燈盞花素在腦缺血疾病治療中作用機制的研究進展

王 瑞,樸 龍

(延邊大學 附屬醫(yī)院1.急診科;2.康復科,吉林 延吉 133000)

急性腦梗塞是突然發(fā)生的腦組織缺血壞死或軟化,中老年為好發(fā)人群,是糖尿病、肥胖癥、高血壓為常見誘因的一種神經系統疾病,其特征是腦部的血流供應障礙或受限,并常導致腦部缺血缺氧性病變及損傷[1]。腦梗塞的預后與急性期的有效治療密切相關。燈盞花素具備使血液循環(huán)活化、改善血供的功效,它是傳統藥用植物燈盞花中國植物志正名為短庭葶飛蓬的粗略提取物。燈盞花素主要成分黃苓素(又名燈盞花乙素、野黃苓苷)具有很高的藥用價值且安全性高[2]。目前燈盞花素已被用于腦血管疾病的治療。

1 抗氧化應激機制

腦缺血損傷的重要病理機制是氧化應激反應,缺血缺氧后,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)會過度產生,這可能跟氧化應激發(fā)生相關[3]。研究表明,通過激活NF-E2相關因子/血紅素加氧酶-1(NF-E2-related Factor 2,Nrf2 / Heme oxygenase-1,HO-1)通路,可緩解缺血造成的細胞損傷。未發(fā)生腦缺血時,Kelch樣ECH相關蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)途徑可降解Nrf2;氧化物質產生時,打亂了Keap1-Nrf2結合,Nrf2與抗氧化應答元件(Antioxidant response elements,ARE)抗氧化反應通路被激活,使組織內的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathion peroxidase,GSH-Px)和HO-1含量增高。同時增加Nrf2和HO-1可緩解缺血造成的組織氧化反應損害。Nrf2是調節(jié)機體發(fā)揮抗氧化作用的重要因子,它可以在轉錄水平上介導調節(jié)ARE的II期解毒酶,并發(fā)揮抗氧化作用的HO-1;在休息條件下,此酶在低水平下隨處可見,并受到大量應激刺激的高度調節(jié)。實驗表明,HO-1在宿主防御ROS生成和氧化損傷方面也起著不可替代的作用[4]。在缺血后的24 h,燈盞花素治療顯著增加了缺血區(qū)Nrf2和HO-1的表達,提示燈盞花素的保護作用可能與Nrf2和HO-1的上調節(jié)表達有關。

缺血再灌注后,減少氧自由基的蓄積是緩解微循環(huán)功能障礙的重要機制,細胞是ROS主要攻擊對象,破壞它們的膜、線粒體等,還會導致細胞自身物質溶解造成機體內皮細胞的破壞。SOD具有抗氧化應激的能力,緩解細胞氧化損害。丙二醛(Malonaldehyde,MDA)是脂類物質氧化應激時的產物,可作為判斷細胞和組織氧化損傷程度的的指標。王娓娓等[5]實驗觀察到燈盞花素抗氧化損傷效果,與缺血損傷組比較,SOD表達水平在受損的血管內皮細胞增加。一氧化氮(NO)是一種對神經細胞有毒的強力氧化應激產物,細胞缺血缺氧后,NO表達量明顯提高。有實驗表明:與缺血損傷組的大鼠相比,燈盞素治療組、燈盞花素聯合丙泊酚組使Nrf2和HO-1mRNA途徑受到抑制,減少了大鼠海馬組織MDA、NO表達含量,提高了SOD水平,改善了大鼠腦缺血損傷造成的神經功能障礙。GSH-Px能夠清除氧化損傷時出現的MDA。缺血損傷組與燈盞花素組相比,發(fā)揮抑制氧化反應的SOD和GSH-Px表達顯著提高,MDA含量顯著減少,提高了細胞的存活率。NO的合成過程需要一氧化氮合酶(Nitric oxide synthetase,NOS)重要參與,發(fā)揮神經毒性作用的是誘導型NOS(iNOS)。楚麗麗等[6]通過實驗觀察到經燈盞花滴丸處理組與氧化應激損傷組比較發(fā)現,MDA含量顯著減少,SOD活性提高,且iNOS活性及NO含量降低。綜上所述,提示燈盞花素可通過抑制MDA、iNOS、NO表達,減少損傷細胞的氧化反應,提高SOD和GSH-Px含量,增加抗氧化能力從而發(fā)揮保護作用。

