菜用大豆有機(jī)酸的全基因組關(guān)聯(lián)分析

劉 慧,許文靜,楊 碩,張 威,張紅梅,劉曉慶,朱月林,陳華濤

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所,江蘇 南京 210014)

菜用大豆(Glycinemax(L.)Merr.)又稱毛豆、鮮食大豆,是指在R6(鼓粒盛期)—R7(初熟期)生育期間采青食用的大豆專用型品種[1]。我國(guó)作為世界上最大的菜用大豆出口國(guó),雖然菜用大豆產(chǎn)業(yè)已得到快速的發(fā)展,但有關(guān)菜用大豆食味品質(zhì)的研究還有待進(jìn)一步加強(qiáng),這制約了優(yōu)質(zhì)菜用大豆產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展,因此,食味品質(zhì)的相關(guān)研究已成為菜用大豆改良育種方向之一。鮮食風(fēng)味是菜用大豆食味品質(zhì)的關(guān)鍵因素,其形成與有機(jī)酸有著密切的關(guān)聯(lián)。有機(jī)酸作為多種氨基酸生物合成的底物,有利于籽粒中氨基酸的積累從而提高菜用大豆的鮮味[2]。Sowalsky等[3]的研究結(jié)果表明,酒石酸、蘋果酸和檸檬酸與澀味之間存在一定的聯(lián)系,并且產(chǎn)生的酸味強(qiáng)度具有差異性。因此,不同種類的有機(jī)酸有其獨(dú)特的風(fēng)味特征。檸檬酸產(chǎn)生酸感快且酸度高于蘋果酸,但后味時(shí)間短;酒石酸略有澀感,酸味爽口;蘋果酸酸味爽口,微有澀苦,呈味時(shí)間長(zhǎng),食用適量可給人清爽之感[4],其他有機(jī)酸如奎寧酸則主要產(chǎn)生苦味。有機(jī)酸不僅能影響菜用大豆的苦味、澀味、酸味,還能通過(guò)掩蓋糖的味道來(lái)影響甜味,Green等[5]的研究發(fā)現(xiàn),檸檬酸可以掩蓋味覺細(xì)胞對(duì)于果糖和蔗糖的感知,而毛岳忠[6]研究發(fā)現(xiàn),蘋果酸能增強(qiáng)味覺細(xì)胞對(duì)于蔗糖的感知。菜用大豆籽粒中有機(jī)酸的種類、含量及其構(gòu)成比例是菜用大豆鮮食風(fēng)味形成的重要基礎(chǔ),因此,檢測(cè)菜用大豆的有機(jī)酸成分分布,研究有機(jī)酸合成機(jī)制對(duì)于菜用大豆的品質(zhì)改良具有重要的實(shí)際意義。

數(shù)量性狀的研究對(duì)于農(nóng)作物的遺傳改良具有重要的實(shí)際意義,在不同的植物中已報(bào)道了許多與有機(jī)酸含量相關(guān)的QTLs。Liebhard等[7]研究表明,蘋果果實(shí)中可滴定酸含量的變化幾乎完全可以由8,16號(hào)連鎖群上的2個(gè)主效QTL位點(diǎn)決定,分別能夠解釋后代中酸度表型變異的46%,42%,其中位于第16連鎖群上的主效基因位置與Maliepaard等[8]報(bào)道的結(jié)果相一致。菜用大豆中的酸含量屬于多個(gè)基因協(xié)同控制的數(shù)量性狀,但截至目前,有關(guān)菜用大豆酸含量調(diào)控機(jī)理的研究相對(duì)滯后,與菜用大豆有機(jī)酸含量相關(guān)的SNPs及候選基因有待發(fā)掘。與傳統(tǒng)的連鎖定位方法相比,全基因組關(guān)聯(lián)分析法(Genome wide association study,GWAS)節(jié)省了構(gòu)建群體的時(shí)間,能夠?qū)Σ煌N質(zhì)進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析,提高QTL定位的精準(zhǔn)性,已經(jīng)成為快速有效的發(fā)掘植物數(shù)量性狀基因的重要手段[9-10]。本研究以含有264份菜用大豆種質(zhì)資源的自然群體為試驗(yàn)材料,分別在2020,2021年通過(guò)高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定酒石酸、蘋果酸和檸檬酸含量,結(jié)合GWAS鑒定與有機(jī)酸顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)并進(jìn)一步挖掘相應(yīng)的候選基因,旨在初步解析菜用大豆有機(jī)酸含量的遺傳學(xué)基礎(chǔ),為調(diào)控菜用大豆有機(jī)酸含量的分子機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

