劉晴 李海天 李斌 任美玉 李鎮(zhèn)清 陳玉珍 鄭智中 孟于琪 馮海明

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。肺癌分為兩類(lèi)：非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）。其中，NSCLC最常見(jiàn)，約占所有肺癌病例的85%[2]。手術(shù)、化療、放療和靶向治療等傳統(tǒng)治療方法一直是NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，然而，NSCLC患者從這些傳統(tǒng)治療方式中生存獲益有限。免疫系統(tǒng)在抗腫瘤活性中起著至關(guān)重要的作用，在正常情況下，它可以識(shí)別癌細(xì)胞并在鑒定出腫瘤相關(guān)抗原后啟動(dòng)適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)以去除這些細(xì)胞，使癌癥的治療更接近精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)[3,4]。多項(xiàng)臨床研究[5-7]結(jié)果表明，免疫療法相比傳統(tǒng)化療具有更好的療效和更少的副作用。然而，僅有一部分患者能夠從免疫治療中獲益，更多潛在的免疫治療生物標(biāo)志物需要去探索以篩選優(yōu)勢(shì)人群。高通量測(cè)序技術(shù)作為一種新興的腫瘤疾病檢測(cè)手段，在基因組變異檢測(cè)、臨床應(yīng)用等方面已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展[8]。高通量測(cè)序技術(shù)有助于我們更好地理解肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）的發(fā)病機(jī)理，并進(jìn)一步篩選出用于LUSC診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物?；诖?，本研究采用生物信息學(xué)方法篩選出了癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus, GEO）數(shù)據(jù)集中與LUSC預(yù)后和免疫相關(guān)的基因。此外，我們還探索了目標(biāo)基因在LUSC組織中的表達(dá)情況以及與LUSC免疫微環(huán)境的關(guān)系，為L(zhǎng)USC免疫治療提供了潛在的生物分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中獲取4個(gè)基因芯片（GSE33532、GSE30219、GSE21933、GSE3268）。GSE33532包含16個(gè)LUSC樣本和4個(gè)正常肺組織樣本。GSE30219包含61個(gè)LUSC樣本和14個(gè)正常肺組織樣本。GSE21933包含10個(gè)LUSC樣本和20個(gè)正常肺組織樣本。GSE3268包含5個(gè)LUSC樣本和5個(gè)正常肺組織樣本。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov）（36.0版）下載并整理TCGA-LUSC項(xiàng)目STAR流程的RNAseq數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)，包括502個(gè)LUSC樣本和49個(gè)正常肺組織樣本。

1.2 免疫預(yù)后相關(guān)差異基因獲取 使用R軟件Limma包檢測(cè)LUSC與正常組織之間的差異基因。FDR<0.05和|log2（FC）|>1.0認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然后，利用在線(xiàn)韋恩圖（https://jvenn.toulouse.inrae.fr/app/example.html）分析網(wǎng)站從TCGA、GSE33532和GSE30219這3個(gè)數(shù)據(jù)集中獲得共表達(dá)差異基因。使用R survival包篩選出LUSC預(yù)后相關(guān)基因，將得到的預(yù)后相關(guān)基因?qū)隩IMER數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）進(jìn)一步篩選出免疫預(yù)后相關(guān)基因。

1.3 目標(biāo)基因預(yù)后分析 使用R survival包分析確認(rèn)cAMP依賴(lài)性蛋白激酶抑制劑γ（protein kinase inhibitor gamma,PKIG）表達(dá)和其他臨床變量對(duì)總生存期（overall survival,OS）的影響，單因素中樣本滿(mǎn)足P<0.1就會(huì)進(jìn)入到多因素Cox中構(gòu)建模型。從Cox回歸分析中選擇獨(dú)立的臨床病理預(yù)后變量，使用R rms包構(gòu)建Nomogram相關(guān)模型并進(jìn)行可視化，以評(píng)估LUSC患者1、3和5年的OS率。受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線(xiàn)和時(shí)間依賴(lài)ROC使用R pROC包和timeROC包進(jìn)行創(chuàng)建，結(jié)果用ggplot2包進(jìn)行可視化。

