PEDV Nsp10 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白的表達(dá)

牛欣雨，鄭亮，魏佳琪，武峰峰，吳志軍，3，張華，，3，曹宏偉，，3

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院；3.鹽城師范學(xué)院）

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起一種急性腸道傳染病，主要以高度接觸性傳染而廣泛傳播[1]。感染此病毒的豬多伴有嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐、脫水等特征，多感染哺乳仔豬，且具有較高的感染率和死亡率。不同年齡段的豬感染率不同，但一般年齡越小的豬感染率越高，死亡率也越高[2]。豬流行性腹瀉首次爆發(fā)于歐洲英國(guó)，但目前已經(jīng)成為威脅到包括中國(guó)、韓國(guó)、日本等在內(nèi)的亞洲各個(gè)國(guó)家養(yǎng)豬業(yè)的嚴(yán)重傳染性疾病，給亞洲乃至世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了致命性的打擊[3]。

PEDV 是一種正鏈單股RNA 病毒，基因組全長(zhǎng)約為28 kb[4-6]。PEDV 基因組共編碼蛋白21 種，其中包括4 種結(jié)構(gòu)蛋白（E 蛋白、M 蛋白、N 蛋白及S 蛋白）和16 種非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp1-16 以及一個(gè)輔助蛋白ORF3[7-9]。這些蛋白共同協(xié)調(diào)著病毒的復(fù)制與增值。

Nsp10 是PEDV 編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，由135 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，是一種具有核苷-2-O’-甲基轉(zhuǎn)移酶活性的輔助蛋白[10]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Nsp10 蛋白是一種鋅指結(jié)合蛋白，在冠狀病毒（包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型）中，和鋅螯合的所有氨基酸均比較保守[11]。此外，也有研究表明，SARS-Cov Nsp10 蛋白可以與DNA或單雙鏈RNA 中非特異性的核苷酸結(jié)合并且可通過(guò)與多種蛋白如Nsp1、Nsp7 等相互作用來(lái)參與復(fù)制復(fù)合體的形成[12-13]；SARS-Cov-2 Nsp10 蛋白可以拮抗Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)[14]；MHV Nsp10蛋白可以結(jié)合鋅離子并且在體外與ssDNA、dsDNA、ssRNA 及tRNA 結(jié)合[15]；冠狀病毒的Nsp10 蛋白是一種可以激活多種復(fù)制酶的關(guān)鍵輔助因子，它可以與Nsp14 和Nsp16 相互作用，并調(diào)控它們各自的外顯子和核糖-2’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的活性[16-17]；豬δ 冠狀病毒Nsp10 蛋白以一種不依賴于鋅指結(jié)構(gòu)域的方式拮抗β-干擾素的產(chǎn)生[18]。這些結(jié)果說(shuō)明，對(duì)于冠狀病毒來(lái)說(shuō)Nsp10 蛋白對(duì)基因組和亞基因組RNA 合成以及病毒多聚蛋白的加工有著極其重要的作用[19-20]。

到目前為止，對(duì)于冠狀病毒Nsp10 作用機(jī)制研究的報(bào)道還相對(duì)較少，對(duì)于PEDV Nsp10 蛋白的研究也相對(duì)較少。研究通過(guò)構(gòu)建PEDV Nsp10 基因真核表達(dá)載體，利用免疫印跡技術(shù)（Western Blot）與間接免疫熒光技術(shù)鑒定其表達(dá)及亞細(xì)胞定位情況，為進(jìn)一步探究PEDV Nsp10 蛋白的生物學(xué)功能以及特性奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

IPEC-J2 細(xì)胞由生物技術(shù)中心509 實(shí)驗(yàn)室于-80 ℃凍存復(fù)蘇；小鼠抗Myc 單抗（mAb）、小鼠抗β-actin單抗（mAb）、山羊抗小鼠辣根酶標(biāo)記IgG 以及FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal cattle serum，F(xiàn)BS）和LipofectamineTM2000購(gòu)自英濰捷基（Invitrogen）上海貿(mào)易有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒均購(gòu)于Omega 公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、2×Seamless 無(wú)縫克隆酶、PCR 及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；特異性引物合成及重組質(zhì)粒的序列測(cè)定均由擎科生物（北京）公司完成；病變組織豬小腸由生物技術(shù)中心509 實(shí)驗(yàn)室保存；試驗(yàn)選用的DH5α 感受態(tài)細(xì)胞及所需的pCMV-Myc 載體均由生物技術(shù)中心509 實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)及表達(dá)載體構(gòu)建路線

