牛circMYH8的鑒定及其調(diào)控牛肌原代細(xì)胞增殖的功能探究

岳炳霖,楊友抓拉母,冉宏標(biāo),王 會(huì),蔡 欣,王嘉博,柴志欣,彭 巍,舒 適,付長(zhǎng)其,王國(guó)文,鐘金城

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041;2.青海大學(xué) 青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海 西寧 810016)

骨骼肌是哺乳動(dòng)物最大的組織,約占總體質(zhì)量的40%,維持著機(jī)體新陳代謝、呼吸和運(yùn)動(dòng)等基本功能[1-3]。脊椎動(dòng)物的骨骼肌主要來(lái)源于中胚層生皮肌節(jié),由生肌祖細(xì)胞經(jīng)增殖分化形成梭形單核成肌細(xì)胞,而后向肌肉形成部位遷移,經(jīng)過(guò)一系列的增殖、分化和融合過(guò)程最終形成成熟肌纖維,另有一部分成肌細(xì)胞不發(fā)生融合形成衛(wèi)星細(xì)胞用于損傷肌肉的再生[4]。脊椎動(dòng)物骨骼肌纖維在胎兒期就已保持?jǐn)?shù)目恒定,出生后主要通過(guò)肌纖維的肥大增加肌肉量[5]。牛骨骼肌原代細(xì)胞是從出生前牛背最長(zhǎng)肌組織中分離的,作為一種體外模型細(xì)胞,可用于研究早期牛骨骼肌的增殖過(guò)程。

骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程,對(duì)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究一直是分子遺傳領(lǐng)域的熱點(diǎn)。隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展,圍繞骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的功能鑒定及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究已取得大量的成果[6]。近年來(lái),非編碼RNA研究逐漸興起,其對(duì)骨骼肌發(fā)育的調(diào)控也成為研究熱點(diǎn)。環(huán)狀RNA是由一類(lèi)不具有5′末端帽子和3′末端poly(A)尾,以共價(jià)鍵形成環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)的非編碼RNA,與線(xiàn)性mRNA相比,環(huán)狀RNA共價(jià)閉合的結(jié)構(gòu)使其不易被核酸外切酶RNase R降解,具有更高的穩(wěn)定性[7]。根據(jù)環(huán)狀RNA的起源,其主要被分為四類(lèi):外顯子環(huán)狀RNA、外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA、內(nèi)含子環(huán)狀RNA以及基因間環(huán)狀RNA[8]。環(huán)狀RNA是一種反向剪接的產(chǎn)物,具有時(shí)空特異性及組織細(xì)胞特異性。大量的研究證實(shí)環(huán)狀RNA廣泛參與調(diào)控動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,其中涉及最為廣泛的是環(huán)狀RNA作為miRNA的分子海綿的ceRNA調(diào)控,此外,環(huán)狀RNA可以和功能蛋白結(jié)合參與剪接調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀(guān)遺傳修飾以及蛋白翻譯調(diào)控[9]。circMYH8位于秦川牛19號(hào)染色體上,是由MYH8基因的29—33外顯子環(huán)化形成,秦川牛不同發(fā)育時(shí)期背最長(zhǎng)肌環(huán)狀RNA測(cè)序結(jié)果顯示,circMYH8在胎牛背最長(zhǎng)肌的表達(dá)水平很高,可能參與牛骨骼肌早期發(fā)育。本研究首先利用生物學(xué)手段鑒定circMYH8為環(huán)狀RNA,接著以牛肌原代細(xì)胞為細(xì)胞模型,探究circMYH8對(duì)牛肌原代細(xì)胞增殖的調(diào)控作用,為高產(chǎn)率肉牛的培育提供新的分子靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所使用的試驗(yàn)動(dòng)物是我國(guó)五大良種黃牛品種之首的秦川牛,為了防止或減少RNA的降解,將所采集的組織樣用無(wú)酶離心管裝,保存在-80 ℃冰箱。牛肌原代細(xì)胞從胎牛背最長(zhǎng)肌樣品中分離,并在20%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素中培養(yǎng)。本試驗(yàn)所用的主要試劑如下:TRIzol 試劑(TaKaRa;中國(guó))、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa;日本)、熒光定量試劑盒(TaKaRa;日本)、瓊脂糖(Hydragene;美國(guó))、核質(zhì)提取試劑盒(Life Technologies;美國(guó))、RIPA裂解液(Solarbio;中國(guó))、DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermo Scientific;美國(guó))、EdU細(xì)胞增殖試劑盒(RiboBio;中國(guó))、PCD 2.1載體(吉賽;中國(guó))、inhibitor(通用生物;中國(guó))。