2 減輕細胞的炎性損傷

腦缺血損傷后,小膠質細胞被活化,致多種炎性介質的釋放。炎性損傷是腦缺血損傷后一個復雜的過程。一旦過多產生促炎因子或者細胞毒性因子,如白細胞介素-1β(Interleukin-1 beta,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、NO等可導致神經細胞損傷[7]。因此,保證小膠質細胞不被過度激活,可減輕腦組織缺血后的炎性損傷。研究發(fā)現,燈盞花素在動物模型中可減輕炎性反應的作用,它可以抑制大鼠原代小膠質細胞系被脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導的促炎介質如TNF-α、IL-1β、NO和ROS的產生。通過分別進行體內外的實驗研究表明,燈盞花乙素使腦缺血大鼠和LPS誘導的BV-2小膠質細胞中促炎介質(TNF-α,IL-1β,NO和ROS)的產生減少,實驗誘導產生的iNOS表達減少。提示燈盞花素通過抑制小膠質細胞活化,以此來減少神經細胞的炎性損傷。

反映全身炎性反應的標記物超敏C反應反蛋白(High-sensitivity C-reactive anti-protein,hs-CRP),可作為監(jiān)測心腦血管疾病的有效指標之一。研究發(fā)現,hs-CRP的降低,可以改善機體的炎性損傷,減輕神經功能障礙[8]。有研究觀察到聯合應用燈盞花素組的患者與常規(guī)用西藥的患者相比,不僅降低了hs-CRP,還減少了炎癥指標TNF-α水平,可用于評估腦缺血的預后情況。機體發(fā)生炎性反應時,NF-κB起到關鍵性作用,研究發(fā)現,當細胞發(fā)生增值凋亡、炎性損傷時,NF-kB-p65蛋白和其抑制性蛋白IkB-α可發(fā)揮重要的作用。丁丹等[9]研究表明缺血損傷后的大鼠降低了p65蛋白,使IκB-α蛋白表達提高,燈盞花素在缺血大鼠模型中發(fā)揮抑制炎癥損傷的作用。在各種先天性免疫細胞中發(fā)現了Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR),在大腦中,TLRs的表達主要由膠質細胞中的小膠質細胞和星形膠質細胞完成,與相應配子附著時,可以產生促炎因子。在腦缺血條件下,神經元中TLR2,TLR4和TLR9的表達升高,大量研究證明,腦缺血導致的炎性反應時,TLR2和TLR4可與內源性配體結合并發(fā)揮重要作用[10]。研究顯示,IL-6和TNF-α受TLR4/NF-κB信號通路調節(jié)。童軍衛(wèi)等[11]實驗結果顯示,燈盞花素組與模型組比較大腦皮質中NF-κB和TLR4表達減少,提示燈盞花素在腦缺血損傷時可通過抑制TLR4/NF-κB 通路的上調減輕腦細胞的炎性損傷。

3 減弱血腦屏障破壞

維持血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)結構完整性對保護神經中樞系統穩(wěn)態(tài)具有重要意義。小膠質細胞和星形膠質細胞在腦組織血液循環(huán)供應不足時被激活,炎癥因子發(fā)生聚集,BBB通透性增加大量有害物質進入,使其結構受到破壞,將會導致大腦炎癥反應和腦水腫的發(fā)生[12]。有實驗結果指出,單用燈盞花素和聯合應用燈盞花素和冰片組與模型組大鼠比較,腦缺血后能明顯提高跨內皮細胞電阻(Transendothelial electrical resistance,TEER)值并使辣根過氧化物酶(Horse radish peroxidase,HRP)的通透率回降,保護BBB完整性;在蛋白表達水平上,聯合組與燈盞花素均使內皮細胞的緊密連接蛋白-1(Zonula occluden 1,ZO-1)和大腦緊密連接蛋白-5(Claudin-5)蛋白的表達增加。以上研究提示燈盞花素改善BBB缺血損傷的機制可能與增加ZO-1和Claudin-5蛋白的表達有關?；|金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)中十分重要的兩種酶基質金屬蛋白酶2和9(MMP-2、MMP-9)能夠將緊密連接的蛋白(TJ)降解破壞BBB結構完整性[13]。與反應性星型膠質細胞、血管內皮細胞、組織細胞相關的是MMP-2,與細胞炎癥反應相關的是MMP-9[14]。實驗研究表明,治療組與模型組大鼠比較,缺血損傷后,BBB的通透性增加,伊文思藍(Evans blue,EB)含量隨著MMP-2和MMP-9表達變化,說明MMP-2和MMP-9和血腦屏障存在密切的相關性。用燈盞花素治療后,模型組大鼠腦部的MMP-2和MMP-9表達降低,腦組織中的EB含量也降低。提示燈盞花素減輕腦細胞損傷的機制可能與抑制MMP-2和MMP-9表達,減輕血腦屏障破壞有關。