1.4 目標(biāo)基因功能富集分析 為探索PKIG可能參與的生物學(xué)過(guò)程和途徑，我們將TCGA中PKIG表達(dá)水平的中位數(shù)作為截?cái)嘀蛋袻USC樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，使用DESeq2方法對(duì)兩組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，獲得PKIG相關(guān)的差異表達(dá)基因。我們使用R clusterProfiler包對(duì)PKIG差異基因進(jìn)行基因本體（Gene Ontology, GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）以及基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）。此外，從MSigDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb）下載了c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt子集合，用以評(píng)估相關(guān)途徑和分子機(jī)制。結(jié)果P值使用Benjamini and Hochberg（BH）方法進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正。所有分析結(jié)果都通過(guò)R ggplot2包進(jìn)行可視化。

1.5 目標(biāo)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string-db.org）是一個(gè)基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)信息的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，Cytoscape（v3.9.1）是一個(gè)用于可視化分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和生物途徑，并將這些網(wǎng)絡(luò)與注釋、基因表達(dá)譜和其他狀態(tài)數(shù)據(jù)集成在一起的軟件。使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件構(gòu)建PKIG與其相關(guān)基因之間的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks, PPI）。

1.6 目標(biāo)基因免疫浸潤(rùn)分析 通過(guò)單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis, ssGSEA）算法對(duì)LUSC樣本進(jìn)行免疫浸潤(rùn)分析，使用GSVA包對(duì)24種免疫細(xì)胞進(jìn)行分析。通過(guò)Spearman相關(guān)系數(shù)確定PKIG和每個(gè)免疫細(xì)胞亞群之間的關(guān)系。

1.7 目標(biāo)基因TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析 TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://cis.hku.hk/TISIDB/）是一個(gè)通過(guò)整合研究文章和多種類(lèi)型的高通量數(shù)據(jù)建立的關(guān)于腫瘤-免疫相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)。我們使用TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)的“免疫調(diào)節(jié)劑”模塊和“趨化因子”模塊分析了PKIG表達(dá)水平與免疫檢查點(diǎn)基因和趨化因子/趨化因子受體表達(dá)水平之間的相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 箱式圖用于評(píng)估LUSC患者中PKIG基因的表達(dá)水平，數(shù)據(jù)表示為中位數(shù)和四分位數(shù)間距（interquartile range, IQR）。通過(guò)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析兩組之間的差異。使用R survival包和survminer包生成Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)，并使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。此外，還計(jì)算了95%置信區(qū)間的風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio, HR）和對(duì)數(shù)秩P值。通過(guò)單因素Cox回歸分析評(píng)估可能的預(yù)后因素，并利用多因素Cox回歸分析確認(rèn)PKIG表達(dá)與其他臨床變量共同對(duì)生存率的影響。統(tǒng)計(jì)分析均使用R軟件（4.2.1版）。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LUSC中差異基因的鑒定 在GSE33532中，共篩選出3156個(gè)差異基因，包括1462個(gè)上調(diào)基因和1694個(gè)下調(diào)基因。GSE30219中篩選出2410個(gè)差異基因，其中1057個(gè)上調(diào)基因和1353個(gè)下調(diào)基因。在TCGA中，共鑒定出16,058個(gè)差異基因，其中10,565個(gè)上調(diào)基因和5493個(gè)下調(diào)基因。然后，利用維恩圖網(wǎng)站分析這3個(gè)數(shù)據(jù)集的差異基因，最后篩選出1465個(gè)共表達(dá)差異基因，包括688個(gè)上調(diào)基因和777個(gè)下調(diào)基因（圖1）。

圖1 TCGA和GEO數(shù)據(jù)集共表達(dá)差異基因Fig 1 Co-expressed differential genes in TCGA and GEO datasets.TCGA: The Cancer Genome Atlas; GEO: Gene Expression Omnibus.

