、POD2基因及內(nèi)參基因肌動(dòng)蛋白（actin，ACT）的序列［24］合成引物，引物序列如表1 所示。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量［25］。

表1 用于檢測(cè)基因表達(dá)的引物Table 1 Primers used to detect gene expression

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均來(lái)自3 個(gè)獨(dú)立的重復(fù)試驗(yàn)（n=3）。以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式表示。采用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行單因素方差（analysis of variance，ANOVA）檢驗(yàn)，采用Origin繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 低能氮離子注入對(duì)金蓮花發(fā)芽率的影響

種子的發(fā)芽率是衡量種子活力的主要指標(biāo)。如圖2所示，低能氮離子注入處理的金蓮花種子的發(fā)芽率隨注入劑量的增加呈現(xiàn)“升-降-升-降”的變化趨勢(shì)。與對(duì)照相比，在注入劑量為2.0×1015、3.0×1015、5.0×1015ions·cm-2時(shí)，種子的發(fā)芽率均顯著升高（P<0.05），在3.0×1015ions·cm-2時(shí)最高，比對(duì)照升高了14 個(gè)百分點(diǎn)。在劑量為7.0×1015、8.0×1015ions·cm-2時(shí)，種子發(fā)芽率大幅下降，比對(duì)照分別降低了20 和40 個(gè)百分點(diǎn)（P<0.05）。結(jié)果表明，氮離子注入對(duì)金蓮花種子具有刺激作用，在較低劑量時(shí)促進(jìn)了種子的萌發(fā)，在較高劑量時(shí)抑制了種子的萌發(fā)。

圖2 金蓮花種子發(fā)芽率與氮離子注入劑量的關(guān)系Fig.2 Relationship between the germination rate of T.chinensis seeds and the dose of nitrogen ion implantation

2.2 低能氮離子注入對(duì)金蓮花幼苗葉綠素相對(duì)含量(soil and plant analyze development, SPAD)的影響

葉綠素是光合作用的主要色素，是反映光合作用的強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，其含量增加有助于碳水化合物在幼苗體內(nèi)的累積。由圖3可知，低能氮離子注入處理的金蓮花種子萌發(fā)后，其幼苗的葉綠素相對(duì)含量隨注入劑量的增加呈現(xiàn)“升-降-升-降”的變化趨勢(shì)。在氮離子注入劑量為5.0×1015ions·cm-2時(shí)，葉綠素含量最高，比對(duì)照顯著升高了28.93%（P<0.05）。當(dāng)劑量超過(guò)5.0×1015ions·cm-2時(shí)，幼苗葉綠素含量開(kāi)始下降，在劑量為8.0×1015ions·cm-2時(shí)最低，比對(duì)照降低了6.40%（P>0.05）。

圖3 金蓮花幼苗SPAD值與氮離子注入劑量的關(guān)系Fig.3 Relationship between the SPAD value of T. chinensis seedlings and the dose of nitrogen ion implantation

2.3 低能氮離子注入對(duì)金蓮花幼苗可溶性蛋白的影響

植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝活動(dòng)的酶類(lèi)，是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其含量的增加可提高細(xì)胞的保水能力，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用，是篩選抗性的指標(biāo)之一。由圖4 可知，氮離子注入處理的金蓮花種子萌發(fā)后，其幼苗的可溶性蛋白含量隨注入劑量的增加呈現(xiàn)“升-降-升-降”的變化趨勢(shì)。與對(duì)照相比，在氮離子注入劑量為1.0×1015、2.0×1015、3.0×1015、6.0×1015、7.0×1015ions·cm-2時(shí)，幼苗的可溶性蛋白含量均升高，在劑量為3.0×1015ions·cm-2時(shí)最高，比對(duì)照升高了28.63%（P<0.05）。在注入劑量為4.0×1015、5.0×1015、8.0×1015ions·cm-2時(shí)，幼苗的可溶性蛋白含量降低，在劑量為5.0×1015ions·cm-2時(shí)最低，比對(duì)照降低了9.5%（P<0.05）。