找出已經(jīng)發(fā)表在NCBI-GeneBank 上的PEDV（NC_003436.1）標(biāo)準(zhǔn)序列作為模板序列，利用primer 5 軟件設(shè)計(jì)PEDV Nsp10 基因的特異性上下游引物，特異性上游引物序列：GCCA TGGAGGCCCGAATTCGGATGGCTGGTAAACAAACAGAACAGGCTAT-3（含EcoR Ⅰ位點(diǎn)），特異性下游引物序列：CGCGGCCGCGGTACCTCGAGATTGCATAATGGAT -CTGTCACAAG TG（含XhoⅠ位點(diǎn)）。利用酶切連接的方式將PEDV Nsp10 基因插入pCMV-Myc 的EcoRⅠ/XhoⅠ位點(diǎn)之間。構(gòu)建以pCMV-Myc 為載體的PEDV Nsp10 蛋白融合表達(dá)載體。

1.3 擴(kuò)增PEDV Nsp10 基因

將病變組織豬小腸用液氮進(jìn)行研磨，將其放于1.5 mL EP 管中，劇烈搖晃1 min 后靜止10 min，加入冰冷的三氯甲烷試劑，快速搖晃20 s。靜止15 min后，在轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1，4 ℃離心機(jī)中離心15 min。離心停止后，取離心管中的上層澄清液于新的EP 管內(nèi)，將600 μL 異丙醇加入裝有上述澄清液的EP 管中，輕輕搖晃15 s，讓兩者混勻，靜止時(shí)間為10 min。隨后4 ℃離心機(jī)中離心10 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1。倒掉上清，向沉淀中加入75%的乙醇（用DEPC 水現(xiàn)配現(xiàn)用）600 μL，靜止10 min。倒掉上清，吹干剩余液體，向EP 管中的沉淀加入20 μL 的DEPC 水助溶，靜止10 min，在-80 ℃冰箱中保存。試驗(yàn)過(guò)程中所用的耗材需要提前用DEPC 水處理，4 ℃離心機(jī)需提前預(yù)冷。

RNA 提取完畢后，加入Oligo（dT）1 μL、Specific Primer 2 μL、DEPC 水2 μL；反應(yīng)條件為70 ℃10 min。向上述管中加入以下試劑混合液，dNTP mix（10 mM）0.5 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、5×M-MLV buffer 2 μL、RNase M-MLV 1 μL、DEPC 水1 μL，總反應(yīng)體系5 μL；將上述液體混勻后放入PCR 儀中，PCR 程序?yàn)椋?0 ℃10 min，42 ℃保溫60 min，70 ℃保溫15 min。以此得到的cDNA 為模板，加入上下游引物各0.2 μL，buffer 3 μL，dNTP 2 μL，PCR 酶0.13 μL，去離子水13.47 μL，總反應(yīng)體系為20 μL；將上述液體混勻后放入PCR 儀中，PEDV Nsp10 基因PCR 程序?yàn)椋?4 ℃10 min；94 ℃45 s，60 ℃45 s，72 ℃1 min（共35 次循環(huán)）；72 ℃10 min。結(jié)束后點(diǎn)樣跑膠，之后切下本試驗(yàn)的目的條帶，利用試劑盒對(duì)目的產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收到的目的片段溶在20 uL 去離子水中-20 ℃冷凍冰箱中保存。