264份菜用大豆種質(zhì)資源,包括212份栽培種及52份地方種,均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所大豆課題組提供。分別于2020年6月和2021年6月種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南京市六合基地試驗(yàn)田(32°28′12″N,118°37′48″E)。田間試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì),3次重復(fù)。每份材料重復(fù)種植3壟,每壟播種10穴,每穴2株苗,壟長(zhǎng)為1.5 m,壟間距40 cm,穴距15 cm。田間管理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)方法進(jìn)行。

1.2 儀器與試劑

植物組織研磨儀;高效液相色譜儀Agilent1100;Aglient ZORBAX SB-Aq色譜柱;超聲波振蕩儀;可見分光光度(UV-2600,日本島津);超純水機(jī);ML204型萬(wàn)分之一天平;酸度計(jì)、離心機(jī)、水浴鍋、烘箱及其他實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

甲醇(色譜純);磷酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥85.0%);蘋果酸、酒石酸、檸檬酸(色譜級(jí)純分析標(biāo)準(zhǔn)品),以上試劑均購(gòu)自上海阿拉丁生物科技有限公司。

1.3 菜用大豆有機(jī)酸檢測(cè)

1.3.1 色譜條件 色譜柱:Aglient ZORBAX SB-Aq C18柱(粒徑5 μm,柱長(zhǎng)250 mm×4.5 mm);流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸水溶液(pH=2.30),梯度洗脫;流速0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)212 nm;色譜柱溫度30 ℃;進(jìn)樣量體積10 μL。流動(dòng)相洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相洗脫條件

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制 精密稱取酒石酸、蘋果酸各50 mg,檸檬酸10 mg(精確至0.1 mg),用流動(dòng)相溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中。配制成酒石酸、蘋果酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,質(zhì)量濃度分別為5 000,5 000,1 000 mg/L。

1.3.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 以1.3.2中的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液為母液,共配制5種不同濃度梯度混標(biāo)溶液。其中蘋果酸和酒石酸濃度分別為5,50,200,1 000,5 000 mg/L,檸檬酸濃度分別為1,10,40,200,1 000 mg/L。以上溶液均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后,按照1.3.1的色譜檢測(cè)條件,利用高效液相色譜儀分析后,以濃度x(mg/L)對(duì)色譜峰峰面積y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算回歸方程。

1.3.4 有機(jī)酸提取方法 根據(jù)蓋鈞鎰等[11]的報(bào)道,菜用大豆最適宜的采收期為R6期,因此,本試驗(yàn)選擇R6期(鼓粒盛期)即鮮莢翠綠,籽粒飽滿時(shí)進(jìn)行取樣,設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。將收取的鮮莢放入烘箱先105 ℃殺青30 min,然后以80 ℃烘干至恒質(zhì)量,取出干籽粒放入植物組織研磨儀中(40 Hz,2 min)研磨至粉末備用。菜用大豆干籽粒粉末過(guò)0.45 mm篩,稱取粉末1 g(精確至0.000 1 g),置于50 mL量瓶中,加入40 ℃蒸餾水約40 mL,40 ℃下超聲提30 min,冷卻至室溫,定容,混勻。在4 000 r/min下離心20 min,取上清液1 mL,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾,超聲脫氣后,供分析用。

1.3.5 HPLC分析菜用大豆有機(jī)酸 按照1.3.1的色譜檢測(cè)條件,從同一菜用大豆樣品中平行取3份進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),根據(jù)標(biāo)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析計(jì)算菜用大豆樣品中各有機(jī)酸組分的質(zhì)量濃度,取3次進(jìn)樣測(cè)得的平均值作為菜用大豆有機(jī)酸組分最終的檢測(cè)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各有機(jī)酸含量數(shù)據(jù)采用Excel 2019計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù),應(yīng)用SPSS(IBM SPSS Statistics 26.0,SPPS,USA)軟件分別對(duì)酒石酸、蘋果酸和檸檬酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5 全基因組關(guān)聯(lián)分析