圖4 金蓮花幼苗可溶性蛋白與氮離子注入劑量的關(guān)系Fig.4 Relationship between the soluble protein content of T.chinensis seedlings and the dose of nitrogen ion implantation

2.4 低能氮離子注入對(duì)金蓮花幼苗MDA 和H2O2含量的影響

MDA 和H2O2通常被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的主要指標(biāo)，能夠反映細(xì)胞受損傷的程度。

由圖5-A可知，低能氮離子注入處理金蓮花種子萌發(fā)后，其幼苗的MDA 含量隨注入劑量的增加呈現(xiàn)“升-降-升-降”的變化趨勢(shì)。與對(duì)照相比，在氮離子注入劑量為1.0×1015、2.0×1015、5.0×1015、6.0×1015ions·cm-2時(shí)，幼苗的MDA含量均升高，在劑量為5×1015ions·cm-2時(shí)最高，比對(duì)照升高了30.34%（P<0.05）。當(dāng)注入劑量為3.0×1015、4.0×1015、7.0×1015、8.0×1015ions·cm-2時(shí)，幼苗的MDA 含量降低，在劑量為3.0×1015ions·cm-2時(shí)最低，比對(duì)照降低了2.11%（P>0.05）。

圖5 金蓮花幼苗MDA（A）和 H2O2（B）含量與氮離子注入劑量的關(guān)系Fig.5 Relationship between the MDA （A） and H2O2 （B） content of T. chinensis seedlings and the dose of nitrogen ion implantation

由圖5-B 可知，低能氮離子注入金蓮花種子萌發(fā)后，其幼苗的H2O2含量隨注入劑量的增加呈“升-降-升-降-升”的變化趨勢(shì)。與對(duì)照相比，不同劑量氮離子注入后其含量均有不同程度的升高，在劑量為8.0×1015ions·cm-2時(shí)最高，比對(duì)照升高了162.31%（P<0.05），在劑量為2.0×1015、3.0×1015ions·cm-2時(shí)，分別比對(duì)照增高了7.47%、6.87%（P>0.05）。

上述結(jié)果表明，不同劑量氮離子注入均會(huì)導(dǎo)致金蓮花幼苗一定的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.5 低能氮離子注入對(duì)金蓮花幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

為探討金蓮花幼苗對(duì)氮離子注入誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的抗氧化反應(yīng)，研究了3種具有代表性的細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（SOD、CAT、POD）活性隨注入劑量的變化情況。SOD對(duì)植物體內(nèi)超氧陰離子有清除作用；POD與光合作用、呼吸作用及生長(zhǎng)素的氧化等有密切關(guān)系；CAT可催化H2O2分解成氧和水，并且與植物代謝強(qiáng)度及抗性有關(guān)。

由圖6-A可知，低能氮離子注入處理金蓮花種子萌發(fā)后，其幼苗的SOD 活性隨劑量的增加呈現(xiàn)“升-降-升-降”的變化趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，在氮離子注入劑量為2.0×1015、3.0×1015ions·cm-2時(shí)，幼苗的SOD活性升高，分別比對(duì)照升高了56.64%（P<0.05）、21.48%（P<0.05）。在注入劑量為1.0×1015、4.0×1015～8.0×1015ions·cm-2時(shí)，幼苗的SOD 活性下降，在劑量為8.0×1015ions·cm-2時(shí)最低，比對(duì)照降低了45.20%（P<0.05）。

圖6 金蓮花幼苗 SOD（A）、CAT（B）和 POD（C）含量與氮離子注入劑量的關(guān)系Fig.6 Relationship between the SOD（A），CAT（B） and POD（C） content of T. chinensis seedlings and the dose of nitrogen ion implantation

金蓮花幼苗的CAT 活性隨氮離子注入劑量增加的變化趨勢(shì)與SOD 大致相同。由圖6-B 可知，與對(duì)照相比，在注入劑量為1.0×1015～3.0×1015、7.0×1015ions·cm-2時(shí)，幼苗的CAT 活性升高，其中在劑量為3.0×1015ions·cm-2時(shí)最高，比對(duì)照升高了41.35%（P<0.05）。在注入劑量為4.0×1015～6.0×1015、8.0×1015ions·cm-2時(shí)，幼苗的CAT活性下降，在劑量為8.0×1015ions·cm-2時(shí)最低，比對(duì)照降低了34.59%（P<0.05）。

