人參多糖對(duì)腸上皮屏障的增強(qiáng)作用及其機(jī)制*

劉乙婷,朱惠彬,陳婉霞,王安榮,胡玲,李茹柳

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心、脾胃研究所,廣州 510405)

中醫(yī)脾胃功能包含了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)腸道屏障的作用[1]。脾虛證患者可見胃腸黏膜屏障損傷的病理表現(xiàn),如黏膜顆粒樣隆起、橋狀黏膜及腸黏膜皺襞淺薄等[2]。黏膜屏障損傷是胃腸疾病的重要發(fā)病機(jī)制之一[3],而腸道屏障的維持和修復(fù)是腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要因素。腸上皮屏障穩(wěn)定性取決于其連接復(fù)合體的活性,連接復(fù)合體由緊密連接、黏附連接和橋粒等組成,控制上皮細(xì)胞與細(xì)胞間的連接和屏障功能[4];其中黏附連接的優(yōu)先形成對(duì)上皮細(xì)胞間緊密連接的組裝至關(guān)重要,黏附連接水平的改變調(diào)節(jié)著緊密連接復(fù)合體的穩(wěn)定性,并影響腸上皮細(xì)胞旁的通透性[5]。黏附連接以E-cadherin(Ca2+依賴蛋白)為黏著受體,與連環(huán)蛋白(α-catenin和β-catenin)結(jié)合形成E-鈣粘蛋白/連環(huán)蛋白復(fù)合體,通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),對(duì)維持正常上皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性起著重要作用[6]。多胺通過(guò)不同的細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞間連接蛋白的表達(dá),從而影響細(xì)胞間滲透性,對(duì)于維持胃腸道黏膜完整性具有重要作用[7]。

益氣健脾是脾虛證的主要治則,益氣健脾中藥能改善脾虛證患者的腸黏膜屏障功能[8-9]。人參是益氣健脾中藥的代表藥之一,它是獨(dú)參湯、參附湯、生脈散、四君子湯和歸脾湯等著名方劑的主要組成藥物。人參含有皂苷、多糖、揮發(fā)油、多肽、微量元素等成分,人參多糖是其主要有效成分之一[10]。本課題組研究表明,人參為君藥的四君子湯(水提物和多糖)對(duì)吲哚美辛所致大鼠小腸黏膜損傷有改善作用,機(jī)制與其提高小腸黏膜多胺(精脒)含量、降低血漿D-乳酸(腸通透性指標(biāo))、提高小腸黏膜Ca2+含量及緊密連接和黏附蛋白蛋白表達(dá)有關(guān)[11];人參多糖能減輕吲哚美辛所致的大鼠小腸黏膜損傷,提高大鼠小腸黏膜Ca2+含量,促進(jìn)大鼠小腸(十二指腸)上皮細(xì)胞遷移[12];人參多糖還能促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞(IEC-6)遷移,作用機(jī)制與其影響多胺信號(hào)通路Ca2+調(diào)控有關(guān)[12]。綜合本課題組在動(dòng)物和細(xì)胞的研究結(jié)果表明,人參多糖有腸黏膜保護(hù)作用,機(jī)制與其調(diào)節(jié)多胺、Ca2+、連接蛋白表達(dá)及上皮屏障有關(guān)。本研究在此基礎(chǔ)上,聚焦人參多糖對(duì)細(xì)胞間黏附連接蛋白及上皮屏障的作用,觀察在正常培養(yǎng)、二氟甲基鳥氨酸(α-difluoromethylornithine,DFMO)負(fù)荷(抑制多胺合成)和無(wú)鈣培養(yǎng)等不同實(shí)驗(yàn)條件下人參多糖對(duì)相關(guān)指標(biāo)的影響,進(jìn)一步探討人參多糖的腸黏膜保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1受試藥 人參藥材為五加科植物人參(生曬參)PanaxginsengC.A.Mey.干燥根,由河北楚風(fēng)中藥飲片有限公司提供(批號(hào):B704201)。人參飲片經(jīng)水提醇沉、sevag法去蛋白、DEAE-52纖維素層析柱純化得到人參多糖提取物,即為本實(shí)驗(yàn)受試藥人參多糖[12],其得率2.70%,苯酚硫酸法測(cè)得糖含量97.21%,高效凝膠滲透色譜法測(cè)定人參多糖提取物的平均分子質(zhì)量為4.64×109,并用氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析了人參多糖提取物的單糖組成,提示其為非均一性雜多糖。實(shí)驗(yàn)劑量以人參多糖凍干粉質(zhì)量計(jì)算,實(shí)驗(yàn)時(shí)以磷酸鹽緩沖液配成所需濃度,經(jīng)孔徑0.22 μm濾膜濾過(guò),-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2細(xì)胞株 大鼠小腸隱窩細(xì)胞(IEC-6)(貨號(hào):CRL-1592-ATC,批號(hào):70036277),由美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)(American Type Culture Collection,ATCC)提供;選擇17～23代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.3主要試劑 胎牛血清(ExCell Bio公司,批號(hào):12J193);青霉素-鏈霉素雙抗(批號(hào):158926)、達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco's minimum essential medium,DMEM)高糖培養(yǎng)基(批號(hào):8122049)、DMEM無(wú)鈣培養(yǎng)基(批號(hào):2337285)、漢克平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution,HBSS,批號(hào)2277091)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trpsin-ethylene diamine tetraacetic acid,Trpsin-EDTA )(批號(hào):25200-056),均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司; DFMO(批號(hào):103461)、Fluo-3AM(批號(hào):101047),均購(gòu)自美國(guó)MCE公司;磷酸鹽緩沖液(批號(hào):ABC211556,美國(guó)HyClone公司);腐胺(PuT,批號(hào):BCCB7540,美國(guó)Sigma公司);小鼠單克隆抗E-cadherin抗體(批號(hào):ab231303)、兔單克隆抗α-catenin抗體(批號(hào)ab51032:)、兔單克隆抗β-catenin抗體(批號(hào):ab32572)、山羊抗小鼠IgG(批號(hào):GR252791-2)、山羊抗兔IgG(批號(hào):GR3391208-7),均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;Transwell小室(批號(hào):10521052,美國(guó)Corning公司)。

