牛病毒性腹瀉病毒NS3基因的生物信息學(xué)分析、蛋白純化及免疫原性分析

楊寧寧,徐明國(guó),張江偉,易繼海,陳創(chuàng)夫,3

(1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832003;2.鐵門(mén)關(guān)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜禽智能養(yǎng)殖,新疆 鐵門(mén)關(guān) 836000;3.西部地區(qū)高發(fā)人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心,新疆 石河子 832003)

牛病毒性腹瀉是病牛以腹瀉為主要特征的免疫抑制性傳染病,病原為牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviraldiarrheavirus,BVDV),該病廣泛分布于世界各地[1-2]。1946年,Olafson等[3]在紐約州的消化道潰瘍和下痢為主要特征的病牛中首次發(fā)現(xiàn)了BVDV,并于1957年成功分離獲得了該毒株。根據(jù)BVDV能否引起宿主細(xì)胞病變,可將其分為致細(xì)胞病變型(Cytopathic,CP)和非致細(xì)胞病變型(Noncytopathic,NCP),這2種生物型都有致病性,但只有NCP毒株可以引起牛的持續(xù)性感染(Persistent infection,PI)[4]。根據(jù)核苷酸序列的差異及交叉中和反應(yīng),可以將BVDV分為BVDV-Ⅰ 和BVDV-Ⅱ 2個(gè)基因型[5-6]。BVDV-Ⅰ 型毒株常被用于實(shí)驗(yàn)室研究和疫苗研發(fā)。根據(jù)BVDV-Ⅰ 型基因組5′UTR、Npro和E2核苷酸序列的差異,可將其分為23個(gè)亞型(1a～1w);根據(jù)BVDV-Ⅱ 型5′UTR差異,可將其分為4個(gè)亞型(2a～2d)[4]。2004年,在巴西收集的一批胎牛血清中分離出了全新瘟病毒(HoBi樣瘟疫病毒株或者BVDV-3),該基因型可分為2個(gè)基因亞型(Brazilian源和Thai源)[4,7-9]。BVDV的基因組結(jié)構(gòu)為5′UTR-Npro-C-Erns(E0)-E1-E2-p7-NS2/3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3′UTR,其中C、Erns、E1、E2 為BVDV的結(jié)構(gòu)蛋白(Structural proteins),其余為非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-structural proteins,NS)。其中非結(jié)構(gòu)蛋白NS3不僅對(duì)BVDV的復(fù)制具有重要作用,而且與BVDV是否致細(xì)胞病變關(guān)系密切[10-11]。且因其具有高度保守性常被作為診斷靶標(biāo),但對(duì)其是否具有免疫原性的報(bào)道較少[12]。因此,本研究以NS3蛋白為研究對(duì)象,初步探討了其免疫原性,以期為BVDV亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物、菌株和血清 4～6周齡的SPF級(jí) BABL/c 小鼠購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心; BL21(DE3)和DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;pET-22b(+)表達(dá)載體、BVDV陽(yáng)性血清和BVDV毒株均由石河子大學(xué)人獸共患病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ購(gòu)自寶生物工程有限公司;蛋白 Marker購(gòu)自康為世紀(jì)生物有限公司;增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司;NC膜(0.45 μm)購(gòu)自Milipore公司;ClonExpress? Ultra One Step Cloning Kit購(gòu)自諾唯贊生物科技(南京)股份有限公司;BCA蛋白定量分析試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific; HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;HRP標(biāo)記的Goat Anti-Mouse IgG、IgG1和IgG2a購(gòu)自Abcam公司;IPTG溶液(50 mg/mL)購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BVDV NS3蛋白的生物信息學(xué)分析 根據(jù)NCBI GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)公布的BVDVNS3基因氨基酸序列(GenBank登錄號(hào):MK102095.1),對(duì)NS3蛋白的抗原性、理化特性、跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位分別進(jìn)行在線預(yù)測(cè)分析,分析軟件如表1。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的BVDVNS3基因序列(GenBank登錄號(hào):L27997.1),利用CE Design軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,引物序列:NS3-F 5′-TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGTCCTGCTGTGTGCAAAAAGATTACC-3′(下劃線為NdeⅠ酶切位點(diǎn))和NS3-R 5′-CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCAGGCCCACCACCTGTTTCAGTGCTTT-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn)),引物序列送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 目的基因的擴(kuò)增與回收 提取BVDV毒株的總RNA并制備 cDNA,利用特異性引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),切取目的基因條帶使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行純化。