1.2 主要儀器

PCR儀(ALD1244;美國(guó)Bio-Rad)、熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96;美國(guó)Bio-Rad)、凝膠成像儀(UNIVERSAL HOOD Ⅱ;美國(guó)Bio-Rad)、高速冷凍離心機(jī)(BIOFUGE PRIMO R;美國(guó)Thermo)、多功能酶標(biāo)儀(BioTek Synergy2;美國(guó)BioTek)、多功能成像分析系統(tǒng)(FluorChem M system;美國(guó)ProteinSimple)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(3111;美國(guó)Thermo)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牛肌原代細(xì)胞分離及培養(yǎng) 首先,將胎牛放入滅菌大培養(yǎng)皿內(nèi),用酒精棉球全面擦拭皮膚,利用手術(shù)刀剝離皮膚與筋膜,取適量肌肉組織并用無(wú)菌PBS沖洗3次。接著,將沖洗好的肌肉組織放入已加少量PBS的培養(yǎng)皿中,用滅菌剪刀將肌肉組織剪碎后轉(zhuǎn)至10 mL離心管,去上清后加入組織4倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶,37 ℃水浴搖床消化3 h。利用孔徑38 μm濾網(wǎng)過(guò)濾消化后的細(xì)胞,并將過(guò)濾得到的細(xì)胞用無(wú)菌PBS清洗3次(1 500 r/min),最后用含有20%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 RNA提取及RT-qPCR 利用TRIzol試劑(TaKaRa;日本)和核質(zhì)提取試劑盒分別提取總RNA以及細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)RNA;利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA;使用熒光定量試劑盒在熒光定量PCR儀上進(jìn)行RT-qPCR。其中將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋10倍作為模板,GAPDH為內(nèi)參,表達(dá)量用2-ΔΔCt值進(jìn)行校正。熒光定量反應(yīng)體系(15 μL)為:SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)7.5 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、去離子水4.5 μL。所使用PCR的反應(yīng)程序包括以下步驟:95 ℃,240 s 預(yù)變性;95 ℃,20 s變性;55 ℃,20 s 退火;72 ℃,20 s延伸;共40個(gè)循環(huán),整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程保持避光。本試驗(yàn)所有引物信息如表1所示。

表1 引物信息

1.3.3 RNase R處理及核質(zhì)分離 RNase R是一種可以切割降解RNA的核糖核酸外切酶,來(lái)源于大腸桿菌,能夠消化幾乎所有的線(xiàn)性RNA分子,但不易消化環(huán)狀RNA以及套索結(jié)構(gòu),因此,可以用于環(huán)狀RNA的鑒定。用20 U/μL的 RNase R處理牛背最長(zhǎng)肌總RNA 4 h,再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后即可通過(guò)PCR檢測(cè)circMYH8的穩(wěn)定性。參考核質(zhì)提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行牛肌原代細(xì)胞核質(zhì)RNA的分離。