1.1.4儀器 3111型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo scientific公司);Mili-Q Integral 3型超純化水系統(tǒng)(美國(guó)Milipore公司);AUW120D型分析天平(日本島津公司,感量:0.1、0.01 mg);PowerPacUniversalTM電泳儀,ChemiDocTMXRS+成像儀(美國(guó)伯樂(lè)公司);徠卡SP8型共聚焦熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后接種于T75培養(yǎng)瓶,以含5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。隔天換液,細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%時(shí),EDTA-胰酶消化細(xì)胞以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2Transwell酚紅透過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞間滲透性 4×106·mL-1密度接種細(xì)胞于T25培養(yǎng)瓶,按不同實(shí)驗(yàn)條件分別加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基。無(wú)負(fù)荷實(shí)驗(yàn):正常含鈣培養(yǎng)組加入完全培養(yǎng)基5 mL,陽(yáng)性對(duì)照藥組加入含終濃度5 μmol·L-1腐胺(PuT)的完全培養(yǎng)基5 mL,受試藥組加入含終濃度40、80、160 mg·L-1人參多糖的完全培養(yǎng)基5 mL。DFMO負(fù)荷實(shí)驗(yàn):各組加藥方法同“無(wú)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)”,模型對(duì)照組以DFMO(2.5 mmol·L-1)造模,陽(yáng)性對(duì)照藥組為DFMO+PuT,受試藥組為DFMO+人參多糖各劑量。無(wú)鈣培養(yǎng)實(shí)驗(yàn):各組加藥方法同“無(wú)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)”,模型對(duì)照組以無(wú)鈣培養(yǎng)液造模,陽(yáng)性對(duì)照藥組為含PuT的無(wú)鈣培養(yǎng)液,受試藥組為含人參多糖各劑量的無(wú)鈣培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后,各組細(xì)胞消化,離心,重懸,以4×105·mL-1密度均勻接種于Transwell小室,分別加入各組受試藥于上室200 μL,下室600 μL;繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,磷酸鹽緩沖液沖洗上、下室2次,吸凈殘余磷酸鹽緩沖液,快速往上室加200 μL無(wú)血清的酚紅培養(yǎng)基,下室加入磷酸鹽緩沖液600 μL,培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后,分別取出上、下室溶液各200 μL于96孔板,酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)溶液吸光度(A值)。酚紅透過(guò)率(%)=(下室溶液A值/上室溶液A值)×100%。