4 減少神經細胞凋亡

腦循環(huán)缺血時,神經細胞為了維持機體內環(huán)境自主性的有序死亡,即神經細胞的凋亡。腦血管狹窄或閉塞時,神經細胞的過度或不當凋亡會引起神經功能障礙。因此,神經細胞的保護,成為腦缺血治療的關鍵。細胞凋亡依賴于半胱天冬酶-3(Caspase-3),Caspase-3可被多種途徑激活,一旦被激活可以誘發(fā)神經細胞的不可逆性凋亡[15]。王少華等[16]實驗發(fā)現治療組大鼠與模型組相比,TUNEL染色顯示棕色和褐色凋亡細胞的數量和海馬組織中Caspase-3蛋白表達下降,抑制了觸發(fā)細胞凋亡的途徑。腦缺血時線粒體受損,細胞凋亡被啟動。Lu Yang等[17]實驗表明模型組TUNEL陽性細胞增多,給藥組減少。一些凋亡相關的位點與燈盞花的活性成分具備結合能力,缺血部位的(BCL2-Associated X,Bax)、細胞-c和Caspase-3的表達受限。表明燈盞花的活性成分對腦缺血損傷的細胞凋亡起到重要的抑制作用。提示燈盞花素能通過減少Bax、Caspase-3的表達抑制神經細胞凋亡,增加細胞活力。在腦缺血損傷中,介導炎性反應和促進神經細胞凋亡的主要是由p38和JNK參與的,而ERK發(fā)揮保護神經細胞免受損害的作用[18]。NO含量可誘導神經細胞凋亡發(fā)生,隨著其含量的增加,加劇神經元產生的毒性作用,增加細胞凋亡數量。有研究指出,燈盞花素治療后激活小膠質細胞的p38和JNK表達被顯著下調,p-ERK被上調,同時還降低了iNOS、TNF-α、IL-1β等炎性介質。提示燈盞花素可通過抑制p38和JNK,上調p-ERK,減少NO含量,抑制TNF-α、IL-1β等炎性因子表達,減少細胞凋亡數量,降低腦細胞炎性損傷,緩解神經功能損傷。

5 促進新生血管生成

研究發(fā)現:內皮細胞在缺血灌注損傷后,更早出現受損,引發(fā)一系列炎性反應、血栓形成等效應,加速細胞的凋亡和死亡發(fā)展[19]。血管內皮細胞(Vascular endothelial cell,VECs)的損傷會導致各種內皮細胞的功能障礙,促炎因子的釋放和氧自由基的生成[20]。缺血缺氧條件下,上游缺氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor,HIFs)可被觸發(fā),從而激活下游血管生成中最有效的血管生成因子——血管內皮生長因(Vascular endothelial growth factor,VEGFs)等一系列因子的表達,啟動生成新血管的過程,使細胞對損傷做出反應[21]。VEGF在缺血性疾病損傷修復中起著重要作用,形成新的血管過程是通過增加微循環(huán)中的血管通透性,內皮細胞的增殖及遷移啟動的。王震雨等[22]研究指出,用藥組與模型組大鼠腦組織VEGF蛋白表達比較明顯增高,說明燈盞花素減輕腦細胞損傷作用與促進新生血管形成有關。血小板內皮黏附因子-1(Platelet endothelial adhesion factor-1,PECAM-1)存在于各種細胞,包括內皮細胞、T細胞、中性粒細胞、單核細胞等甚至某些亞基也會表達[23]。有研究發(fā)現,PECAM-1可參與體內外的新生血管形成[24],通過一些實驗觀察到,PECAM-1表達缺陷的小鼠細胞在體外不能形成管樣結構;而過度表達PECAM-1可以形成管樣結構。由此可見,PECAM-1是形成血管的重要標志物。內皮下基底膜和細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)的降解是血管形成的最基本步驟[25]。因此,能激活降解ECM酶是血管生成的基礎。MMPs可以分解EMC,同時可促進內皮細胞遷移。實驗結果顯示,應用燈盞花素后在免疫印跡和RT-PCR技術檢測到PECAM-1的蛋白和mRNA的含量增加明顯;藥物處理后的內皮細胞中MMP-2的mRNA活性增加。以上研究表明,燈盞花素可能通過上調VEGF和PECAM-1表達及增加MMP2活性,改善腦缺血引發(fā)的血管內皮功能障礙。

6 小結

燈盞花素在腦缺血防治中,已獲得一定的研究進展。文中提到,燈盞花素在不同方面發(fā)揮腦保護作用,它降低MDA含量,提高SOD和GSH-Px表達,以此降低氧化損傷程度。燈盞花素通過TLR4/NF-κB信號通路調節(jié)IL-6和TNF-α等炎癥因子;可通過增加ZO-1和Claudin-5,抑制MMP2和MMP9減輕對BBB破壞;通過抑制Bax、Caspase-3表達,下調p38和JNK且上調p-ERK,減少細胞凋亡;還可通過增加VEGF和PECAM-1,改善血管內皮損傷。但腦損傷機制十分復雜,其保護信號通路及各因子之間關系尚未完全被闡明,需要進一步應用各種模型和技術深入研究。