落花生根內(nèi)生真菌Fusarium oxysporum LHS-P1-3中恩鐮孢菌素類化合物及生物活性研究

周麗曼，孫 建，潘柳婷，郭夢菲，唐運(yùn)文，王 聰，許海棠，孔凡棟

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落花生根內(nèi)生真菌LHS-P1-3中恩鐮孢菌素類化合物及生物活性研究

周麗曼，孫 建，潘柳婷，郭夢菲，唐運(yùn)文，王 聰，許海棠*，孔凡棟*

廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，林產(chǎn)化學(xué)與工程國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西高校少數(shù)民族醫(yī)藥古方挖掘與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006

研究落花生根內(nèi)生真菌LHS-P1-3的次級代謝產(chǎn)物及其生物活性。使用硅膠色譜柱、高效液相色譜等對代謝粗提物進(jìn)行分離純化，采用質(zhì)譜、核磁共振等方法測定化合物的結(jié)構(gòu)，采用CCK-8法測試化合物的抗腫瘤細(xì)胞活性，使用表面等離子共振實(shí)驗(yàn)（surface plasmon resonance，SPR）研究化合物與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（niemann-pick c1-like 1，NPC1L1）相互作用關(guān)系。從落花生根內(nèi)生真菌LHS-P1-3分離得到6個(gè)化合物，包括1個(gè)新化合物（1）與5個(gè)已知化合物：白僵菌素（2）、恩鐮孢菌素I（3）、恩鐮孢菌素MK1688（4）、恩鐮孢菌素H（5）及恩鐮孢菌素B（6）?；衔?～4對HepG2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的IC50均小于10 μmol/L，化合物2～4則對HCT116細(xì)胞的IC50小于10 μmol/L，SPR研究表明化合物2、4在20 μmol/L濃度下，可與NPC1L1蛋白相互作用?；衔?為新的恩鐮孢菌素類化合物，命名為恩鐮孢菌素W。化合物1～5具有抗腫瘤活性，化合物2、4與NPC1L1蛋白存在相互作用，可能是NPC1L1蛋白的潛在抑制劑。

落花生；尖刀鐮孢菌LHS-P1-3；恩鐮孢菌素；白僵菌素；細(xì)胞毒活性；NPC1L1蛋白

植物內(nèi)生菌是分布于植物各組織和器官且與植物共生的一類微生物，其中包括內(nèi)生真菌、放線菌以及細(xì)菌等。其中，一些內(nèi)生菌在長期進(jìn)化過程中已經(jīng)和宿主植物形成互惠互利的關(guān)系，并且能產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌產(chǎn)生的一些次級代謝產(chǎn)物不僅具有與宿主植物相同或相似的生物活性，甚至有些代謝產(chǎn)物還具有原宿主植物所不具備的新的藥理活性[3]。

豆科（Leguminosae）是植物界的第3大科，約有600屬、7000種，在世界各地廣泛分布；我國存在的豆科植物有131屬、1000余種，分布于各省區(qū)[6]。豆科植物包括大豆、紅豆、綠豆以及落花生等可食用的農(nóng)作物，還包括甘草、兒茶、雞血藤以及黃芪等藥用植物類。研究發(fā)現(xiàn)，藥用豆科植物具有一定的降糖、降血壓以及抗腫瘤等活性[7-9]。落花生L.，通稱花生，豆科花生屬植物，在我國分布十分廣泛，是一種較為常見的經(jīng)濟(jì)作物。藥食同源的落花生不僅可以作為油料作物使用，還可以入藥，其內(nèi)所含的物質(zhì)具有降血壓、降膽固醇、抗菌以及抗氧化的功效[10-11]。

植物內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物研究是藥用植物的熱點(diǎn)研究方向。目前對藥用植物內(nèi)生真菌的研究較多，然對于根部內(nèi)生真菌的研究較少。本研究采用梯度稀釋法，將從落花生的根部樣品中分離得到的一株尖刀鐮孢真菌LHS-P1-3進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用反相硅膠柱、半制備HPLC分離得到1個(gè)新的化合物恩鐮孢菌素W（enniatin W，1）與5個(gè)已知化合物白僵菌素（beauverine，2）、恩鐮孢菌素I（enniatin I，3）、恩鐮孢菌素MK1688（enniatin MK1688，4）、恩鐮孢菌素H（enniatin H，5）、恩鐮孢菌素B（enniatin B，6），結(jié)構(gòu)見圖1。細(xì)胞毒活性結(jié)果顯示環(huán)狀三羧酸肽類結(jié)構(gòu)化合物1～5對多株腫瘤細(xì)胞顯示出抑制活性，而表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物2（白僵菌素）與化合物4（恩鐮孢菌素MK1688）與在腸道膽固醇吸收中起核心作用的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（niemann-pick c1-like 1，NPC1L1）具有相互作用，可能是潛在的膽固醇吸收抑制劑，這是首次報(bào)道該類化合物與NPC1L1蛋白的相互作用關(guān)系。