2.2 免疫預(yù)后相關(guān)差異基因篩選 根據(jù)基因表達(dá)水平的中位數(shù)將LUSC樣本分為高表達(dá)組（前50%樣本）和低表達(dá)組（剩余50%樣本）。使用R語(yǔ)言對(duì)共表達(dá)差異基因進(jìn)行預(yù)后分析并生成Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)圖，共得到157個(gè)預(yù)后相關(guān)基因［PKIG、纖維膠凝蛋白3（ficolin 3,FCN3）、Wolfram綜合征蛋白1（Wolfram syndrome 1,WFS1）、中間α-球蛋白抑制因子H3（inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 3,ITIH3）和橋粒膠蛋白3（desmocollin 3,DSC3）等］（圖2）。在TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中分析這些基因與6種免疫細(xì)胞的相關(guān)性，結(jié)果顯示，PKIG、鋅指E盒結(jié)合同源盒蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox 2,ZEB2）、CD93分子（CD93 molecule,CD93）、含銅胺氧化酶3（amine oxidase, copper containing 3,AOC3）、巨噬細(xì)胞清道夫受體1（macrophage scavenger receptor 1,MSR1）、血小板/內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（platelet/endothelial cell adhesion molecule 1,PECAM1）和激活素受體樣激酶1（activin A receptor type II-like 1,ACVRL1）等29個(gè)基因在LUSC中與免疫相關(guān)（圖3）。其中，PKIG基因在LUSC腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment,TME）中的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。

圖2 LUSC中PKIG（A）、FCN3（B）、WFS1（C）、ITIH3（D）、TMEM231（E）、DSC3（F）、MME（G）、GGCT（H）和PTX3（I）的Kaplan-Meier生存分析。Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis of PKIG (A), FCN3 (B), WFS1 (C), ITIH3 (D), TMEM231 (E), DSC3 (F), MME (G), GGCT (H), and PTX3 (I) in LUSC.LUSC: lung squamous cell carcinoma; PKIG: protein kinase inhibitor gamma; FCN3: ficolin 3; WFS1: Wolfram syndrome 1; ITIH3: inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 3; TMEM231: transmembrane protein 231; DSC3: desmocollin 3; MME: membrane metallo-endopeptidase; GGCT: gamma-glutamyl cyclotransferase; PTX3: pentraxin 3.

圖3 免疫相關(guān)基因與TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析Fig 3Correlation analysis betweenimmune-relatedgenes andimmunecells in TIMERdatabase

2.3 PKIG的差異表達(dá) 為了探索PKIG在正常組織和腫瘤中的表達(dá)水平，我們使用R軟件包從TCGA下載并分析了PKIG在不同腫瘤和正常組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，PKIG在腎上腺皮質(zhì)癌、肝細(xì)胞肝癌、胰腺癌和黑色素瘤等的表達(dá)水平高于正常組織。此外，在食管癌、肺腺癌、肺鱗癌和結(jié)腸癌等腫瘤中觀(guān)察到較低的表達(dá)水平（圖4A）。我們將PKIG在LUSC與癌旁組織中的表達(dá)水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，PKIG在LUSC中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織（P<0.001；圖4B）。其結(jié)果在LUSC和配對(duì)癌旁組織中也得到驗(yàn)證（P<0.001；圖4C）。此外，我們還分析了LUSC患者中PKIG的表達(dá)與OS之間的相關(guān)性，分析顯示，PKIG的表達(dá)水平與OS（P<0.05；圖4D）顯著相關(guān)。