本研究中,用于全基因組關(guān)聯(lián)分析的自然群體SNP標(biāo)記來(lái)自前期的重測(cè)序工作,共2 597 425個(gè),該群體的連鎖不平衡衰減區(qū)間為120 kb,具體群體結(jié)構(gòu)分析見江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院豆類作物研究室的研究報(bào)道[12],采用基于群體結(jié)構(gòu)(Q)+親緣關(guān)系(K)的混合線性模型(Mixed linear model,MLM)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析以控制假陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。全基因組關(guān)聯(lián)分析采用基于R軟件的GAPIT算法包進(jìn)行計(jì)算[13],設(shè)定-log10(P)=5.0作為顯著閾值,當(dāng)關(guān)聯(lián)到的SNP閾值≥5.0時(shí),則被認(rèn)為是顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

1.6 候選基因分析

全基因組關(guān)聯(lián)分析得到2個(gè)不同的環(huán)境下(2020,2021年)檢測(cè)到的顯著SNP位點(diǎn)后,挑選出其上下游120 kb區(qū)間范圍內(nèi)所有的基因。參照在線數(shù)據(jù)庫(kù)Phytozome 13網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中的大豆基因組注釋信息確定目標(biāo)性狀的候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC色譜分析

在1.3.1的色譜檢測(cè)條件下,采用HPLC法分離并檢測(cè)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品和菜用大豆籽粒樣品中的酒石酸、蘋果酸和檸檬酸,可以清晰地將3種有機(jī)酸分離出來(lái),且峰型良好,洗脫順序分別為酒石酸、蘋果酸、檸檬酸,平均保留時(shí)間分別為4.316,5.410,9.868 min(圖1)。

1.酒石酸;2.蘋果酸;3.檸檬酸。

2.2 菜用大豆3種有機(jī)酸組分線性回歸方程

分別將不同濃度梯度的3種有機(jī)酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)高效液相色譜儀分析后,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸分析。計(jì)算得到酒石酸、蘋果酸和檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程(表2)。3種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和質(zhì)量濃度的相關(guān)系數(shù)為0.997 9～0.999 1,在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,根據(jù)信噪比確定的定量限(RSN=10)為2.5～10 μg/mL。

表2 菜用大豆3種有機(jī)酸組分線性回歸方程

2.3 表型分析

菜用大豆3種有機(jī)酸含量的描述性統(tǒng)計(jì)分析(表3)顯示,2020,2021年供試群體的酒石酸含量分別為1.66～9.19 mg/g,0.48～13.52 mg/g,平均含量分別為4.13,4.16 mg/g;蘋果酸含量分別為1.47～36.46 mg/g,1.89～25.19 mg/g,平均含量分別為7.26,8.99 mg/g;檸檬酸含量分別為2.56～12.05 mg/g,1.54～18.31 mg/g,平均含量分別為7.12,10.88 mg/g。上述結(jié)果均表明,供試群體有機(jī)酸含量差異較大,種質(zhì)資源遺傳變異豐富,為特異種質(zhì)的篩選提供了有利條件。

表3 菜用大豆3種有機(jī)酸含量的描述性統(tǒng)計(jì)分析

2020年菜用大豆酒石酸、蘋果酸和檸檬酸變異系數(shù)分別為31.25%,67.29%,19.22%,2021年3種有機(jī)酸變異系數(shù)分別為52.07%,47.07%,26.35%,且3種有機(jī)酸組分中檸檬酸變異系數(shù)最低。遺傳變異系數(shù)能夠體現(xiàn)各性狀的變異豐富度,一般來(lái)說(shuō),當(dāng)變異系數(shù)大于10%時(shí),可以認(rèn)為種質(zhì)間差異較大,且變異系數(shù)越大,表明該性狀的變異潛力越豐富。2 a中3種有機(jī)酸的變異系數(shù)均大于10%,反映出供試群體不同品種間有機(jī)酸各組分存在豐富的變異,這些遺傳變異的存在可為菜用大豆食味品質(zhì)的改良提供廣泛的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