1.3.4 circMYH8的鑒定 設(shè)計(jì)合成circMYH8的divergent primer及convergent primer 2組引物分別用來(lái)擴(kuò)增circMYH8及其線(xiàn)性轉(zhuǎn)錄物。使用NCBI中的primer design tool軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物,由于環(huán)狀RNA與mRNA不同,它不具有5′和3′末端,而是RNA剪切過(guò)程中反向拼接產(chǎn)生的閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu),因此,設(shè)計(jì)divergent primer與convergent primer也不相同,設(shè)計(jì)convergent primer時(shí)要考慮產(chǎn)物應(yīng)包含環(huán)化位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物時(shí):Tm值應(yīng)不低于40 ℃;GC含量最好在40%～60%;上下游引物的Tm值和GC含量均應(yīng)相差不大;引物的長(zhǎng)度最好在18～25 nt;擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度最好在100～250 bp,不宜太長(zhǎng)。引物合成成功后,分別以牛背最長(zhǎng)肌cDNA、RNase R處理的牛背最長(zhǎng)肌cDNA以及牛背最長(zhǎng)肌gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)測(cè)序及瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。所述的PCR的擴(kuò)增體系(20 μL)為:50 ng/μL模板DNA 1 μL、10 pmol/L的引物divergent primer或convergent primer對(duì)應(yīng)的上下游引物各1 μL、PCR Mix 10 μL、去離子水7 μL。所使用PCR的反應(yīng)程序包括以下步驟:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共15個(gè)循環(huán);95 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共20個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.3.5 載體構(gòu)建及干擾片段合成 設(shè)計(jì)circMYH8全長(zhǎng)引物,以牛背最長(zhǎng)肌cDNA為模板PCR擴(kuò)增circMYH8全長(zhǎng)片段后,和PCD 2.1載體同時(shí)進(jìn)行KpnⅠ和BamH Ⅰ雙酶切,回收酶切片段后利用T4DNA Ligase進(jìn)行酶連反應(yīng),酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行涂板,最后挑單克隆菌進(jìn)行菌液PCR,選取陽(yáng)性菌液送測(cè)序,將測(cè)序正確的菌液純化試劑盒抽提circMYH8過(guò)表達(dá)載體。為了合成circMYH8干擾片段,設(shè)計(jì)了circMYH8環(huán)化位點(diǎn)為靶點(diǎn)的siRNAs并由通用生物公司合成,circMYH8-si的序列為:5′-GGAAGCAGAGGTGAATATT-3′。siRNA設(shè)計(jì)原則:片段長(zhǎng)度19～21 nt;GC含量40%～60%;避免出現(xiàn)超過(guò)4個(gè)連續(xù)A/T;首位盡量避免重復(fù);序列位置應(yīng)在環(huán)化位點(diǎn)兩側(cè)分布均勻;一般會(huì)在干擾片段的3′末端加TT懸垂。

1.3.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 首先培養(yǎng)肌原代細(xì)胞,并將細(xì)胞接種到12孔板中。轉(zhuǎn)染前,將孔板里的培養(yǎng)基換為OPTI-MEM培養(yǎng)基。以12孔板規(guī)格為例:根據(jù)載體或RNA寡核苷酸的濃度,將50 pmol的RNA寡核苷酸溶解于100 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基中(A),同時(shí)用100 μL OPTI-MEM培養(yǎng)基溶解1.5 μL R0531,室溫靜置5 min(B)。將(A)緩緩加入(B)中,輕輕混勻,室溫孵育15 min。最后將(A)(B)混合液加入相應(yīng)的孔板中,“十字法”將培養(yǎng)基搖勻,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.7 Western Blot 使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白,并通過(guò)BCA分析試劑盒(Solarbio;中國(guó))進(jìn)行蛋白定量,并在SDS中等量煮沸變性蛋白;SDS-PAGE凝膠每孔上樣20 mg蛋白質(zhì),并在120 V,2 h條件下進(jìn)行電泳,接著將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore;德國(guó))上并在200 mA條件下轉(zhuǎn)膜3 h;TBST洗滌10 min,5%脫脂奶粉封閉膜2 h后,4 ℃與一抗孵育過(guò)夜;TBST洗滌膜3次后與HRP二抗常溫孵育2 h,TBST洗滌3次后使用ECL試劑(TransGen Biotech;中國(guó))通過(guò)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Bio-Rad;美國(guó))檢測(cè)蛋白信號(hào)。