圖1 化合物1～6的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

HCB-1300V型潔凈工作臺（青島海爾特種電器有限公司）、YXQ-LS-75SII型高壓滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、Agilent 1260 HPLC（美國Agilent公司）、布魯克400MHz核磁共振儀（Bruker Biospin有限公司）、AL104型分析天平（瑞士梅特勒公司）、CO2培養(yǎng)箱（賽默飛3111）、酶標(biāo)儀（上海飛世爾實(shí)驗(yàn)器材有限公司）、Nacalai tesque COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ型（250 mm×10 mm，5 μm）半制備柱。提取分離所用醋酸乙酯、甲醇等溶劑均為工業(yè)用化學(xué)純，HPLC所用甲醇為色譜純。人肝癌HepG2細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞、人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞及人正常肝細(xì)胞L02均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。細(xì)胞毒活性測試中陽性對照蘇尼替尼（批號S126061）及鹽酸阿霉素（批號D1515）分別采購自Aladdin試劑公司、Sigma-Aldrich試劑公司。

植物樣品采自廣西民族大學(xué)思源湖校區(qū)（N22°50′20′′，E108°11′29′′），由廣西民族大學(xué)講師周麗曼鑒定為落花生L.。本研究大發(fā)酵用落花生根內(nèi)生真菌LHS-P1-3綜合菌株的生長形態(tài)與序列比對（GenBank accession No. MN013975），此菌株鑒定為LHS-P1-3。

2 方法

2.1 菌株的分離純化與發(fā)酵

選取其中1株分離自落花生根部的真菌尖孢鐮刀菌LHS-P1-3進(jìn)行培養(yǎng)。將選定菌株分別接種于裝有大米培養(yǎng)基（大米80 g、自來水120 mL）、真菌2號培養(yǎng)基（甘露醇6 g、葡萄糖3 g、酵母膏0.9 g、味精3 g、KH2PO40.015 g，自來水300 mL）的錐形瓶中，室溫靜置培養(yǎng)30 d，使用大米培養(yǎng)基、真菌2號培養(yǎng)基分別發(fā)酵了8 kg、30 L。

2.2 菌株鑒定

對落花生根內(nèi)生真菌LHS-P1-3進(jìn)行菌株鑒定，進(jìn)行了菌株基因組DNA的提取、擴(kuò)增、純化與測序等，該工作由上海生工生物工程股份有限公司完成。使用NCBI數(shù)據(jù)庫，比對真菌ITS序列，并使用軟件MEGA（Version 7.0）繪制菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.3 次級代謝產(chǎn)物的提取分離

發(fā)酵完成后，使用醋酸乙酯分別對兩種培養(yǎng)基得到的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行萃取，減壓濃縮萃取液后，大米培養(yǎng)基得到浸膏共77.43 g，真菌2號培養(yǎng)基得到浸膏共42.82 g。使用90%甲醇-石油醚（1∶1）分別對浸膏進(jìn)行分離，其中大米培養(yǎng)基所得浸膏分離的甲醇層粗提物（43.85 g）經(jīng)正相硅膠柱梯度洗脫，洗脫體系：石油醚-醋酸乙酯（10∶1→1∶2），共分得21個(gè)組分Fr. 1～21。Fr. 6經(jīng)半制備HPLC（乙腈-水45∶55）分離得到化合物1（6.1 mg，R＝8.2 min）。真菌2號培養(yǎng)基得到的浸膏，其甲醇層粗提物（16.97 g）經(jīng)C18反相硅膠柱梯度洗脫，洗脫體系：甲醇-水（10%→100%），共分得15個(gè)組分Jr. 1～15。Jr. 13經(jīng)半制備HPLC，甲醇-水（80∶20）分離得到化合物2（36.2 mg，R＝8 min）、3（15.2 mg，R＝10.5 min）、4（26.3 mg，R＝13 min）。Jr. 12經(jīng)半制備HPLC（甲醇-水85∶15）分離得到化合物5（33 mg，R＝20 min）和6（7.8 mg，R＝16 min）。