圖4 PKIG的差異表達(dá)。A：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中不同癌癥數(shù)據(jù)集中的PKIG表達(dá)與正常組織對(duì)比；B：PKIG在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)非配對(duì)樣本中的差異表達(dá)；C：PKIG在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)配對(duì)樣本中的差異表達(dá)；D：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中LUSC患者的PKIG表達(dá)水平與OS的相關(guān)性。ns：無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。Fig 4 Differential expression of PKIG.A: The expression of PKIG in different cancer datasets in TCGA database was compared with that in normal tissues; B: Differential expression of PKIG in unmatched samples of TCGA database; C: Differential expression of PKIG in paired samples of TCGA database; D: Correlation between PKIG expression levels and overall survival of LUSC patients in the TCGA database.ACC: adrenocortical carcinoma; BLCA: bladder urothelial carcinoma; BRCA: breast invasive carcinoma; CESC: cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma; CHOL: cholangiocarcinoma; COAD: colon adenocarcinoma; DLBC: lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma; ESCA:esophageal carcinoma; GBM: glioblastoma multiforme; HNSC: head and neck squamous cell carcinoma; KICH: kidney chromophobe; KIRC: kidney renal clear cell carcinoma; KIRP: kidney renal papillary cell carcinoma; LAML: acute myeloid leukemia; LGG: brain lower grade glioma; LIHC:liver hepatocellular carcinoma; LUAD: lung adenocarcinoma; LUSC: lung squamous cell carcinoma; MESO: mesothelioma; OV: ovarian serous cystadenocarcinoma; PAAD: pancreatic adenocarcinoma; PCPG: pheochromocytoma and paraganglioma; PRAD: prostate adenocarcinoma; READ:rectum adenocarcinoma; SARC: sarcoma; SKCM: skin cutaneous melanoma; STAD: stomach adenocarcinoma; TGCT: testicular germ cell tumors;THCA: thyroid carcinoma; THYM: thymoma; UCEC: uterine corpus endometrial carcinoma; UCS: uterine carcinosarcoma; UVM: uveal melanoma;LUSC: lung squamous cell carcinoma; ns: no significance; *: P<0.05 ; **: P<0.01; ***: P<0.001.

2.4 使用獨(dú)立的外部數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證 為了進(jìn)一步驗(yàn)證PKIG在LUSC中的表達(dá)水平，我們選擇了另外兩個(gè)獨(dú)立的外部GEO數(shù)據(jù)集（驗(yàn)證隊(duì)列）來(lái)分析LUSC中癌癥組織和癌旁組織的PKIG表達(dá)水平，包括GSE21933和GSE3268。結(jié)果顯示，在非配對(duì)樣本中LUSC的PKIG表達(dá)水平顯著低于癌旁組織（GSE21933，P<0.001；圖5A）。其結(jié)果在LUSC和配對(duì)癌旁組織中也得到驗(yàn)證（GSE3268，P<0.05；圖5B）。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了PKIG在LUSC中的低表達(dá)。

圖5 外部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證。A：PKIG在非配對(duì)樣本驗(yàn)證集中的差異表達(dá)；B：PKIG在配對(duì)樣本驗(yàn)證集中的差異表達(dá)。*：P<0.05；***：P<0.001。Fig 5 External data set validation.A: Differential expression of PKIG in unmatched sample validation sets; B: Differential expression of PKIG in paired sample validation sets.*: P<0.05; ***: P<0.001.

2.5 PKIG是LUSC的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后指標(biāo) 我們通過(guò)Cox回歸分析探究了PKIG表達(dá)和其他臨床變量對(duì)OS的影響。單因素Cox模型顯示，高PKIG表達(dá)、T分期、M分期和病理分期以及疾病治療結(jié)果穩(wěn)定和進(jìn)展與較差的OS密切相關(guān)（P<0.05；表1）。進(jìn)一步將這些因素進(jìn)行多變量Cox回歸分析，分析結(jié)果顯示，PKIG表達(dá)、T分期和主要治療結(jié)果與OS顯著相關(guān)（P<0.05；表1）。以上數(shù)據(jù)表明，PKIG表達(dá)可以作為與LUSC患者OS相關(guān)的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。

表1 臨床特征的單變量和多變量Cox回歸分析Tab 1 Univariate and multivariate Cox regression analysis of clinical features