2.4 相關(guān)性分析

本研究對(duì)264份材料酒石酸、蘋果酸、檸檬酸含量在2020,2021年2 a間進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果表明,264份材料檸檬酸含量在2020,2021年,2 a間呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.156*(表4)。同時(shí),基于供試群體3種有機(jī)酸2 a表型數(shù)據(jù)的平均值,對(duì)不同有機(jī)酸組分含量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),酒石酸含量與蘋果酸、檸檬酸含量間均存在顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.695*,0.739*,蘋果酸含量與檸檬酸含量也有著顯著的正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.790*(表5)。

表4 264份材料酒石酸、蘋果酸、檸檬酸含量在2020,2021年2 a的相關(guān)系數(shù)

表5 菜用大豆3種有機(jī)酸組分相關(guān)性分析

2.5 菜用大豆3種有機(jī)酸組分含量特異種質(zhì)篩選

基于供試群體3種有機(jī)酸含量,分別對(duì)每種有機(jī)酸篩選出2份高含量的特異種質(zhì)。將264份菜用大豆種質(zhì)資源按照酒石酸含量由高到低排序,并將位于前15%的品種劃分為高酒石酸含量組(Tartaric acid high content group,T1),在2020,2021年的檢測(cè)中均屬于T1組的種質(zhì)為阜04-35和桂春豆112(表6)。同理,將供試群體按照蘋果酸含量由高到低排序,并將前15%的品種劃分為高蘋果酸含量組(Malic acid high content group,M1),2 a中均屬于M1組的種質(zhì)包括華春9號(hào)和邯12-204(表7);將供試群體按照檸檬酸含量由高到低排序,前15%的品種被劃分為高檸檬酸含量組(Citric acid high content group,C1),2 a中均屬于C1組的種質(zhì)有灌豆3號(hào)和新沂大紫花(表8)。以上篩選到的種質(zhì),進(jìn)一步豐富了我國(guó)菜用大豆有機(jī)酸含量特異種質(zhì)資源。

表6 2 a的檢測(cè)中均篩選到的高酒石酸含量的特異種質(zhì)

表7 2 a的檢測(cè)中均篩選到的高蘋果酸含量的特異種質(zhì)

2.6 菜用大豆酒石酸、蘋果酸和檸檬酸含量GWAS分析

為了深入研究菜用大豆有機(jī)酸含量的遺傳機(jī)制,利用MLM模型對(duì)2020,2021年的酒石酸、蘋果酸和檸檬酸含量表型值進(jìn)行GWAS分析(圖2,3),設(shè)定顯著閾值為-log10(P)= 5.0,如表9所示,2020年檢測(cè)到與酒石酸顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)31個(gè),每個(gè)SNP解釋了7.99%～11.23%的表型變異;2021年檢測(cè)到與酒石酸顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)23個(gè),每個(gè)SNP解釋了7.00%～10.62%的表型變異。2020年檢測(cè)到與蘋果酸顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)169個(gè),每個(gè)SNP解釋了7.39%～24.66%的表型變異;2021年檢測(cè)到與蘋果酸顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)20個(gè),每個(gè)SNP解釋了7.30%～9.05%的表型變異。在2020年并沒有檢測(cè)到與檸檬酸顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn),2021年檢測(cè)到與檸檬酸顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)43個(gè),分別位于2,6,13號(hào)染色體上,單個(gè)SNP的表型變異解釋率為8.06%～10.96%。上述結(jié)果表明,菜用大豆籽粒中有機(jī)酸含量是由多基因控制的。