1.3.8 EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖及流式細(xì)胞術(shù) 參考EdU細(xì)胞增殖試劑盒說(shuō)明書(shū),根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)處理96孔板細(xì)胞,并采用熒光顯微鏡(DM5000B;德國(guó))獲取EdU圖像。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期:待細(xì)胞匯合度為80%左右時(shí)胰酶消化細(xì)胞,收集至2 mL離心管中,PBS清洗細(xì)胞2次;PBS清洗細(xì)胞后離心棄上清,加入預(yù)冷70%乙醇于4 ℃固定過(guò)夜;離心收集細(xì)胞,以1 mL的PBS洗細(xì)胞2次,加入500 μL PI染液(含50 μg/mL碘化丙啶(PI)的PBS,100 μg/mL RNase A,0.2% Triton X-100),4 ℃避光孵育30 min;利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),計(jì)數(shù)2～3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,使用細(xì)胞周期擬和軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析 使用GraphPad Prism 8.0和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。2組分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),3組或更多組采用單因素方差分析(ANOVA)。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(s)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 circMYH8的篩選

用于篩選的測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)自秦川牛胎兒90 d和成年24月齡2個(gè)不同發(fā)育時(shí)期背最長(zhǎng)肌的環(huán)狀RNA測(cè)序結(jié)果,其中,每個(gè)發(fā)育階段有3個(gè)牛骨骼肌樣本,總共包含6個(gè)通過(guò)質(zhì)量控制的牛骨骼肌RNA樣品,并基于Illumina HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行環(huán)狀RNA高通量測(cè)序。根據(jù)|log2FC|>1及P<0.01的閾值對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾,篩選出牛背最長(zhǎng)肌2個(gè)發(fā)育階段差異表達(dá)的環(huán)狀RNA(圖1-A),然后對(duì)其中顯著差異的環(huán)狀RNA進(jìn)行不同發(fā)育階段骨骼肌表達(dá)水平驗(yàn)證,RT-qPCR結(jié)果表明,circMYH8在胎牛骨骼肌的表達(dá)高于在成年牛骨骼肌中的表達(dá),這與RNA-seq數(shù)據(jù)一致(圖1-B),暗示circMYH8在骨骼肌增殖中的調(diào)控作用。

2.2 circMYH8的鑒定

circMYH8來(lái)源于牛19號(hào)染色體上MYH8基因的29—33外顯子,使用circMYH8的divergent primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物Sanger測(cè)序結(jié)果證實(shí)circMYH8具有反向拼接位點(diǎn)(圖2-A)。接著瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示:以牛背最長(zhǎng)肌cDNA或RNase R處理的牛背最長(zhǎng)肌cDNA作為模板,circMYH8 divergent primer能夠成功擴(kuò)增出產(chǎn)物,但以牛背最長(zhǎng)肌gDNA作為模板時(shí),circMYH8 divergent primer不能擴(kuò)增出產(chǎn)物;以牛背最長(zhǎng)肌cDNA或牛背最長(zhǎng)肌gDNA作為模板,circMYH8 convergent primer能夠成功擴(kuò)增出產(chǎn)物,但當(dāng)使用RNase R處理的牛背最長(zhǎng)肌cDNA作為模板時(shí),circMYH8 convergent primer不能擴(kuò)增出產(chǎn)物,該結(jié)果證實(shí)了circMYH8的真實(shí)性(圖2-B)。對(duì)circMYH8進(jìn)行了細(xì)胞核質(zhì)定位試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)circMYH8在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都存在(圖2-C)。circMYH8 的RNase R抗性檢測(cè)結(jié)果顯示RNase R極顯著降低了線(xiàn)性MYH8和β-actin的表達(dá)水平,而對(duì)circMYH8無(wú)顯著影響(圖2-D)。以上結(jié)果確證circMYH8是環(huán)狀RNA。

A.circMYH8在牛基因組上的定位,以及Sanger測(cè)序證實(shí)了circMYH8環(huán)化位點(diǎn)的存在;B.PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果確證了circMYH8的真實(shí)性;C.細(xì)胞核質(zhì)定位試驗(yàn)顯示circMYH8定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì);D.RNase R的抗性試驗(yàn)結(jié)果顯示circMYH8比線(xiàn)性MYH8更穩(wěn)定。