表 1 生物信息學(xué)分析軟件

1.2.4 pET-22b(+)-NS3重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將純化的目的基因無(wú)縫克隆至pET-22b(+)表達(dá)載體,連接體系:目的基因2 μL,pET-22b(+)線性化載體 2 μL,2×ClonExpress Mix 5 μL,補(bǔ)充ddH2O 至10 μL,振蕩混均并離心。反應(yīng)條件:50 ℃ 15 min,4 ℃ 10 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,并均勻地涂于含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)板,放入37 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng),無(wú)菌操作挑取單克隆菌并擴(kuò)繁。經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶(NdeⅠ、XhoⅠ)鑒定正確的菌液送至公司測(cè)序。測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,均勻地涂于含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)板,放入37 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng),無(wú)菌操作挑取單克隆菌并擴(kuò)繁。經(jīng)PCR 鑒定正確的菌液與甘油(50%)按1∶1的比例混合,保存于-20 ℃。

1.2.5 NS3重組蛋白的表達(dá)與純化 將保存的pET-22b(+)-NS3重組表達(dá)菌接種至含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.6～0.8時(shí)加入IPTG(終濃度為1.0 mmol/L),繼續(xù)培養(yǎng),分別于2,4,6,8 h各時(shí)間段抽取菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè),以確定 NS3重組蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和可溶性分析。菌液超聲破碎后利用鎳親和層析方法進(jìn)行蛋白純化。

1.2.6 NS3重組蛋白的Western Blotting檢測(cè) 純化的NS3重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后,通過(guò)半干式碳板轉(zhuǎn)運(yùn)電泳儀轉(zhuǎn)運(yùn)至NC膜上。5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h; BVDV陽(yáng)性血清為一抗(1∶200),4 ℃過(guò)夜孵育; HRP標(biāo)記的兔抗牛lgG為二抗(1∶4 000),37 ℃孵育1 h;用增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色。

1.2.7 小鼠免疫 隨機(jī)將12只BABL/c小鼠分為2組(NS3重組蛋白免疫組和PBS免疫陰性對(duì)照組),每組6只。免疫組每只小鼠接種100 μL NS3重組蛋白(1 mg/mL)+100 μL弗氏完全/不完全佐劑,間隔14 d使用同等劑量加強(qiáng)免疫1次。分別在第0,7,14,21,28,35,42,49,56天尾靜脈采集小鼠血液,并分離血清,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 ELISA 檢測(cè)小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a 抗體水平 按提前摸好的條件稀釋NS3重組蛋白,包被于96孔ELISA板,每孔100 μL,4 ℃包被過(guò)夜;第2天,移棄包被液,每孔分別加入100 μL 5% 脫脂奶粉,并于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中封閉1 h;PBST洗板3次,將100 μL小鼠血清(1∶500)加入相應(yīng)96孔板中,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組隨機(jī)選取3個(gè)小鼠血清,每個(gè)小鼠血清做3次重復(fù),再次37 ℃孵育1 h;1×PBST洗板3次,分別加入100 μL HRP標(biāo)記的Goat Anti-Mouse IgG、IgG1和IgG2a(1∶2 0 000),37 ℃孵育1 h;1×PBST 洗板3次,每孔加入100 μL的TMB顯色液,37 ℃避光15 min;最后每孔分別加入50 μL ELISA終止液終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀讀取OD450處的值。

1.2.9 小鼠血清中和抗體檢測(cè) 分別取50 μL免疫后14,28,42,56 d的小鼠血清,56 ℃水浴滅活30 min,并用RIPA-1640完全培養(yǎng)基做2倍倍比稀釋(2-1～2-8),然后用等體積的TCID50BVDV病毒液混合,37 ℃ 孵育 2 h。將MDBK細(xì)胞均勻地鋪在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí),吸棄培養(yǎng)液,PBS洗3次,一對(duì)一加入孵育后的病毒和血清混合液,PBS免疫組小鼠血清作為陰性對(duì)照。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況,并做好記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 NS3蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 NS3蛋白的抗原性和理化特性分析 通過(guò)VaxiJen v2.0服務(wù)器預(yù)測(cè)NS3蛋白的免疫原性,發(fā)現(xiàn)總體預(yù)測(cè)保護(hù)性抗原評(píng)分為 0.587 3,表明NS3蛋白具有較好的免疫原性;NS3蛋白有683個(gè)氨基酸構(gòu)成;分子質(zhì)量為75.304 33 ku;理論等電點(diǎn)(PI)為8.15;在大腸桿菌中的半衰期>10 h,且不穩(wěn)定性指數(shù)為35.23,表明該蛋白為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.1.2 NS3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽分析 NS3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽分別利用TMHMM Serverv.2.0和SignalP 4.1 server在線軟件分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NS3蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽序列(圖1,2)。