2.6 PKIG表達(dá)在LUSC中的診斷價(jià)值 為了分析PKIG表達(dá)在LUSC中的診斷價(jià)值，我們繪制了ROC曲線(xiàn)，并對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的PKIG基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了列線(xiàn)圖分析。ROC曲線(xiàn)是以假陽(yáng)性率為橫坐標(biāo)，真陽(yáng)性率為縱坐標(biāo)繪制出來(lái)的曲線(xiàn)。ROC曲線(xiàn)下面積（area under the curve, AUC）常用于診斷試驗(yàn)的評(píng)估，AUC越接近于1，說(shuō)明該變量在預(yù)測(cè)結(jié)局上診斷效果越好。在本研究中，PKIG的AUC值為0.968，表明變量PKIG的預(yù)測(cè)能力有較高準(zhǔn)確性，如圖6A所示。此外，我們還創(chuàng)建了變量PKIG的時(shí)間依賴(lài)ROC曲線(xiàn)，以預(yù)測(cè)1、3和5年的生存率。所有這些AUC值均>0.50，變量PKIG被認(rèn)為適合預(yù)測(cè)（圖6B）。此外，預(yù)后列線(xiàn)圖結(jié)果表明，PKIG表達(dá)水平的預(yù)測(cè)能力優(yōu)于T分期、N分期、病理分期、性別和年齡這些傳統(tǒng)臨床特征（圖6C）。

圖6 PKIG在LUSC中的診斷價(jià)值。A：PKIG表達(dá)的ROC分析；B：PKIG表達(dá)的時(shí)間依賴(lài)ROC分析；C：預(yù)后列線(xiàn)圖。Fig 6 Diagnostic value of PKIG in LUSC.A: ROC analysis of PKIG expression; B: PKIG expression was time-dependent ROC analysis; C: Prognosis histogram.ROC: receiver operating characteristics.

2.7 LUSC中PKIG差異基因功能富集分析 為了了解PKIG在LUSC中的生物學(xué)功能，我們對(duì)PKIG差異基因中滿(mǎn)足|log2(FC)|>1.5且P.adj<0.05閾值的781個(gè)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。分析發(fā)現(xiàn)這些基因集中富集在體液免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、免疫球蛋白的構(gòu)成、受體配體活性的調(diào)控和神經(jīng)活性受體-配體相互作用等過(guò)程（圖7A，圖7B）。此外，我們還將PKIG差異基因進(jìn)行了GSEA分析，結(jié)果顯示PKIG的高表達(dá)與多種通路相關(guān)，包括CD22介導(dǎo)的B細(xì)胞受體調(diào)控、FCGR3A介導(dǎo)的白介素（interleukin, IL）-10合成、補(bǔ)體的初始觸發(fā)、B細(xì)胞受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、Fceri介導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）激活和清道夫受體對(duì)配體的結(jié)合與攝取等（圖7C-圖7H）。

圖7 PKIG差異基因功能富集分析。A：PKIG差異基因火山圖；B：PKIG差異基因GO和KEGG富集分析氣泡圖；C-H：PKIG差異基因GSEA分析折線(xiàn)圖。Fig 7 PKIG gene functional enrichment analysis.A: PKIG differential gene volcano map; B: PKIG differential gene GO and KEGG enrichment bubble map; C-H: Line map of PKIG differential gene GSEA analysis.

2.8PKIG及其相關(guān)基因PPI分析 我們利用STRING網(wǎng)站和Cytoscape軟件繪制了PKIG與其相關(guān)基因之間的PPI網(wǎng)絡(luò)。PPI分析結(jié)果表明，PKIG與cAMP依賴(lài)性蛋白激酶抑制劑α（protein kinase inhibitor alpha,PKIA）、cAMP依賴(lài)性蛋白激酶抑制劑β（protein kinase inhibitor beta,PKIB）、腺苷脫氨酶（adenosine deaminase,ADA）和尿苷胞苷激酶1（uridine-cytidine kinase 1,UCK1）等10個(gè)不同基因存在蛋白互作關(guān)系，這些基因多數(shù)和cAMP信號(hào)通路有關(guān)（圖8）。

圖8 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析Fig 8 Analysis of proteinprotein interaction network

2.9 PKIG表達(dá)與免疫特性的相關(guān)性 我們使用ssGSEA算法分析了PKIG的表達(dá)水平與LUSC免疫浸潤(rùn)之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示PKIG表達(dá)水平與Tregs（r=0.340,P<0.001）、巨噬細(xì)胞（r=0.472,P<0.001）、自然殺傷細(xì)胞（r=0.511,P<0.001）和Th1輔助細(xì)胞（r=0.451,P<0.001）等免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)（圖9）。