1.2.3Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞以4×106·mL-1密度接種于規(guī)格100 mm培養(yǎng)皿,每孔加入完全培養(yǎng)基6 mL。培養(yǎng)24 h后,用1 mL移液器吸頭在皿底作“十”字劃痕,磷酸鹽緩沖液沖洗2次后,正常含鈣培養(yǎng)組加入低濃度血清培養(yǎng)基(2%胎牛血清,以避免細(xì)胞增殖對(duì)觀察受試藥作用的影響)6 mL,陽(yáng)性對(duì)照藥組加入含終濃度為5 μmol·L-1PuT的低濃度血清培養(yǎng)基6 mL,受試藥組加入含終濃度40、80、160 mg·L-1人參多糖的低濃度血清培養(yǎng)基6 mL。DFMO負(fù)荷實(shí)驗(yàn):模型對(duì)照組以DFMO(5 mmol·L-1)造模,陽(yáng)性對(duì)照藥組為DFMO+PuT,受試藥組為DFMO+人參多糖各劑量。無(wú)鈣培養(yǎng)實(shí)驗(yàn):各組加藥方法同“無(wú)負(fù)荷實(shí)驗(yàn)”,模型對(duì)照組以無(wú)鈣培養(yǎng)液造模,陽(yáng)性對(duì)照藥組為含PuT的無(wú)鈣培養(yǎng)液,受試藥組為含人參多糖各劑量的無(wú)鈣培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后,提取細(xì)胞總蛋白,二喹啉甲酸試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉1 h,洗膜后一抗孵育過(guò)夜,一抗選用E-cadherin(1：1 000)、α-catenin(1：1 000)、β-catenin(1：1 000),洗膜后二抗孵育1 h,E-cadherin、α-Tubulin選用山羊抗小鼠二抗(1：5 000),α-catenin、β-catenin選擇山羊抗兔二抗(1：5 000),洗膜后加入電化學(xué)發(fā)光液避光孵育數(shù)秒,ChemiDocTMXRS+成像儀觀察蛋白條帶,Image J軟件分析條帶灰度值,計(jì)算目的蛋白與α-Tubulin蛋白條帶的灰度值之比,即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞Ca2+水平 細(xì)胞復(fù)蘇后,接種于T75培養(yǎng)瓶,于培養(yǎng)箱以37 ℃、飽和濕度、5%CO2條件培養(yǎng);隔天換液,細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí),EDTA-胰酶消化細(xì)胞,以4×105·mL-1密度,每孔完全培養(yǎng)基2 mL接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用1 mL移液器吸頭沿皿底劃一直線劃痕,磷酸鹽緩沖液沖洗2次,正常含鈣培養(yǎng)組加入完全培養(yǎng)基2.5 mL,陽(yáng)性對(duì)照藥組加入含終濃度為5 μmol·L-1PuT的完全培養(yǎng)基2.5 mL,受試藥組加入含終濃度為40、80、160 mg·L-1人參多糖的完全培養(yǎng)基2.5 mL。DFMO負(fù)荷實(shí)驗(yàn):模型對(duì)照組以DFMO(2.5 mmol·L-1)造模,陽(yáng)性對(duì)照藥組為DFMO+PuT,受試藥組為人參多糖各劑量+DFMO。培養(yǎng)12 h后,HBSS液沖洗3次,每皿加入終濃度為5 μmol·L-1的Fluo-3/AM探針裝載液1 mL,培養(yǎng)箱中避光孵育45 min。吸棄裝載液,HBSS液沖洗細(xì)胞3次,加入適量HBSS液,培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。激光共聚焦顯微鏡下打開488 nm激光源,放大200倍,先在明場(chǎng)下找到劃痕區(qū)域附近的視野,再進(jìn)行熒光圖片采集,每皿選擇6個(gè)視野采集熒光照片。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS26.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Graph Prism 6軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn),符合正態(tài)分布進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),不符合方差齊則采用Games-Howell檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1人參多糖對(duì)細(xì)胞間滲透性的影響 正常含鈣培養(yǎng)、含鈣培養(yǎng)+DFMO負(fù)荷、無(wú)鈣培養(yǎng)3種實(shí)驗(yàn)條件下,人參多糖對(duì)細(xì)胞間滲透性的藥效作用見圖1。結(jié)果顯示,正常含鈣培養(yǎng)時(shí)人參多糖(80、160 mg·L-1)可降低細(xì)胞間滲透性(P<0.01),提示人參多糖有增強(qiáng)細(xì)胞屏障的作用;DFMO負(fù)荷可增加細(xì)胞間滲透性(P<0.01),即多胺減少可對(duì)細(xì)胞屏障產(chǎn)生不利影響,人參多糖(80、160 mg·L-1)對(duì)DFMO所致細(xì)胞間滲透性增加有干預(yù)作用(P<0.05或P<0.01);無(wú)鈣培養(yǎng)可致細(xì)胞間滲透性增加(P<0.01),即胞外缺乏Ca2+(因缺乏胞外Ca2+內(nèi)流途徑而使胞內(nèi)Ca2+水平降低)可影響細(xì)胞屏障功能,人參多糖(80、160 mg·L-1)對(duì)無(wú)鈣培養(yǎng)所致的細(xì)胞間滲透性增加有干預(yù)作用(P<0.01)。以上結(jié)果提示人參多糖增強(qiáng)和改善細(xì)胞屏障的作用與其影響多胺和Ca2+調(diào)節(jié)有關(guān)。