圖1 NS3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖2 NS3蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.1.3 NS3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè) NS3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)利用SOPMA在線軟件預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)NS3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中(圖3),α-螺旋由209個(gè)氨基酸,占30.60%;延伸鏈由149個(gè)氨基酸,占21.82%;β-轉(zhuǎn)角由62個(gè)氨基酸,占9.08%;無(wú)規(guī)則卷曲由263個(gè)氨基酸,占38.51%,表明NS3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主。NS3蛋白的三級(jí)模型利用phyre 2在線軟件構(gòu)建(圖4)。

圖3 NS3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖4 NS3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型

2.1.4 NS3蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) 抗原表位指蛋白質(zhì)表面由6～12個(gè)氨基酸或碳水基團(tuán)組成并且具有刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的區(qū)域。利用IEBD軟件對(duì)NS3蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其有20個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位,分別在第7—16,23—33,46—49等氨基酸片段區(qū)(表2)。表明NS3蛋白整體抗原性較好,具有作為疫苗及診斷抗原的潛力。

表2 預(yù)測(cè)多肽

2.2 目的基因的擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)以 BVDV 毒株的 cDNA 為模板,以NS3-F 和NS3-R 為引物,經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物,在約2 049 bp處出現(xiàn)一條條帶(圖5)。測(cè)序結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn),與GenBank公布的BVDVNS3基因序列達(dá)到100%的同源性,表明成功獲得目的基因片段。

M.DM10000 Marker;1.陰性對(duì)照;2—3.NS3目的基因。

2.3 pET-22b(+)-NS3重組質(zhì)粒酶切鑒定

將pET-22b(+)-NS3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,挑取單克隆菌并擴(kuò)增,提取質(zhì)粒用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與目的基因大小相符的條帶(圖6),表明NS3基因與pET-22b(+)載體已相互連接,即成功獲得pET-22b(+)-NS3重組質(zhì)粒。

M.1 kb DNA Marker;1.pET-22b(+)質(zhì)粒;2.pET-22b(+)-NS3重組質(zhì)粒雙酶切。

2.4 NS3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析

將pET-22b(+)-NS3菌液接種到LB液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果顯示,在75 ku處出現(xiàn)一條與NS3蛋白大小相符的蛋白條帶,且隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),蛋白表達(dá)量逐漸增高,表明NS3蛋白成功表達(dá),最佳誘導(dǎo)時(shí)間為8 h(圖7-A)。SDS-PAGE 電泳分析超聲破碎后的上清和沉淀,結(jié)果顯示,NS3重組蛋白在沉淀中含量較高,說(shuō)明該蛋白主要以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá)(圖7-B)。

A:M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1—5.pET-22b(+)-NS3 37 ℃ 誘導(dǎo)0,2,4,6,8 h的菌液。B:M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.破碎后菌液沉淀;2.破碎后菌液上清液。

2.5 NS3重組蛋白的純化與Western Blotting檢測(cè)

按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)步驟對(duì)NS3重組蛋白進(jìn)行純化,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析得到了純度較高的NS3重組蛋白(圖8)。純化的蛋白Western Blotting驗(yàn)證,結(jié)果顯示,在約75 ku處出現(xiàn)明顯的反應(yīng)條帶(圖9),表明純化的NS3重組蛋白能夠與BVDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.純化后的NS3重組蛋白。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1—2.純化后的NS3重組蛋白。

2.6 小鼠血清 IgG、IgG1和IgG2a 抗體檢測(cè)

免疫小鼠血清中的 IgG、IgG1 和 IgG2a 抗體水平由 ELISA 檢測(cè)。結(jié)果顯示:與 PBS 陰性對(duì)照組相比,NS3重組蛋白免疫組能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的IgG、IgG1和 IgG2a抗體(圖10),表明其具有較好的免疫原性。

A.小鼠血清中IgG抗體水平;B.小鼠血清中IgG1抗體水平;C.小鼠血清中IgG2a抗體水平。

2.7 小鼠血清中和抗體水平

小鼠血清中和抗體結(jié)果顯示,一免后14 d,NS3重組蛋白免疫組與PBS陰性對(duì)照組相比極顯著高于PBS陰性對(duì)照組(圖11),且隨著免疫時(shí)間和免疫次數(shù)的增加這種顯著性更為明顯。結(jié)果表明,NS3重組蛋白制備成的疫苗免疫小鼠后能夠產(chǎn)生高水平的中和抗體,其具有較好的免疫原性。