1.4 Nsp10 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將Nsp10 基因片段和pCMV-Myc 載體分別用EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切，試驗(yàn)條件為37 ℃，2 h，利用Omega 試劑盒進(jìn)行膠回收。將切下的DNA 膠用700 μL Binding Buffer 于60 ℃水浴鍋中溶解10 min。將溶解后的混合液體倒入收集柱，于離心機(jī)中12 000 r·min-1離心1min，該過(guò)程重復(fù)一次。隨后棄掉下管液體，向上柱加入300 μL Binding Buffer 將其溶解，12 000 r·min-1離心1 min。棄去下層液體，向上管中加入700 μL Wash Buffer，12 000 r·min-1離心1 min。丟棄下管液體13 700 r·min-1空離2 min。離心后向上管加入30 μL 已經(jīng)加熱到60 ℃左右的去離子水，靜止溶解5 min 后13 700 r·min-1離心2 min，得到純化的基因片段和載體片段。將上述兩種純化所得到產(chǎn)物，加入2×Seamless 無(wú)縫克隆酶及去離子水，總體系為10 μL，于PCR 儀中50 ℃15 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化涂板，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。挑取大小飽滿的單一菌落，于37 ℃搖床培養(yǎng)10-12 h 后，提取質(zhì)粒。經(jīng)PCR 和雙酶切鑒定成功后，于-20 ℃保存。取出10 μL 質(zhì)粒送至公司進(jìn)行測(cè)序，將正確質(zhì)粒命名為pCMV-Myc-Nsp10。

1.5 Western Blot 檢測(cè)

將IPEC-J2 細(xì)胞均勻鋪在24 孔板中，待細(xì)胞密度長(zhǎng)到80 %左右時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，步驟如下：用Lipofectin2000分別將pCMV-Myc 和pCMV-Myc-Nsp10 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞板于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)6 h 以后，將原24 孔板中的DMEM 換為10% FBS，繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后，收取蛋白樣品。收樣：PBS 輕輕清洗細(xì)胞2～3 次后，每孔加入30～50 μL RIPA 裂解液裂解細(xì)胞半個(gè)小時(shí)，該過(guò)程需要在4 ℃低溫下進(jìn)行，用槍頭刮取細(xì)胞，4 ℃離心機(jī)12 000 g 離心10 min，吸取上清裂解液至新的EP 管中。加入5×Loading Buffer，100 ℃沸水浴煮樣10 min，隨后12 000 g 離心10 min。跑膠：配膠，等待膠凝固以后，組裝膠和電泳槽，在確定不漏的情況下倒入1×SDS 電泳液，插上電極，分離蛋白樣品；轉(zhuǎn)膜：將膠板撬開(kāi)，按照條帶大小切下對(duì)應(yīng)膠條，組裝轉(zhuǎn)膜裝置，用PVDF 膜吸附蛋白，冰水混合物中轉(zhuǎn)膜電壓200 V，電流240 A，時(shí)間為2 h。封閉：取10 mL 1×TBST，向里面添加0.5 g 脫脂奶粉。將PVDF 膜放入混勻后的封閉液中，搖床封閉孵育2 h。結(jié)束后用1×TBST 溶液洗膜2 h，期間需要更換1×TBST。孵育抗體：用鼠源β-actin 單抗（1∶1 000）、鼠源Myc 單抗（1∶1 000）作為一抗，山羊抗小鼠辣根酶標(biāo)記IgG（1∶1 000）作為二抗各孵育2 h，每次孵育結(jié)束后需用1×TBST 溶液洗膜2 h，洗膜時(shí)間，每次15 min；每次洗膜均在搖床上進(jìn)行。曝光：用AI600 儀器曝光，保存結(jié)果圖片。