A1.正常對(duì)照組;A2.模型對(duì)照組;B.陽(yáng)性對(duì)照藥組;C.人參多糖40 mg·L-1組;D.人參多糖80 mg·L-1組;E.人參多糖160 mg·L-1組。①與正常對(duì)照組比較,t=3.730～11.72,P<0.01;②與模型對(duì)照組比較,t=4.022～5.244,P<0.01;③與模型對(duì)照組比較,t=2.658,P<0.05。

2.2人參多糖對(duì)細(xì)胞黏附連接蛋白表達(dá)的影響

2.2.1人參多糖對(duì)細(xì)胞黏附連接蛋白表達(dá)的影響 正常含鈣培養(yǎng)條件下,人參多糖對(duì)細(xì)胞黏附連接蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖2?？梢?正常含鈣培養(yǎng)時(shí)人參多糖(40、80或160 mg·L-1)可提高E-cadherin、α-catenin和β-catenin蛋白表達(dá)(P<0.05或P<0.01);表明人參多糖有提高黏附連接蛋白E-cadherin、α-catenin和β-catenin表達(dá)的作用。

A1.正常對(duì)照組;B.陽(yáng)性對(duì)照藥組;C.人參多糖40 mg·L-1組;D.人參多糖80 mg·L-1組;E.人參多糖160 mg·L-1組。①與正常對(duì)照組比較,t=2.337～2.854,P<0.05;②與正常對(duì)照組比較,t=3.303～11.260,P<0.01。

2.2.2人參多糖對(duì)細(xì)胞黏附連接蛋白表達(dá)的影響 DFMO負(fù)荷培養(yǎng)條件下,人參多糖對(duì)細(xì)胞黏附連接蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖3?？梢?DFMO負(fù)荷可降低黏附連接蛋白E-cadherin和α-catenin表達(dá)(P<0.01或P<0.05),但對(duì)β-catenin蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05);人參多糖(80,160 mg·L-1)對(duì)DFMO負(fù)荷所致的E-cadherin和α-catenin表達(dá)降低有干預(yù)作用(P<0.05),而對(duì)β-catenin蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05)。提示人參多糖可改善DFMO負(fù)荷所致的黏附連接蛋白E-cadherin和α-catenin表達(dá)降低。

A1.正常對(duì)照組;A2.模型對(duì)照組;B.陽(yáng)性對(duì)照藥組;C.人參多糖40 mg·L-1組;D.人參多糖80 mg·L-1組;E.人參多糖160 mg·L-1組。①與正常對(duì)照組比較,t=2.316、2.398,P<0.05;②與模型對(duì)照組比較,t=2.379、3.614,P<0.05;③與模型對(duì)照組比較,t=2.882,P<0.01。

2.2.3人參多糖對(duì)細(xì)胞黏附連接蛋白表達(dá)的影響 無(wú)鈣培養(yǎng)條件下,人參多糖對(duì)細(xì)胞黏附連接蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖4?？梢?無(wú)鈣培養(yǎng)可致E-cadherin、α-catenin和β-catenin表達(dá)下降(P<0.01);人參多糖(40、80 mg·L-1)對(duì)E-cadherin和α-catenin蛋白表達(dá)降低有干預(yù)作用(P<0.05或P<0.01),但對(duì)β-catenin蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05)。提示胞外Ca2+缺乏可致黏附連接蛋白(E-cadherin和α-catenin)表達(dá)降低,人參多糖對(duì)無(wú)鈣培養(yǎng)所致的E-cadherin和α-catenin蛋白表達(dá)降低有一定改善作用。