圖11 免疫小鼠血清中病毒中和抗體檢測(cè)

3 結(jié)論與討論

BVDV 主要感染牛、羊、豬、鹿等動(dòng)物,臨床癥狀為精神沉郁、厭食、腹瀉、體溫升高、白細(xì)胞數(shù)目減少、生產(chǎn)性能下降、懷孕母畜導(dǎo)致流產(chǎn)或產(chǎn)畸形胎兒,偶爾觀察到感染動(dòng)物口鼻潰爛、便血、腸黏膜脫落等[13-15]。另外,BVDV是牛源生物制品,如血清、凍精和冷凍胚胎等的常見(jiàn)污染源,給畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,生物信息學(xué)軟件廣泛被用于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等的分析和預(yù)測(cè),可為人工合成蛋白質(zhì)、疫苗設(shè)計(jì)和疾病發(fā)生機(jī)制等方面的研究提供理論依據(jù),能夠有效地減少試驗(yàn)的盲目性從而節(jié)約成本[16-17]。該研究對(duì)NS3蛋白的氨基酸序列進(jìn)行理化特性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):NS3蛋白包含683個(gè)氨基酸,分子質(zhì)量為75.304 33 ku,理論P(yáng)I為8.15,不穩(wěn)定性指數(shù)為35.23,表明該蛋白為穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。通過(guò)VaxiJen v2.0服務(wù)器預(yù)測(cè)NS3蛋白的免疫原性,發(fā)現(xiàn)總體預(yù)測(cè)保護(hù)性抗原為0.587 3,大于0.4的閾值,表明NS3蛋白具有較好的免疫原性。NS3蛋白既沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域也沒(méi)有信號(hào)肽,二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲為主。通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)NS3蛋白進(jìn)行分析,可以為該基因原核表達(dá)菌株的構(gòu)建提供理論依據(jù),尤其是對(duì)進(jìn)一步的蛋白表達(dá)和獲得等具有較好的指導(dǎo)意義。

目前,關(guān)于BVDV亞單位疫苗的研究主要集中在E0和E2這2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白上,而這2個(gè)蛋白屬于糖蛋白,利用原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)容易導(dǎo)致糖基化位點(diǎn)丟失。由于E0和E2基因與NS3基因相比變異較快,因此,目前生產(chǎn)中使用的BVDV疫苗還是以弱毒和滅活疫苗為主[8,18-20]。NS3蛋白具有較高的保守性,這種保守性不僅體現(xiàn)在同種基因型BVDV毒株之間,而且存在于不同基因型之間,因此,國(guó)內(nèi)外學(xué)者常利用NS3建立BVDV抗體/抗原檢測(cè)方法[21]。然而,目前關(guān)于NS3蛋白的研究大多集中在診斷方面,關(guān)于其是否可用于疫苗的生產(chǎn)方面研究較少。在BVDV感染過(guò)程中,宿主免疫系統(tǒng)的CD4+T細(xì)胞可識(shí)別NS3蛋白,并誘導(dǎo)其產(chǎn)生特異性的抗體,且該特異性抗體持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)[22-23]。因此,本研究利用原核蛋白表達(dá)系統(tǒng),成功表達(dá)并獲得了純度較高的NS3重組蛋白,并將該重組蛋白與弗氏佐劑按1∶1的比例混合免疫BABL/c小鼠,定期采集免疫小鼠血液,并分離血清。ELISA檢測(cè)了小鼠血清中的 IgG、IgG1和 IgG2a抗體水平,發(fā)現(xiàn)與PBS陰性對(duì)照組相比,NS3重組蛋白免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生了更高水平的IgG、IgG1和 IgG2a抗體。小鼠血清中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),自一免后14 d開(kāi)始,NS3重組蛋白免疫組小鼠產(chǎn)生的中和抗體極顯著高于PBS陰性對(duì)照組,且隨著免疫時(shí)間和免疫次數(shù)的增加這種顯著性尤為明顯。說(shuō)明由NS3重組蛋白制備成的亞單位疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的特異性抗體和中和抗體,表現(xiàn)出較好的免疫原性,從而推斷其可作為 BVDV 亞單位疫苗的候選抗原。

本研究對(duì)BVDV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,掌握了其結(jié)構(gòu)與抗原特性,利用原核表達(dá)技術(shù)成功獲得了具有較高純度的NS3重組蛋白,并將其作為免疫原制備成亞單位疫苗,免疫小鼠后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性抗體和中和抗體,從而為 BVDV 亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。