1.6 間接免疫熒光

細(xì)胞傳代爬片，待細(xì)胞密度長(zhǎng)到60%左右時(shí)，用Lipofectin2000分別將pCMV-Myc 和pCMV-Myc-Nsp10 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至IPEC-J2 細(xì)胞中，于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6 h 后將DMEM 更換為10% FBS。繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后，吸棄上層細(xì)胞培養(yǎng)基，之后用滅菌后的PBS 洗細(xì)胞2 次，每孔加入500 μL 4%的多聚甲醛，室溫固定20 min；PBS 洗細(xì)胞共3 次，15 min·次-1。加入0.1% Triton X-100，室溫透膜20 min；PBS 清洗細(xì)胞3 次，15 min·次-1；加入5% BSA 封閉2 h（5% BSA需要現(xiàn)用現(xiàn)配），用鼠源Myc 單克隆抗體（1：500）作為一抗孵育1 h；PBS 洗3 次；加入熒光素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶500）作為二抗室溫避光孵育2 h；孵育結(jié)束后PBS 洗3 次。最后取干凈且滅菌后的載玻片，滴少量的封片劑，用針頭挑出爬片，將帶有細(xì)胞的面放在封片劑上，用紙巾輕輕將多余的液體吸干，壓緊，再將指甲油均勻涂抹在爬片周圍，阻止細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞中。將載玻片在避光處晾干，待片子干燥后用熒光顯微鏡觀察拍照，并保存圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nsp10 基因片段的PCR 擴(kuò)增

在研究中，利用設(shè)計(jì)的PEDV Nsp10 的特異性上、下游引物對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳后在大約在400 bp 處出現(xiàn)目標(biāo)條帶，即為特異的Nsp10 基因片段，結(jié)果如圖1 所示。

2.2 真核表達(dá)載體pCMV-Myc 的雙酶切

通過(guò)借助pCMV-Myc 真核表達(dá)載體連接目的基因來(lái)完成重組質(zhì)粒的構(gòu)建，需對(duì)兩者產(chǎn)生相同的酶切位點(diǎn)，借助EcoRⅠ與XhoⅠ對(duì)上述兩種基因同時(shí)進(jìn)行雙酶切。結(jié)果如圖2 所示，目的基因與載體雙酶切成功。

圖2 Nsp10 基因片段與pCMV-Myc 載體的雙酶切Fig.2 Double enzyme digestion of Nsp10 gene fragment and pCMV-Myc vector

2.3 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp10 的PCR 鑒定

利用無(wú)縫克隆酶2×Seamless 將目的基因和載體的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp10。利用PCR 的方法對(duì)所得的重組質(zhì)粒進(jìn)行初步鑒定，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)在400 bp 附近處出現(xiàn)目標(biāo)條帶，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp10 的PCR 鑒定Fig.3 PCR Identification of recombinant plasmid pCMV-Myc-Nsp10

2.4 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp10 的雙酶切鑒定

為了鑒定重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp10 是否構(gòu)建成功，將質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，加入EcoRⅠ酶，XhoⅠ酶，Buffer，去離子水，總體系10 μL 置于37 ℃水浴鍋中2 h。雙酶切產(chǎn)物電泳后在3 000 bp 和405 bp左右處出現(xiàn)兩條條帶，條帶大小與理論大小相符，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp10 的雙酶切分析Fig.4 Double enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pCMV-Myc-Nsp10

2.5 重組表達(dá)載體序列比對(duì)

為了鑒定重組質(zhì)粒序列與NCBI 公布的Nsp10基因序列的同源性，取10 μL 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp10，送至擎科生物（北京）公司進(jìn)行測(cè)序，將NCBI網(wǎng)站上公布的PEDV Nsp10 原始序列與所得到的重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了多序列比對(duì)，結(jié)果如圖5 所示其同源性高達(dá)99%。

圖5 pCMV-Myc-Nsp10 與CV777 毒株序列比對(duì)Fig.5 Sequence alignment between pCMV-Myc-Nsp10 and CV777 strains

2.6 重組表達(dá)載體在細(xì)胞中的分布

研究主要以間接免疫熒光技術(shù)探究了pCMVMyc-Nsp10 在IPEC-J2 細(xì)胞中的分布情況以及定位的情況。免疫熒光結(jié)果顯示，重組表達(dá)載體pCMVMyc-Nsp10 質(zhì)粒在IPEC-J2 細(xì)胞中成功表達(dá)，大部分分布在細(xì)胞質(zhì)中少數(shù)分布在細(xì)胞核，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 Nsp10 蛋白在IPEC J2 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.6 Expression of Nsp10 protein in IPEC-J2 cells