A1.正常對(duì)照組;A2.模型對(duì)照組;B.陽(yáng)性對(duì)照藥組;C.人參多糖40 mg·L-1組;D.人參多糖80 mg·L-1組;E.人參多糖160 mg·L-1組。①與正常對(duì)照組比較,t=4.296,5.268,7.852,P<0.01;②與模型對(duì)照組比較,t=3.165～4.477,P<0.01;③與模型對(duì)照組比較,t=2.149,P<0.05。

2.3人參多糖對(duì)細(xì)胞Ca2+水平的影響 無(wú)負(fù)荷和DFMO負(fù)荷時(shí)人參多糖對(duì)細(xì)胞Ca2+水平的影響見圖5。各組熒光強(qiáng)度(反映細(xì)胞Ca2+水平)結(jié)果顯示,無(wú)負(fù)荷時(shí)人參多糖(40、80、160 mg·L-1)能提高細(xì)胞Ca2+水平(P<0.05);熒光結(jié)果顯示,DFMO負(fù)荷可致細(xì)胞Ca2+水平降低(P<0.01),人參多糖(40、80、160 mg·L-1)對(duì)DFMO所致Ca2+水平降低有改善作用(P<0.01);結(jié)果表明人參多糖有提高Ca2+水平的作用。

A1.正常對(duì)照組;A2.模型對(duì)照組;B.陽(yáng)性對(duì)照藥組;C.人參多糖40 mg·L-1組;D.人參多糖80 mg·L-1組;E.人參多糖160 mg·L-1組。①與正常對(duì)照組比較,t=2.486～3.051,P<0.05;②與正常對(duì)照組比較,t=8.698,P<0.01;③與模型對(duì)照組比較,t=5.186～10.320,P<0.01。

3 討論

人參味甘、微苦,具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智的功效,是益氣健脾中藥的代表藥[13]。人參的藥理作用包括抗腫瘤、抗菌、抗衰老、抗疲勞、提高免疫力、調(diào)節(jié)神經(jīng)功能等,對(duì)胃腸黏膜也有保護(hù)作用[14-16]。臨床研究表明,腸黏膜屏障功能受損與多種病變有關(guān)(包括腸道和全身疾病)[17]。某些臨床情況下黏附連接比緊密連接更脆弱,黏附連接在上皮屏障功能異常的病理機(jī)制中有重要意義[18-19]。E-鈣黏蛋白是黏附連接的主要組成部分,其通過(guò)降低細(xì)胞連接界面的“界面張力”來(lái)介導(dǎo)“接觸擴(kuò)張”[20]。E-cadherin的N端胞外區(qū)對(duì)Ca2+有高度敏感性,其通過(guò)與Ca2+特異性結(jié)合發(fā)揮黏附作用。E-cadherin與β-catenin形成E-cadherin/β-catenin復(fù)合體,再通過(guò)α-catenin共同形成E-鈣黏蛋白-連環(huán)蛋白復(fù)合體,從而與細(xì)胞骨架連接[21]。多胺對(duì)于正常的腸道上皮屏障功能是必不可少的,DFMO抑制細(xì)胞多胺會(huì)降低E-cadherin蛋白表達(dá),增加細(xì)胞旁通透性,而DFMO負(fù)荷的同時(shí)給予外源性多胺可阻止這一現(xiàn)象[22];多胺耗竭降低了細(xì)胞Ca2+水平,可致E-cadherin蛋白降解,而加入Ca2+離子載體離子霉素可在多胺缺乏的細(xì)胞增加E-cadherin蛋白的穩(wěn)定性[23]。細(xì)胞間滲透性是上皮屏障功能的重要指標(biāo),本研究利用Transwell通過(guò)檢測(cè)上、下室的酚紅透過(guò)率來(lái)反映細(xì)胞間的滲透性,反映受試藥對(duì)細(xì)胞屏障功能的影響。Fluo-3/AM是一種鈣離子熒光探針,它穿透胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被胞內(nèi)酯酶剪切形成Fluo-3,Fluo-3游離配體可與細(xì)胞游離Ca2+結(jié)合產(chǎn)生熒光,用激光共聚焦顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞Ca2+水平。