圖9 24種免疫細(xì)胞的相對(duì)豐度與PKIG表達(dá)水平之間的相關(guān)性。A：相關(guān)性棒棒圖；B-E：Tregs、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和Th1輔助細(xì)胞浸潤(rùn)水平與PKIG表達(dá)之間的相關(guān)性散點(diǎn)圖。Fig 9 Correlation between the relative abundance of 24 types of immune cells and PKIG expression levels.A: Correlation bar chart; B-E: Scatter plot of correlation between infiltration levels of regulatory T cells, macrophages, NK cells, and Th1 helper cells and PKIG expression.NK: natural killer; DC: dendritic cell; pDC: plasmacytoid dendritic cell; iDC: immature dendritic cell; aDC: activated dendritic cell.

此外，我們使用TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析了LUSC中PKIG的表達(dá)水平與免疫細(xì)胞趨化因子/趨化因子受體之間的相關(guān)性。熱圖結(jié)果顯示，LUSC中PKIG的表達(dá)水平與CCL2（r=0.503,P<0.001）、CCL3（r=0.378,P<0.001）、CCL5（r=0.358,P<0.001）、CXCL12（r=0.386,P<0.001）、CCR1（r=0.402,P<0.001）、CCR2（r=0.449,P<0.001）、CXCR3（r=0.384,P<0.001）和CXCR4（r=0.492,P<0.001）等多種趨化因子和趨化因子受體的表達(dá)明顯正相關(guān)。隨后，我們使用TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析了人類(lèi)不同類(lèi)型癌癥中PKIG表達(dá)水平與免疫調(diào)節(jié)劑表達(dá)之間的相關(guān)性。結(jié)果提示，PKIG的表達(dá)與細(xì)胞程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1, PDCD1）（r=0.359,P<0.001）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA4）（r=0.375,P<0.001）、T細(xì)胞免疫球蛋白ITIM結(jié)構(gòu)域（T cell immunoglobulin and ITIM domains, TIGITs）（r=0.305,P<0.001）和甲型肝炎病毒細(xì)胞受體2（hepatitis A virus cellular receptor 2, HAVCR2）（r=0.463,P<0.001）等免疫抑制劑的表達(dá)水平呈正相關(guān)（圖10，圖11）。這些結(jié)果提示，PKIG的高表達(dá)可能與癌癥的發(fā)展有關(guān)。

圖10 腫瘤中PKIG與趨化因子（A）、趨化因子受體（B）和免疫抑制劑（C）的相關(guān)性熱圖分析Fig 10 Heat mapanalysis of correlationbetween PKIG andchemokines (A), chemokinereceptors (B) andimmunosuppressants (C) in tumors.

圖11 LUSC中PKIG與CCL2（A）、CCL3（B）、CCL5（C）、CXCL12（D）、CCR1（E）、CCR2（F）、CXCR3（G）、CXCR4（H）、PDCD1（I）、CTLA4（J）、TIGIT（K）和HAVCR2（L）的表達(dá)呈正相關(guān)。Fig 11 The expression of PKIG in LUSC is positively correlated with CCL2 (A), CCL3 (B), CCL5 (C), CXCL12 (D), CCR1 (E), CCR2 (F), CXCR3 (G), CXCR4 (H),PDCD1 (I), CTLA4 (J), TIGIT (K) and HAVCR2 (L).

我們從相關(guān)文獻(xiàn)中下載了三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures, TLSs）的39個(gè)標(biāo)記基因，對(duì)PKIG基因和這39個(gè)標(biāo)記基因進(jìn)行相關(guān)性分析[9]。結(jié)果表明PKIG表達(dá)水平與可誘導(dǎo)共刺激分子（inducible T-cell co stimulator,ICOS）（r=0.473,P<0.001）、獨(dú)立生長(zhǎng)因子1（growth factor independence 1, GFI1）（r=0.424,P<0.001）、CD5（r=0.451,P<0.001）和CCR5（r=0.426,P<0.001）等基因的表達(dá)呈明顯正相關(guān)（圖12A-圖12E）。PKIG高表達(dá)患者CCL8、CCL19、CXCL9、CD200、FBLN7、ICOS、GFI1和白介素1受體1（interleukin 1 receptor 1, IL-1R1）等標(biāo)記基因的表達(dá)水平明顯高于PKIG低表達(dá)患者（圖12F）。以上結(jié)果表明，PKIG可能與TLS的生成高度相關(guān)。