2.7 Western Blot 檢測(cè)IPEC-J2 細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白

為了確定重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp10 在IPECJ2 細(xì)胞中的表達(dá)情況，先后利用小鼠抗Myc 標(biāo)簽單抗及FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗對(duì)空載體pCMVMyc 及重組表達(dá)載體pCMV-Myc-Nsp10 進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)，其結(jié)果顯示，重組pCMV-Myc-Nsp10在IPEC-J2 細(xì)胞中成功表達(dá)，結(jié)果如圖7。

圖7 Western Blot 鑒定蛋白融合表達(dá)Fig.7 Western Blot Determination of fusion protein expression

3 討論

PEDV 是引起豬流行性腹瀉的一種單股正鏈RNA 病毒，該病毒能引起不同年齡段的豬出現(xiàn)厭食、腹瀉、脫水，并引起不同年齡段的哺乳仔豬大量死亡，死亡率高達(dá)百分之九十以上[21]。豬流行性腹瀉首次爆發(fā)于英國(guó)，2010 年在我國(guó)大規(guī)模的爆發(fā)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了前所未有的打擊[22]。當(dāng)PEDV 感染豬小腸上皮（IPEC-J2）細(xì)胞后，會(huì)破壞機(jī)體的免疫系統(tǒng)，并調(diào)控先天免疫應(yīng)答，從而引起細(xì)胞損傷[23]。

在PEDV 全基因組中，除5’端帽子和3’端poly（A）尾等結(jié)構(gòu)，還包含5’非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)構(gòu)、七個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF1a，ORF1b 和ORF2-6）和3’非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)構(gòu)[24-25]。其中，兩個(gè)較大的開(kāi)放閱讀框ORF1a 和ORF1b 占據(jù)了PEDV 全基因組將近三分之二的部分，用來(lái)編碼基因組的非結(jié)構(gòu)蛋白（Nonstructural proteins，Nsps），即Nsp1-Nsp16，這些非結(jié)構(gòu)蛋白不僅調(diào)控著各種病毒復(fù)制相關(guān)的酶活性，而且對(duì)宿主免疫系統(tǒng)也有著一定的影響[26]。

在這些非結(jié)構(gòu)蛋白中，有很多具有酶活性的重要蛋白，這些蛋白是保證PEDV 復(fù)制的主要關(guān)鍵酶[27]。例如：Nsp11、Nsp12、Nsp13、Nsp14 和Nsp15 等。其他的非結(jié)構(gòu)蛋白分別在病毒的成熟、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、復(fù)制、代謝和出芽等方面都有一定的作用效果，但是還未見(jiàn)有研究報(bào)道其具體地作用機(jī)制[28]。有研究報(bào)道，PDCov 的Nsp10 蛋白可以以不依賴于其鋅指結(jié)構(gòu)域的方式拮抗β 干擾素的產(chǎn)生[29]；冠狀病毒Nsp10/Nsp16 甲基轉(zhuǎn)移酶可被Nsp10 衍生肽靶向以減少病毒的復(fù)制和發(fā)病機(jī)制[30]。但目前關(guān)于PEDV 以及其編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp10 的表達(dá)及生物學(xué)功能研究的試驗(yàn)或者文獻(xiàn)相對(duì)較少。所以，探究PEDV Nsp10 蛋白在調(diào)控病毒復(fù)制或影響細(xì)胞免疫方面具有重要的意義。因此，PEDV Nsp10 重組質(zhì)粒的構(gòu)建為后續(xù)研究其在PEDV 復(fù)制過(guò)程中具有重要的作用。

4 結(jié)論

研究主要利用RT-PCR 的方法，擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為405 bp 的PEDV Nsp10 基因，與GenBank 上已經(jīng)公布的PEDV Nsp10 基因序列的同源性高達(dá)99%。隨后，將PEDV Nsp10 基因插入到pCMV-Myc 表達(dá)載體中，成功構(gòu)建了pCMV-Myc-Nsp10 重組表達(dá)載體。試驗(yàn)為后續(xù)研究關(guān)于PEDV Nsp10 蛋白的生物學(xué)功能和其在抗病毒反應(yīng)中所發(fā)揮的作用等方面奠定了研究基礎(chǔ)。