A、B和C分別是酒石酸、蘋果酸和檸檬酸的GWAS結(jié)果。圖3同。

表9 3種有機(jī)酸組分顯著相關(guān)SNPs分布

2.7 菜用大豆3種有機(jī)酸組分相關(guān)候選基因挖掘

為了研究顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)等位變異的表型效應(yīng),分別對(duì)2020,2021年中酒石酸、蘋果酸和檸檬酸檢測(cè)到的閾值最高的顯著SNP位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析。發(fā)現(xiàn)SNP S02_1376279堿基變化為A至T,攜有SNP S02_1376279-A的菜用大豆種質(zhì)的酒石酸平均含量為4.01 mg/g,顯著低于基因型S02_1376279-T的菜用大豆種質(zhì)的6.40 mg/g(圖4-A)。S19_44610972的等位變異為C/T,攜有SNP S19_44610972-C的菜用大豆種質(zhì)的蘋果酸平均含量為6.52 mg/g,顯著低于基因型S19_44610972-T的菜用大豆種質(zhì)的19.52 mg/g(圖4-B)。S17_41027045的等位變異為T/A,攜有S17_41027045-T的菜用大豆種質(zhì)的酒石酸平均含量要顯著低于攜有S17_41027045-A的菜用大豆種質(zhì)的酒石酸平均含量(圖4-C)。S13_25565436和S06_6589288的等位變異均為G/A,攜有S13_25565436-G的菜用大豆種質(zhì)的蘋果酸平均含量要顯著低于攜有S13_25565436-A的菜用大豆種質(zhì),而攜有S06_6589288-G的菜用大豆種質(zhì)的檸檬酸平均含量顯著高于攜有S06_6589288-A的菜用大豆種質(zhì)(圖4-D、E)。

同一圖中不同小寫字母表示在0.05水平下差異顯著。

在檢測(cè)到的與3種有機(jī)酸顯著關(guān)聯(lián)(-log10(P)≥ 5.0)的SNP位點(diǎn)上下游120 kb范圍內(nèi)進(jìn)行候選基因的篩選及功能預(yù)測(cè)。參照大豆參考基因組的基因功能注釋信息,鑒定到8個(gè)與有機(jī)酸含量顯著相關(guān)的候選基因(表10),這些基因可能參與菜用大豆籽粒中有機(jī)酸的調(diào)控和積累,作為重要候選基因進(jìn)一步分析。共挖掘到3個(gè)與酒石酸含量顯著相關(guān)的候選基因,其中,定位于Chr.02上的基因Glyma.02G015700和Glyma.02G015800分別編碼延胡索酸酶1(Fumarase 1,FUM1)和延胡索酸酶2(Fumarase 2,FUM2);定位于Chr.13上的基因Glyma.13G077800編碼結(jié)節(jié)蛋白MTN21/EAMA樣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族蛋白。此外,挖掘到5個(gè)與蘋果酸含量顯著相關(guān)的候選基因,其中,定位于Chr.05上的基因Glyma.05G112700編碼鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白12(Aluminum-activated malate transporters 12,ALMT12);定位于Chr.16上的基因Glyma.16G176000和Glyma.16G176100分別編碼UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶88A1(UDP-glucosyl transferase 88A1,UGT88A1)和SPX(SYG1/PHO81/XPR1)結(jié)構(gòu)域蛋白;定位于Chr.19上的基因Glyma.19G188600和Glyma.19G189100分別編碼真核天冬氨酸蛋白酶家族蛋白和泛素蛋白連接酶7(Ubiquitin-protein ligase 7,UPL7)。

3 結(jié)論與討論

有機(jī)酸作為菜用大豆中重要的風(fēng)味物質(zhì),對(duì)菜用大豆風(fēng)味的形成具有顯著的影響。目前,有機(jī)酸含量的檢測(cè)通常采用酸堿滴定法、離子色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。其中,高效液相色譜法可同時(shí)定量測(cè)定多種有機(jī)酸,且操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好,因此,被越來(lái)越多的利用于有機(jī)酸快速檢測(cè)領(lǐng)域。本研究對(duì)264份菜用大豆種質(zhì)資源進(jìn)行有機(jī)酸含量測(cè)定,2020,2021年供試群體酒石酸含量分別為1.66～9.19 mg/g,0.48～13.52 mg/g,平均含量分別為4.13,4.16 mg/g;2020,2021年菜用大豆自然群體蘋果酸含量分別為1.47～36.46 mg/g,1.89～25.19 mg/g,平均含量分別為7.26,8.99 mg/g;2020,2021年菜用大豆自然群體檸檬酸含量分別為2.56～12.05 mg/g,1.54～18.31 mg/g,平均含量分別為7.12,10.88 mg/g。2021年菜用大豆籽粒中3種有機(jī)酸平均含量最高的是檸檬酸,其次是蘋果酸,這與Song等[14],Hu等[2]及張玉梅等[15]的研究結(jié)果一致。2 a中3種有機(jī)酸變異系數(shù)均大于10%,變異分析結(jié)果表明,供試菜用大豆種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富,有機(jī)酸含量存在非常廣泛的表型變異,具有很大的遺傳改良潛力。在此基礎(chǔ)上篩選出6份高有機(jī)酸含量的特異種質(zhì)資源,其中在2020,2021的檢測(cè)中均屬于高酒石酸含量組的種質(zhì)為阜04-35和桂春豆112;2 a中均屬于高蘋果酸含量組的種質(zhì)為華春9號(hào)和邯12-204;2 a中均屬于高檸檬酸含量組的種質(zhì)為灌豆3號(hào)和新沂大紫花,以上鑒定到的種質(zhì)為菜用大豆有機(jī)酸品種改良育種提供優(yōu)秀的材料。