圖12 LUSC中PKIG與TLS標(biāo)記基因的相關(guān)性分析。A：相關(guān)性熱圖；B-E：LUSC中PKIG與ICOS、GFI1、CD5和CCR5的表達(dá)呈正相關(guān)；F：PKIG高低表達(dá)組之間TLS標(biāo)記基因的表達(dá)差異。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。Fig 12 Correlation analysis between PKIG and tertiary lymphoid structure marker genes in LUSC.A: Correlation heat map; B-E: The expression of PKIG in LUSC was positively correlated with ICOS, GFI1, CD5 and CCR5; F: Expression difference of tertiary lymphoid structure marker genes between high and low PKIG expression groups.*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001.

3 討論

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析，鑒定出LUSC免疫預(yù)后相關(guān)基因PKIG。PKIG在蛋白激酶活性的負(fù)性調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的負(fù)性調(diào)節(jié)以及磷酸化等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。有報(bào)道[10]顯示，PKIG過(guò)表達(dá)能夠增加他莫昔芬耐藥乳腺癌細(xì)胞中ErbB7的表達(dá)水平。此外，還有研究[11]表明，PKIG與U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中葡萄糖剝奪過(guò)程的響應(yīng)有關(guān)。然而，目前還沒(méi)有PKIG在肺癌中的相關(guān)報(bào)道。

在本研究中，我們通過(guò)整合多種生物信息學(xué)分析方法確定了PKIG在LUSC中的生物功能和潛在的調(diào)控途徑。我們首先確定了PKIG基因在癌癥中的表達(dá)和預(yù)后價(jià)值，并發(fā)現(xiàn)PKIG的表達(dá)水平在LUSC中顯著下調(diào)。在LUSC中，PKIG表達(dá)水平與OS顯著相關(guān)，并且是LUSC患者OS的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。為了探索PKIG對(duì)LUSC預(yù)后的潛在調(diào)控途徑，我們對(duì)PKIG差異基因進(jìn)行了GO和KEGG以及GSEA富集分析。結(jié)果顯示，這些基因集中富集在體液免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、免疫球蛋白的構(gòu)成、受體-配體活性的調(diào)控和神經(jīng)活性受體-配體相互作用等過(guò)程。并且，PKIG的高表達(dá)還與CD22介導(dǎo)的B細(xì)胞受體調(diào)控、FCGR3A介導(dǎo)的IL-10合成、補(bǔ)體的初始觸發(fā)和B細(xì)胞受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等免疫通路密切相關(guān)。這提示，PKIG可能與LUSC的免疫微環(huán)境相關(guān)，并且可能通過(guò)這些免疫過(guò)程參與調(diào)節(jié)LUSC的進(jìn)展和抗腫瘤免疫反應(yīng)的效率。

以往的研究[12-14]表明，癌癥的發(fā)生、發(fā)展與TME密切相關(guān)。其中，免疫細(xì)胞占TME的很大一部分，因此它們?cè)诮閷?dǎo)促腫瘤和抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，PKIG的表達(dá)與Tregs浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)。在肺癌中，Tregs表達(dá)高親和力IL-2受體與IL-2結(jié)合并螯合IL-4，以降低其對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的作用。此外，Tregs還可以通過(guò)產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞因子、顆粒酶和穿孔素來(lái)抑制免疫力[15-17]。同時(shí)，Tregs在腫瘤、轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)和外周血等多個(gè)組織中的數(shù)量增加，活性增強(qiáng)，這與NSCLC的分期以及轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的發(fā)生高度相關(guān)[18,19]。由此看來(lái)，PKIG可能在TME重塑以及LUSC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且與LUSC的不良預(yù)后有關(guān)。