由圖6-C 可知，金蓮花幼苗的POD 活性隨氮離子注入劑量增加呈現(xiàn)“升-降-升”的變化趨勢(shì)。與對(duì)照相比，在注入劑量為1.0×1015～3.0×1015ions·cm-2時(shí)，幼苗的POD 活性升高，分別比對(duì)照升高了16.69%（P<0.05）、36.24%（P<0.05）、8.42%（P<0.05）。在注入劑量為4.0×1015～8.0×1015ions·cm-2時(shí)，幼苗的POD 活性下降，在劑量為6.0×1015ions·cm-2時(shí)最低，比對(duì)照降低了21.20%（P<0.05）。

2.6 各生理指標(biāo)相關(guān)性分析

不同劑量氮離子注入金蓮花種子后，所測(cè)各生理指標(biāo)的相關(guān)性如表2 所示。注入劑量與金蓮花的發(fā)芽率、SOD 和POD 活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05），與H2O2含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.01），與葉綠素、可溶性蛋白、MDA 含量和CAT 活性為負(fù)相關(guān)關(guān)系，但無(wú)顯著性。金蓮花種子的發(fā)芽率與H2O2呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05），與SOD 活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），與葉綠素、可溶性蛋白、MDA、CAT 和POD 呈正相關(guān)關(guān)系但不顯著。葉綠素含量與丙二醛含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），與可溶性蛋白、CAT 和POD 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系但不顯著，與H2O2和SOD 呈正相關(guān)關(guān)系但不顯著。可溶性蛋白與MDA 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系但不顯著，與H2O2呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05），與SOD 與CAT 呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）正相關(guān)關(guān)系，與POD呈正相關(guān)關(guān)系但不顯著。MDA 與H2O2呈正相關(guān)關(guān)系但不顯著，與SOD、CAT和POD呈負(fù)相關(guān)關(guān)系但不顯著。SOD 與CAT 和POD 呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.01）。說(shuō)明氮離子注入導(dǎo)致的金蓮花一系列生理指標(biāo)的變化之間存在相互關(guān)聯(lián)。

表2 生理指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of physiological indexes

2.7 氮離子注入對(duì)抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步從遺傳方面研究氮離子注入對(duì)金蓮花幼苗生長(zhǎng)的刺激作用，本研究選取了4 個(gè)抗氧化酶系統(tǒng)相關(guān)基因Fe/Mn-SOD1、Cu/Zn-SOD1、CAT3和POD2，采用qRT-PCR測(cè)定了其在對(duì)照和3.0×1015ions·cm-2氮離子注入組的金蓮花幼苗葉片中的表達(dá)量，結(jié)果如圖7 所示。與對(duì)照相比，F(xiàn)e/Mn-SOD1、Cu/Zn-SOD1和CAT3基因的表達(dá)水平均上調(diào)，分別提高了175%（P<0.01）、5.11%（P>0.05）和48.86%（P<0.05）。POD2基因的表達(dá)水平比對(duì)照顯著下調(diào)（P<0.05）。

圖7 對(duì)照和3.0×1015 ions·cm-2氮離子注入組的金蓮花幼苗中4個(gè)抗氧化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expressions of four antioxidation-related genes in T. chinensis seedlings in the control and 3×1015 ions·cm-2 nitrogen ion implantation groups

3 討論

前人研究表明，離子注入微生物、植物細(xì)胞及其種子后，其存活率與注入劑量呈現(xiàn)獨(dú)特的“馬鞍型”效應(yīng)曲線(xiàn)［26］。在本研究中，不同劑量（1.0～8.0×1015ions·cm-2）氮離子注入的金蓮花種子發(fā)芽率隨注入劑量的增加呈“升-降-升-降”的“馬鞍型”趨勢(shì)，這與劉志高等［27］通過(guò)不同劑量的鈦離子注入石蒜種子得到的結(jié)果基本一致。原因可能是金蓮花具有休眠期，當(dāng)?shù)x子注入劑量較低時(shí)，對(duì)金蓮花種子有一定刺激作用，打破了金蓮花的休眠，因此促進(jìn)了金蓮花種子的萌發(fā)，而劑量較高時(shí)造成的損傷較重，抑制了種子的萌發(fā)。

