黑曲霉和酒糟二次發(fā)酵提升低次煙葉品質(zhì)的研究

邵燈寅,李雨芮,鄒恩凱,陳 棟,何 力,楊 蕾,羅海濤*

(1.江西中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心,江西南昌 330096;2.云南農(nóng)業(yè)大學煙草學院,云南昆明 650201)

近年來,工業(yè)中低次煙葉庫存逐年增加,這極大地阻礙了卷煙行業(yè)的發(fā)展,有效提升工業(yè)庫存低次煙葉的品質(zhì)已經(jīng)成為煙草行業(yè)的一個研究重點。目前,微生物發(fā)酵法因具有不受氣候條件限制、生產(chǎn)周期短、對環(huán)境友好等[1]優(yōu)點而在我國煙草生產(chǎn)過程中廣泛應用。低次煙葉具有刺激性大,伴有較強的生煙感和生青雜氣等特點[2]。全銘沁等[3]研究表明黑曲霉發(fā)酵液更適合用于降低煙葉的刺激性。許春平等[4]的研究也證實再造煙葉經(jīng)過黑曲霉降解后煙葉的刺激性明顯減輕。黑曲霉(Aspergillusniger)在煙葉發(fā)酵中主要用于降低煙葉中淀粉與蛋白質(zhì)、果膠以及纖維素的含量[5],使之進一步轉(zhuǎn)化分解為葡萄糖等物質(zhì),從而降低煙葉的刺激性[6]。

黑曲霉雖然對煙葉的刺激性有較好的改善效果,但黑曲霉無法有效改善低次煙葉中的生青雜氣[3],且被其處理后的煙葉勁頭明顯不足。研究發(fā)現(xiàn),用酒糟發(fā)酵食醋時會產(chǎn)生甘油、脂肪酸等香味物質(zhì)[7],同時酒糟還能為多種有利于煙葉醇化的微生物提供優(yōu)質(zhì)氮源、碳源[8],其在發(fā)酵過程中還能提高一些蛋白酶的活性[9]。酒糟中含有豐富的礦物質(zhì)以及鈣、鐵等微量元素,還含有多種菌體自溶產(chǎn)生的各種生物活性物質(zhì)(如類脂化合物、酶等)[10]。以上這些特性理論上能夠很好地彌補黑曲霉發(fā)酵煙葉時的不足,但目前我國對酒糟發(fā)酵提質(zhì)的研究主要集中在牲畜飼料的提質(zhì)方面,而用于煙葉提質(zhì)方面的研究較少。為了探究黑曲霉和酒糟二次發(fā)酵對低次煙葉的提質(zhì)效果,筆者利用黑曲霉和自釀米酒酒糟對煙葉進行二次發(fā)酵處理,以期為減輕低次煙葉的庫存壓力提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1煙葉原料。庫存低檔次上部煙葉,產(chǎn)地為云南大理劍川,由江西中煙技術(shù)中心提供。

1.1.2發(fā)酵微生物制劑。黑曲霉,實驗室保存;米酒酒糟,自制。

1.1.3煙葉液體培養(yǎng)基。將煙葉剪成碎片后用無菌水37 ℃下浸泡12 h,在100 mL培養(yǎng)基中加入0.5 g煙葉碎片,置于115 ℃壓力蒸汽滅菌器中滅菌20 min,制成液體培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)黑曲霉。

1.2 主要儀器與設(shè)備低溫離心機,為深圳瑞沃德生命科技有限公司產(chǎn)品;連續(xù)流動分析儀,為德國布朗盧比公司產(chǎn)品;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,為美國安捷倫公司產(chǎn)品;同時蒸餾萃取裝置,為鄭州科技玻璃儀器廠產(chǎn)品;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;恒溫恒濕箱,為德國賓德公司產(chǎn)品;QS-Ⅱ試樣切絲機,為鄭州天宏自動化技術(shù)有限公司產(chǎn)品;加料泵;填煙器為德國GIZEH金字塔填煙器;立體壓力蒸汽滅菌器,為上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1樣品處理。①黑曲霉菌懸液的制備。挑選黑曲霉單菌落接種至10 mL煙葉液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8(即對數(shù)期),離心(4 ℃,4 500 r/min)后將菌體重懸在1 mL 10%葡萄糖溶液(無菌水配制),得到菌懸液。②黑曲霉預處理煙葉的方法。稱取含水率12%的煙葉碎片30 g,噴施6 mL制備好的黑曲霉菌懸液,對照樣品噴施等量無菌水。將處理后的樣品煙葉和對照煙葉裝入無菌食品袋中,于溫度28 ℃、濕度60%恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵12 h。③自釀米酒酒糟發(fā)酵處理煙葉的方法。將煙葉碎片平鋪開(盡量不要重疊)并把酒糟涂抹在煙葉碎片上,蓋上4層紗布,置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。