2.3 circMYH8抑制牛肌原代細(xì)胞增殖

為了探究circMYH8對(duì)牛骨骼肌增殖表型的影響,使用circMYH8過(guò)表達(dá)載體和干擾片段在培養(yǎng)24 h的牛肌原代細(xì)胞中成功過(guò)表達(dá)及抑制circMYH8(圖3-A、B)。首先收集細(xì)胞,利用qRT-PCR及Western Blot手段檢測(cè)增殖標(biāo)志基因CDK2、CyclinD1、CDK4及P21的表達(dá)水平,結(jié)果表明:circMYH8過(guò)表達(dá)顯著抑制了CyclinD1和CDK4的轉(zhuǎn)錄水平,對(duì)CDK2和P21的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)顯著影響(圖3-C),而干擾circMYH8極顯著抑制了P21的轉(zhuǎn)錄水平(圖3-D)。circMYH8過(guò)表達(dá)顯著抑制了CDK2、CyclinD1和CDK4的翻譯水平,促進(jìn)了P21的翻譯水平,而干擾circMYH8對(duì)這些增殖標(biāo)志基因的翻譯水平幾乎沒(méi)有影響(圖3-E)。隨后,EdU檢測(cè)結(jié)果顯示,circMYH8過(guò)表達(dá)顯著抑制了牛肌原代細(xì)胞的增殖,而干擾circMYH8對(duì)牛肌原代細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用(圖4-A)。此外,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估circMYH8對(duì)牛肌原代細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果表明,circMYH8過(guò)表達(dá)不影響細(xì)胞周期分布,而干擾circMYH8促進(jìn)了S期細(xì)胞比例的增加(圖4-B)?？傊?這些試驗(yàn)結(jié)果表明,circMYH8能夠抑制牛肌原代細(xì)胞增殖。

A,B.circMYH8在培養(yǎng)24 h的牛肌原代細(xì)胞中被成功過(guò)表達(dá)(A)及抑制(B);C、D.過(guò)表達(dá)(C)及干擾(D)circMYH8后CDK2、CyclinD1、CDK4及P21的mRNA水平;E.過(guò)表達(dá)及干擾circMYH8后CDK2、CyclinD1、CDK4及P21的蛋白水平。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

A.EdU檢測(cè)用于評(píng)估細(xì)胞增殖能力,刻度尺,200 mm;B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。提供的數(shù)據(jù)來(lái)自3個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái),隨著高通量測(cè)序技術(shù)不斷的升級(jí)優(yōu)化,動(dòng)物細(xì)胞中的各類(lèi)非編碼RNA被廣泛發(fā)掘鑒定,其中研究最多的是miRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA,而環(huán)狀RNA因其環(huán)化閉合的結(jié)構(gòu),相較于其他非編碼RNA穩(wěn)定性更高,在動(dòng)物生命活動(dòng)中可能發(fā)揮重要的作用,從而受到廣泛的重視[10-12]。研究發(fā)現(xiàn),盡管環(huán)狀RNA的物種間保守性不高,但其以組織和發(fā)育階段特異性方式發(fā)揮基因調(diào)控功能[13]。環(huán)狀RNA通常含有豐富的miRNA結(jié)合位點(diǎn),可以充當(dāng)miRNA的分子海綿發(fā)揮ceRNA調(diào)控作用,間接調(diào)控miRNA的靶基因,例如Hansen等[14]發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA ciRS-7及Sry分別擁有73個(gè)miR-7靶位點(diǎn)以及16個(gè)miR-138靶位點(diǎn),通過(guò)吸附miRNA,ciRS-7和Sry能夠間接調(diào)控其靶基因。最近,也有研究顯示,環(huán)狀RNA可以通過(guò)介導(dǎo)蛋白-RNA相互作用調(diào)控動(dòng)物各種生理病理過(guò)程,例如,circAmotl1被發(fā)現(xiàn)通過(guò)招募STAT3啟動(dòng)Dnmt3a轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖和傷口愈合[15],Du等[16]證實(shí)circFoxo3通過(guò)與p53及E3泛素連接酶MDM2相互作用,導(dǎo)致MDM2對(duì)p53的泛素化和降解,從而影響癌細(xì)胞的凋亡。此外,環(huán)狀RNA還被證實(shí)通過(guò)編碼微肽參與蛋白翻譯調(diào)控[17]。