趨化因子是負(fù)責(zé)免疫細(xì)胞運(yùn)輸和淋巴組織發(fā)育的細(xì)胞因子亞家族，通過(guò)塑造腫瘤免疫和生物表型，而影響腫瘤的進(jìn)展、治療和患者預(yù)后[20,21]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，PKIG的表達(dá)水平與CCL2、CCL5、CXCL12、CCR2和CXCR4等趨化因子/趨化因子受體呈明顯正相關(guān)。CCL2、CCL3和CCL5可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。此外，這些趨化因子還可將髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞募集到TME中，進(jìn)而促進(jìn)和維持人類(lèi)腫瘤干性[22-24]。CXCL12-CXCR4信號(hào)通路在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和干性中發(fā)揮重要作用。CXCL12通過(guò)靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子協(xié)同作用，促進(jìn)腫瘤血管生成。同時(shí)，CXCL12-CXCR4趨化因子軸還有助于單核細(xì)胞MDSCs的募集[24]。在TME中，MDSCs能夠抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞，并通過(guò)釋放CCL3、CCL4和CCL5促進(jìn)Tregs的募集。這可能解釋了PKIG調(diào)節(jié)LUSC免疫浸潤(rùn)的機(jī)制。此外，PKIG還與LUSC中PDCD1、CTLA4、TIGIT和HAVCR2等免疫抑制劑的表達(dá)水平呈正相關(guān)。LUSC中PKIG與這些免疫負(fù)性調(diào)節(jié)因子的顯著正相關(guān)性，提示了PKIG的高表達(dá)可能與癌癥的發(fā)展有關(guān)，且該基因有可能并不是單獨(dú)起作用，而是被動(dòng)調(diào)控的。因此，雖然PKIG在LUSC中相對(duì)于正常組織低表達(dá)，但是在腫瘤患者中PKIG低表達(dá)者相比于高表達(dá)者預(yù)后更好。

最近的一些研究[25-28]發(fā)現(xiàn)，TLS對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICIs）的反應(yīng)提供了預(yù)測(cè)價(jià)值。TLS，是出生后在非淋巴組織中出現(xiàn)的免疫細(xì)胞的組織聚集體。黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、軟組織肉瘤和尿路上皮癌的治療前活檢中存在TLS和活躍的B細(xì)胞浸潤(rùn)已被證明與PDCD1抑制劑或PDCD1抑制劑聯(lián)合CTLA4治療的阻斷反應(yīng)相關(guān)。在探索PDCD1抑制劑新輔助治療NSCLC的研究[29]中，研究者們觀(guān)察到在消退性病變中TLS大量增加。本研究中，我們分析發(fā)現(xiàn)，PKIG的表達(dá)與多個(gè)TLS標(biāo)記基因呈明顯正相關(guān)?；诖耍覀兺茰y(cè)，PKIG可能和TLS的生成有關(guān)，PKIG高表達(dá)患者更有可能對(duì)ICIs治療產(chǎn)生響應(yīng)。

然而，盡管我們對(duì)PKIG進(jìn)行了系統(tǒng)地分析，并使用不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了交叉驗(yàn)證，但我們?nèi)匀蝗狈χ苯幼C據(jù)表明PKIG通過(guò)參與免疫浸潤(rùn)影響患者預(yù)后。我們將在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證PKIG基因的功能。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)PKIG的表達(dá)水平在LUSC中顯著下調(diào)，并對(duì)LUSC的診斷和預(yù)后具有一定的參考價(jià)值。PKIG可能通過(guò)重塑TME影響LUSC的進(jìn)展，有望成為L(zhǎng)USC患者免疫治療的潛在生物分子標(biāo)志物。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Li B, Liu Q and Li HT conceived and designed the study.Liu Q, Li HT and Ren MY performed the experiments.Liu Q, Li ZQ and Chen YZ analyzed the data.Ren MY, Chen YZ and Zheng ZZ contributed analysis tools.Li ZQ, Meng YQ and Feng HM provided critical inputs on design, analysis and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.