1.3.2試驗方法。將各處理的煙葉切絲并取適量煙絲進行化學成分和致香成分分析,剩余部分煙絲制成卷煙,用于后續(xù)的感官評價。對比各處理前后的煙葉常規(guī)化學成分、致香成分和感官質(zhì)量的變化,確定通過提質(zhì)處理后煙葉總體品質(zhì)的提升效果。試驗處理設(shè)計見表1。

表1 試驗處理設(shè)計

1.3.2.1常規(guī)化學成分測定。參考YC/T 161—2002 《煙草及煙草制品 總氮的測定 連續(xù)流動法》、YC/T 160—2002 《煙草及煙草制品 總植物堿的測定 連續(xù)流動法》、YC/T 159—2002 《煙草及煙草制品 水溶性糖的測定 連續(xù)流動法》、YC/T 217—2007 《煙草及煙草制品 鉀的測定 連續(xù)流動法》、YC/T 162—2002 《煙草及煙草制品 氯的測定 連續(xù)流動法》對煙絲中常規(guī)化學成分(總氮、總植物堿、水溶性糖、還原糖、鉀、氯)進行測定。

1.3.2.2致香物質(zhì)的測定及分類。致香物質(zhì)的樣品處理方法與GC/MS分析條件參照文獻[11]的方法,以萘作為內(nèi)標化合物。致香物質(zhì)的分類方法參考文獻[12]。

1.3.2.3樣品評價。由專業(yè)評吸人員在同一時間分別對單料煙進行評吸,每次抽吸3支卷煙,對每個處理的單料煙進行3次評吸。以T1為對照(CK),對T2、T3處理香氣質(zhì)、量的變化以及口感的改善等方面進行評價。

1.3.3數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)處理中采用LSD法進行多重比較;利用Microsoft Excel 2019和IBM SPSS Statistics 26軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析;使用OriginPro 2021軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)化學成分分析煙葉的香氣主要反映煙葉的內(nèi)在品質(zhì),煙葉的常規(guī)化學成分影響煙氣成分的釋放效果以及煙草的吃味[13-14]。由表2可知,T2、T3處理總氮、總植物堿、水溶性糖的含量與T1處理存在顯著差異,而T2、T3處理間差異不顯著。T1、T2、T3處理鉀和氯的含量變化不大;T2、T3處理煙葉的總氮、總植物堿含量較T1處理明顯下降,T2、T3處理水溶性糖、還原糖的含量較T1處理有所上升;T3處理總氮、總植物堿和還原糖的含量較T2處理略有下降,T3處理水溶性糖的含量較T2處理略有提升。

表2 各處理煙葉常規(guī)化學成分含量比較

優(yōu)質(zhì)烤煙煙葉化學成分標準如下:總植物堿含量為1.6%～3.0%、總氮含量為1.5%～2.3%、總氮與總植物堿的比值小于1、還原糖含量為8%～18%、還原糖與總植物堿的比值為3～7[15]。利用黑曲霉對煙葉進行預發(fā)酵后的低次煙葉化學成分含量幾乎達到優(yōu)質(zhì)煙葉的水平,這與趙銘欽等[6]的研究結(jié)果相吻合;通過酒糟進行二次發(fā)酵對預發(fā)酵煙葉常規(guī)化學成分含量的影響不大。

2.2 煙葉致香物質(zhì)分析煙草香氣質(zhì)量狀況是多種致香物質(zhì)的組成、含量、比例及相互作用共同決定的[16]。參考文獻[4]方法將煙氣中致香物質(zhì)大致分為質(zhì)體色素降解產(chǎn)物、苯丙氨酸類降解產(chǎn)物、美拉德反應產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物和其他類致香物質(zhì)5類,其中質(zhì)體色素降解產(chǎn)物又可分為類胡蘿卜素降解產(chǎn)物和葉綠素降解產(chǎn)物。