本研究的數(shù)據(jù)來(lái)源于牛的2個(gè)不同發(fā)育階段骨骼肌環(huán)狀RNA測(cè)序,用以篩選出差異表達(dá)的環(huán)狀RNA[18]。骨骼肌的發(fā)育過(guò)程極其復(fù)雜,涉及產(chǎn)前及產(chǎn)后2個(gè)階段,包括肌纖維的形成、增加以及再生[19]。其中胎兒90 d為產(chǎn)前階段,此時(shí)存在著大量肌肉祖細(xì)胞的增殖發(fā)生,而24月齡為產(chǎn)后階段,這期間肌纖維已經(jīng)完全形成[20]。這些具有發(fā)育階段特異性表達(dá)模式的環(huán)狀RNA可能參與調(diào)控骨骼肌發(fā)育。作為反向剪接產(chǎn)物的環(huán)狀RNA,在套索、順式作用元件以及反式作用因子的驅(qū)動(dòng)下反向剪接環(huán)化促使其形成[21],因此,證實(shí)反向剪接環(huán)化位點(diǎn)的存在是環(huán)狀RNA鑒定的關(guān)鍵。在這里,設(shè)計(jì)出能擴(kuò)增出環(huán)化位點(diǎn)的divergent primer用以環(huán)狀RNA的鑒定。此外,線(xiàn)性產(chǎn)物和環(huán)化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄存在競(jìng)爭(zhēng)[22-23],同時(shí)設(shè)計(jì)出能擴(kuò)增出線(xiàn)性產(chǎn)物的convergent primer用以對(duì)照,通過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)序及膠圖鑒定,本研究證實(shí)了circMYH8是環(huán)狀RNA。

在骨骼肌發(fā)育研究領(lǐng)域,骨骼肌細(xì)胞的增殖表型是評(píng)估骨骼肌細(xì)胞發(fā)育的重要指標(biāo)。由于脊椎動(dòng)物骨骼肌纖維在胎兒期就已保持?jǐn)?shù)目恒定,出生后主要通過(guò)肌纖維的肥大增加肌肉量,因此,早期骨骼肌細(xì)胞的增殖調(diào)控決定著骨骼肌纖維的數(shù)目,也直接決定著畜禽動(dòng)物的產(chǎn)肉性能[5]。越來(lái)越多的研究表明,非編碼RNA參與骨骼肌細(xì)胞增殖調(diào)控,尤其是miRNA,其中miR-1、miR-133和miR-206已被證實(shí)特異性地調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖[24-25]。目前,關(guān)于環(huán)狀RNA調(diào)控畜禽骨骼肌增殖研究也逐漸增多,例如,牛circLMO7、circRILPL1和circCPE分別通過(guò)吸附miR-378a-3p、miR-145和miR-138促進(jìn)牛成肌細(xì)胞增殖[18,26-27];牛circFUT10通過(guò)吸附miR-133a抑制牛成肌細(xì)胞增殖[28];雞circRBFOX2和circPTPN4分別通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-206和miR-499-3p促進(jìn)雞成肌細(xì)胞增殖[29-30];牛circSVIL通過(guò)抑制STAT1的磷酸化促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的增殖等[31]。本研究從牛不同發(fā)育時(shí)期背最長(zhǎng)肌環(huán)狀RNA測(cè)序結(jié)果中篩選出顯著差異表達(dá)的環(huán)狀RNA circMYH8,通過(guò)一系列生物學(xué)手段鑒定其為環(huán)狀RNA;成功構(gòu)建合成了circMYH8的過(guò)表達(dá)載體及干擾片段,以牛肌原代細(xì)胞為細(xì)胞模型,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,利用分子試驗(yàn)技術(shù)證實(shí)circMYH8可以顯著抑制牛肌原代細(xì)胞的增殖,circMYH8可作為肉牛轉(zhuǎn)基因育種的重要候選分子。