基于MLM模型的全基因組關(guān)聯(lián)分析2 a中共檢測(cè)到了54個(gè)與酒石酸顯著相關(guān)的SNP,189個(gè)與蘋果酸顯著相關(guān)的SNP以及43個(gè)與檸檬酸顯著相關(guān)的SNP。但在2 a中3種有機(jī)酸均未鑒定到共同顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn),這可能是因?yàn)橛袡C(jī)酸是典型的數(shù)量性狀,由多基因控制,含量極易受環(huán)境條件等因素的影響,因此,即便使用相同的自然群體,在不同環(huán)境條件下檢測(cè)到一系列不同的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的情況也是存在的[16]。此外,Hu等[2]在菜用大豆的籽粒中共鑒定出36種有機(jī)酸,其中含量最高的5種有機(jī)酸分別為檸檬酸、丁二酸、富馬酸、蘋果酸和草酰乙酸,本研究?jī)H測(cè)定了酒石酸、蘋果酸和檸檬酸這3種有機(jī)酸,而含量較高的丁二酸、富馬酸還未進(jìn)行研究,如果丁二酸和富馬酸在年份之間有很大的變動(dòng),勢(shì)必會(huì)引起其他有機(jī)酸的變化,從而會(huì)導(dǎo)致共定位的難度增大。因此,后續(xù)研究的重點(diǎn)一方面可以增加研究有機(jī)酸的種類,另一方面通過(guò)多年多點(diǎn)的不同環(huán)境試驗(yàn),對(duì)菜用大豆自然群體有機(jī)酸含量進(jìn)行檢測(cè),以期獲得更加可靠的顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn),使有機(jī)酸遺傳標(biāo)記的開發(fā)和候選基因的發(fā)掘更加精確。以顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)上下游120 kb范圍內(nèi)的基因?yàn)楹蜻x基因,根據(jù)基因功能注釋信息,共鑒定到3個(gè)與酒石酸含量顯著相關(guān)的候選基因及5個(gè)與蘋果酸含量顯著相關(guān)的候選基因。其中,Glyma.05G112700在擬南芥中的同源基因?yàn)锳tALMT12,編碼鋁激活蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白12。在不同物種中均證實(shí)了ALMT家族基因能介導(dǎo)植物中蘋果酸的轉(zhuǎn)運(yùn),且參與果實(shí)中的蘋果酸含量的調(diào)控,在果實(shí)酸化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[17-19],然而,對(duì)于該家族基因在菜用大豆中的功能及其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。前人研究表明擬南芥中的AtALMT12調(diào)控蘋果酸的運(yùn)輸,并且參與調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)[20],由此推測(cè)菜用大豆中的Glyma.05G112700基因可能與其具有相似的功能,與菜用大豆中蘋果酸的含量具有相關(guān)性,但其調(diào)控機(jī)理還需進(jìn)一步研究。綜上所述,本試驗(yàn)結(jié)果可以為今后研究菜用大豆有機(jī)酸的基因位點(diǎn)提供參考依據(jù),同時(shí)為候選基因的功能研究奠定基礎(chǔ),進(jìn)而為菜用大豆育種提供參考借鑒。