2.2.1致香物質(zhì)檢測分析。由表3可知,對T1、T2、T3處理煙葉進行致香成分檢測,分別檢測出37、41和40種致香物質(zhì),致香物質(zhì)總含量分別為596.112、745.449和787.639 μg/g。與T1處理相比,T2、 T3處理煙葉的大部分致香物質(zhì)含量明顯增加。其中,通過黑曲霉及酒糟發(fā)酵處理(T3)后植醇、新植二烯、β-大馬酮、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮D、吲哚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、3-甲基-1-丁醇、己醛、5-甲基-糠醛、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、茄那士酮、西柏三烯二醇、面包酮、肉豆蔻酸、正十六酸、棕櫚酸乙酯等致香物質(zhì)的含量較T1處理均有所增加。與T1處理相比,T2處理植醇、藏紅花醛、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、巨豆三烯酮B、巨豆三烯酮D、苯甲醛、吲哚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、5-甲基-糠醛等致香物質(zhì)含量的增加幅度超過20%,說明黑曲霉預處理后煙葉的主要致香物質(zhì)含量明顯增加。酒糟二次發(fā)酵處理(T3)后的煙葉新植二烯含量較僅經(jīng)過黑曲霉處理(T2)的煙葉明顯增加。新植二烯是葉綠素的降解產(chǎn)物,能夠減輕刺激并柔和煙氣,同時新植二烯還能夠協(xié)助煙氣中的其他揮發(fā)性香氣物質(zhì)進入煙氣[13]。該結(jié)果也進一步證實黑曲霉發(fā)酵能夠降低煙葉的刺激性。

2.2.2各類別致香成分含量變化。由表4可知,發(fā)酵處理前后煙葉的主要致香物質(zhì)除苯丙氨酸類降解產(chǎn)物外含量都存在明顯變化,其中其他類致香物質(zhì)的變異系數(shù)最大,為45.554%;苯丙氨酸類降解產(chǎn)物含量的變異系數(shù)最小,變異系數(shù)為7.705%。其他類致香物質(zhì)含量最高,美拉德反應產(chǎn)物的含量最低。由表5可知,除西柏烷類降解產(chǎn)物外,T2、T3處理的葉綠素降解產(chǎn)物、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物、苯丙氨酸類降解產(chǎn)物、美拉德反應產(chǎn)物、其他類致香物質(zhì)的含量均高于T1處理,其中葉綠素降解產(chǎn)物、其他類致香物質(zhì)和類胡蘿卜素降解產(chǎn)物的含量明顯增加,這對于煙葉香氣質(zhì)量有著非常明顯的正向作用[17]。

表4 煙葉主要致香物質(zhì)含量分析

表5 各處理主要致香物質(zhì)含量的比較

2.3 感官質(zhì)量評價結(jié)果各處理感官評價結(jié)果如下:T1,生煙感比較強,生青、木質(zhì)雜氣明顯,青滋香稍重,鼻腔刺激明顯,口腔有苦澀感;T2,舌面刺激減小、勁頭稍顯不足、煙香成熟感有所增加、香氣醇和感明顯提升、余味回甘回甜、有其他香氣產(chǎn)生、略有清香;T3,提升煙香成熟感的作用明顯,香氣透發(fā)性、質(zhì)感均有所提升,甜潤感增加,清香偏弱,烤甜香增加,香氣整體協(xié)調(diào),煙香醇和感明顯提升,余味舒適,品質(zhì)提升明顯。由此可見,T2、T3處理煙葉感官質(zhì)量相較于T1處理顯著提升,而T3處理煙葉感官質(zhì)量較T2處理也有明顯改善。T2處理相較于T1處理煙葉感官質(zhì)量的上升主要體現(xiàn)在刺激性明顯下降且煙香更加協(xié)調(diào),而T3處理相較于T2處理煙葉感官質(zhì)量的改善主要體現(xiàn)在香氣質(zhì)感和整體協(xié)調(diào)性的上升?？傮w來看,感官質(zhì)量的改善主要體現(xiàn)在煙葉刺激性的降低以及生青雜氣的掩飾;經(jīng)過處理的煙葉甜感和煙香成熟感逐漸增加,清香型風格逐漸變?nèi)?煙氣的烤甜香逐漸增加。二次發(fā)酵雖然能使煙葉香氣協(xié)調(diào)且能提升煙氣的質(zhì)感、醇和性以及透發(fā)性,但是煙葉的清香風格可能會被掩蓋,烤甜香會有所增加。

3 結(jié)論

經(jīng)酒糟與黑曲霉二次發(fā)酵處理的低次煙葉相較于未經(jīng)處理的低次煙葉無論從化學成分、致香物質(zhì)的種類及含量還是感官質(zhì)量方面都有較大提升,雖然處理后的煙葉清香風格會有所掩蓋,但總體來看經(jīng)過該方法處理的低次煙葉能夠很好地改善煙葉品質(zhì)。該試驗結(jié)果可為后續(xù)酒糟發(fā)酵及黑曲霉發(fā)酵工藝在工業(yè)中的進一步應用提供有力的理論支持,今后還要進一步完善其中試放大工藝條件,以加快其在低次煙葉提質(zhì)中的推廣應用。