葉綠素是植物光合作用的基礎(chǔ)，本試驗(yàn)通過(guò)分析氮離子注入對(duì)SPAD 值的影響，結(jié)果表明，隨著氮離子注入劑量的增加，金蓮花葉片中SPAD 值呈“升-降-升-降”的趨勢(shì)，注入劑量過(guò)高時(shí)，SPAD 值開(kāi)始低于對(duì)照。這與吳座功等［22］用低能氮離子注入蒙古黃芪種子時(shí)得到的研究結(jié)果一致。原因可能是氮離子注入后，促進(jìn)了葉片組織中葉綠素相關(guān)物質(zhì)的合成；注入劑量過(guò)高時(shí)，生理?yè)p傷加重，抑制了葉綠素的合成。

在逆境條件下，植物會(huì)主動(dòng)積累可溶性蛋白，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用［28］。本試驗(yàn)中可溶性蛋白含量隨著氮離子注入劑量的增加出現(xiàn)“升-降-升-降”的變化趨勢(shì)，這與周小云等［29］研究氮離子注入小麥種子新春11 號(hào)得到的可溶性蛋白的變化趨勢(shì)一致。說(shuō)明金蓮花幼苗在氮離子注入后可通過(guò)積累可溶性蛋白修復(fù)氮離子引起的損傷。在注入劑量為3.0×1015ions·cm-2時(shí)，可溶性蛋白含量最高，修復(fù)能力最強(qiáng)，超過(guò)該劑量后可溶性蛋白含量降低，可能是由于氮離子注入打破了金蓮花細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)平衡，導(dǎo)致修復(fù)能力逐漸減弱，而在更高劑量時(shí)細(xì)胞自身又重新建立了酶系統(tǒng)并開(kāi)始自我修復(fù)，使可溶性蛋白含量再升高。

離子注入是一種非生物脅迫，能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生ROS （例如H2O2），對(duì)機(jī)體造成傷害。氮離子注入的金蓮花幼苗H2O2含量均大于對(duì)照組，與Semsang 等［30］提出的低能氮離子注入導(dǎo)致泰國(guó)茉莉水稻幼苗的ROS含量升高的結(jié)果相似。植物體通過(guò)SOD、POD、CAT 等抗氧化酶緩解ROS傷害。本試驗(yàn)3種抗氧化酶活性大致呈“升-降-升-降”的變化趨勢(shì)，在氮離子注入劑量為1.0×1015～3.0×1015ions·cm-2時(shí)，幼苗體內(nèi)的POD、CAT、SOD 活性基本均高于對(duì)照組，這可能是氮離子注入在金蓮花體內(nèi)產(chǎn)生的ROS 啟動(dòng)了細(xì)胞的修復(fù)保護(hù)反應(yīng)，刺激了編碼抗氧化酶的基因應(yīng)答，從而使抗氧化酶活性提高［31-32］。MDA 含量在氮離子注入后的變化趨勢(shì)與3 種酶含量的變化趨勢(shì)基本相反，間接地證實(shí)氮離子注入對(duì)金蓮花的影響以及金蓮花自身所具有的協(xié)調(diào)修復(fù)作用。當(dāng)?shù)x子注入劑量繼續(xù)增大時(shí)，抗氧化酶活性開(kāi)始下降，可能是離子注入造成細(xì)胞傷害嚴(yán)重，致使代謝紊亂，酶的合成受阻；在更高劑量時(shí)酶活性又出現(xiàn)上升的趨勢(shì)，可能是由于細(xì)胞重新建立了酶系統(tǒng)，細(xì)胞開(kāi)始自我修復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，氮離子注入會(huì)導(dǎo)致金蓮花生理指標(biāo)的變化，而這種變化并不表現(xiàn)在某一項(xiàng)生理指標(biāo)上，而是各個(gè)指標(biāo)相互關(guān)聯(lián)相互影響。由此推測(cè)，氮離子注入會(huì)對(duì)金蓮花造成了一系列損傷，在較低劑量氮離子注入金蓮花時(shí)，活性較高的抗氧化酶能有效清除離子注入產(chǎn)生的ROS、維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，同時(shí)植物體積累的可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)氮離子引起的損傷進(jìn)行修復(fù)，抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的增加在一定程度上促進(jìn)了植物體的代謝活動(dòng)，使葉綠素含量增加，最終促進(jìn)了植物體生長(zhǎng)發(fā)育。而隨著注入劑量的增加，金蓮花幼苗中沒(méi)有足夠的抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)消除過(guò)量的ROS，從而導(dǎo)致幼苗生長(zhǎng)受到抑制。