本研究觀察人參多糖對(duì)細(xì)胞在正常含鈣培養(yǎng)(無(wú)負(fù)荷)、抑制多胺合成(含鈣培養(yǎng)+DFMO負(fù)荷)或無(wú)鈣培養(yǎng)(培養(yǎng)液的Ca2+以Mg2+替代)時(shí)的滲透性、黏附連接蛋白表達(dá)及細(xì)胞Ca2+水平的影響,主要針對(duì)多胺及Ca2+對(duì)上皮屏障的調(diào)控作用,探討人參多糖腸黏膜保護(hù)作用。結(jié)果顯示,在3種實(shí)驗(yàn)條件下人參多糖有增強(qiáng)或改善上皮屏障的作用,作用機(jī)制與其影響多胺和Ca2+調(diào)節(jié)有關(guān)。黏附連接蛋白是上皮屏障的重要構(gòu)成部分,本研究在獲得人參多糖對(duì)細(xì)胞間滲透性調(diào)節(jié)作用的藥效后,還觀察了人參多糖對(duì)黏附連接蛋白(E-cadherin、α-catenin和β-catenin)表達(dá)的影響,結(jié)果顯示在3種實(shí)驗(yàn)條件下人參多糖均能提高E-cadherin和α-catenin表達(dá),但人參多糖僅在正常含鈣培養(yǎng)時(shí)能提高β-catenin表達(dá),而在DFMO負(fù)荷和無(wú)鈣培養(yǎng)時(shí)對(duì)β-catenin表達(dá)無(wú)明顯影響,即人參多糖對(duì)E-cadherin和α-catenin有調(diào)節(jié)作用而對(duì)β-catenin的作用相對(duì)較弱,此結(jié)果與課題組觀察四君子湯(人參為君藥)對(duì)吲哚美辛所致大鼠胃黏膜損傷防治作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有相似之處(即四君子湯能提高造模大鼠胃黏膜E-cadherin和α-catenin表達(dá)但對(duì)β-catenin作用不明顯)[24],提示人參多糖對(duì)黏附連接復(fù)合體不同蛋白的藥理作用有一定差異性。因E-cadherin是鈣依賴蛋白且是黏附連接的跨膜關(guān)鍵構(gòu)成部分,本研究進(jìn)一步針對(duì)人參多糖對(duì)細(xì)胞Ca2+的影響進(jìn)行其作用機(jī)制探討,結(jié)果顯示人參多糖在正常培養(yǎng)和DFMO負(fù)荷時(shí)均能提高細(xì)胞Ca2+水平,提示人參多糖提高細(xì)胞Ca2+水平的作用是其提高黏附連接蛋白表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞間滲透性的機(jī)制之一。

人參是重要的益氣健脾中藥,人參多糖是其主要有效組分之一,多年來(lái)學(xué)者們從不同角度對(duì)其開展多方面的研究。本課題組圍繞益氣健脾中藥的胃腸黏膜保護(hù)作用開展了系列研究[25-31]。發(fā)現(xiàn)人參多糖能促進(jìn)IEC-6細(xì)胞細(xì)胞遷移,機(jī)制與其提高鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白(TRPC1、Cav-1、PLC-γ1、RhoA、Rac1)及鈣調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合體(RhoA/TRPC1、Cav-1/TRPC1、Rac1/PLC-γ1)表達(dá)有關(guān),表明對(duì)Ca2+的調(diào)節(jié)是人參多糖的重要作用機(jī)制[12];本研究進(jìn)一步探討了人參多糖對(duì)Ca2+-黏附連接蛋白-細(xì)胞滲透性調(diào)節(jié)的作用機(jī)制,從胃腸黏膜損傷修復(fù)的多胺調(diào)節(jié)機(jī)制角度,為人參多糖的作用機(jī)制提供了創(chuàng)新性的研究結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與課題組前期研究相互佐證,表明人參多糖可調(diào)節(jié)Ca2+而影響細(xì)胞遷移和細(xì)胞間滲透性等腸黏膜病理生理過(guò)程,可為研究人參的腸黏膜保護(hù)作用機(jī)制提供參考。