研究表明，氮離子注入會(huì)對(duì)植物分子水平造成一定影響。一方面，離子注入使植株體內(nèi)基因序列、表達(dá)發(fā)生改變，有研究揭示離子注入會(huì)影響植物基因的表達(dá)量［33-34］。然而關(guān)于金蓮花抗氧化相關(guān)基因在氮離子注入下的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，目前鮮有研究。植物的SOD 根據(jù)金屬輔基可以分為Mn-SOD，Cu/Zn-SOD 和Fe-SOD。研究表明，在應(yīng)對(duì)非生物脅迫時(shí)，植物CSD1、CSD2和MSD1基因的表達(dá)顯著上調(diào)［35］，該結(jié)論與本試驗(yàn)的結(jié)果類(lèi)似。本研究選取前期各生理生化指標(biāo)良好的3.0×1015ions·cm-2氮離子注入金蓮花幼苗與對(duì)照組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Cu/Zn-SOD、Fe/Mn-SOD和CAT基因的轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照相比均上調(diào)，說(shuō)明3.0×1015ions·cm-2氮離子注入能夠增加編碼SOD和CAT基因的表達(dá)，其中CAT基因的結(jié)果與Du等［36］的研究一致?？偟膩?lái)說(shuō)，抗氧化酶相關(guān)基因在緩解相對(duì)低劑量氮離子注入誘導(dǎo)的氧化脅迫中起到了關(guān)鍵作用，3.0×1015ions·cm-2氮離子注入可以通過(guò)增強(qiáng)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，提高了抗氧化系統(tǒng)活性，清除了氮離子注入產(chǎn)生的過(guò)量ROS，促進(jìn)了金蓮花幼苗的生長(zhǎng)。另一方面，離子注入改變了植物體內(nèi)甲基化、轉(zhuǎn)座子和DNA 結(jié)構(gòu)等。龔佳夢(mèng)等［37］發(fā)現(xiàn)快中子、返回式衛(wèi)星搭載、重離子等不同電離輻射下金蓮花的基因多態(tài)性存在明顯差異，說(shuō)明各種電離輻射可有效引起金蓮花DNA 分子的變異。因此推測(cè)氮離子注入金蓮花的過(guò)程中發(fā)生能量沉積、動(dòng)量傳遞，刺激DNA 的損傷修復(fù)、相關(guān)基因的表達(dá)和生化代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，最終引起金蓮花M1代的生物誘變效應(yīng)。

本試驗(yàn)結(jié)果均來(lái)自于金蓮花當(dāng)代，其有益性狀可以通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)保存和擴(kuò)繁，后續(xù)也可以進(jìn)行多代跟蹤研究，篩選獲得穩(wěn)定遺傳的有益突變材料。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了不同劑量的氮離子注入對(duì)金蓮花種子發(fā)芽率及幼苗生理生化特性的影響，發(fā)現(xiàn)一定劑量氮離子注入能夠促進(jìn)金蓮花種子的萌發(fā)、提高苗期葉綠素和可溶性蛋白含量、促進(jìn)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)、增強(qiáng)金蓮花抗氧化系統(tǒng)的活性、有效清除低劑量離子注入幼苗中適量的ROS，從而促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)。3.0×1015ions·cm-2可以作為氮離子注入誘變金蓮花的優(yōu)選劑量。