2.4 電子圓二色譜（electronic circular dichroism，ECD）計(jì)算

在Gaussian 09軟件中使用密度泛函理論（density functional theory，DFT）進(jìn)行計(jì)算[12]。具體步驟為：使用hyperchem軟件進(jìn)行初步構(gòu)象搜索，在B3LYP/6-31G（d）水平上進(jìn)行進(jìn)一步的幾何優(yōu)化，用SCRF/PCM方法在相同的DFT水平上評價(jià)了甲醇溶液的溶劑效應(yīng)，用B3LYP/6-31G（d）下的TDDFT計(jì)算了化合物甲醇中的電子激發(fā)能和旋轉(zhuǎn)強(qiáng)度。

2.5 化合物抗腫瘤和SPR分子互作測試

2.5.1 CCK-8法抗腫瘤活性測試[13]取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，稀釋成8×103個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，96孔板中每孔接種100 μL，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，去除原有培養(yǎng)基并加入100 μL含有待測化合物的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，再次去除培養(yǎng)基，加入含有10% CCK-8增強(qiáng)型溶液的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在450 nm處檢測其吸光度并計(jì)算其抑制率。使用SPSS軟件計(jì)算得出該化合物的半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值。實(shí)驗(yàn)過程中，每個(gè)測量濃度均設(shè)3個(gè)平行。

抑制率=(對照－樣品)/(對照－空白)

2.5.2 SPR分子互作測試[14-15]使用Cytia T200生物分子互作儀進(jìn)行SPR實(shí)驗(yàn)。用氨基偶聯(lián)試劑盒將NPC1Ll蛋白偶聯(lián)到CM5芯片表面，將CM5芯片按照標(biāo)準(zhǔn)儀器程序進(jìn)行安裝和啟動后，將-羥基琥珀酰亞胺（-hydroxysuccinimide，NHS）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺（1-ethyl-3-[3-dimethyl- aminopropyl] carbodimide hydrochloride，EDC）以1∶1的比例混合并運(yùn)行混合物，總體積為200 μL，體積流量為10 μL/min，時(shí)間為600 s。然后將NPC1L1蛋白在pH值為4.6的醋酸鈉溶液中稀釋至20 μg/mL，蛋白溶液總體積800 μL，體積流量10 μL/min，時(shí)間為3000 s。最后，乙醇胺溶液總體積200 μL，體積流量10 μL/min，時(shí)間為420 s。然后，使用含1%DMSO的PBS-P緩沖溶液對CM5芯片進(jìn)行預(yù)處理。用含DMSO的PBS-Р緩沖液將化合物稀釋至20 μmol/L，確保DMSO終濃度為1%，體積流量30 μL/min，結(jié)合時(shí)間60 s，解離時(shí)間120 s。最終結(jié)果采用Biacore T200進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株的鑒定

菌株LHS-P1-3 ITS序列的PCR擴(kuò)增序列的長度為523 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的鐮刀菌屬中的尖刀鐮孢菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一分支（圖2）。故將菌株LHS-P1-3（GenBank登錄號OQ391230）初步鑒定為尖刀鐮孢菌。觀察其形態(tài)特征，與尖刀鐮孢菌的形態(tài)特征相一致。故廣西民族大學(xué)孔凡棟副教授鑒定菌株LHS-P1-3為尖刀鐮孢菌，并命名為LHS-P1-3。

圖2 菌株Fusarium oxysporum LHS-P1-3的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1的NMR數(shù)據(jù) (400/100 MHz, CD3OD)

Table 1 NMR data of compound 1 (400/100 MHz, CD3OD)

片段碳位δCδH N-MeVal（3 unit）1167.8×3 2 68.1×34.05 (1H, d, J = 6.0 Hz) 3 32.8×32.35 (1H, m) 4 20.0×31.12 (3H, d, J = 7.2 Hz) 5 18.3×30.95～1.02 (3H, overlapped) 6 34.5×33.01 (3H, s) Hmp（3 unit）7167.6×3 8 81.3×34.96 (1H, d, J = 2.1 Hz) 9 38.3×32.26 (1H, m) 10 26.8×31.54 (1H, m), 1.45 (1H, m) 11 12.1×30.95～1.02 (3H, overlapped) 12 13.4×30.86 (3H, d, J = 6.7 Hz)

圖3 化合物1的關(guān)鍵1H-1H COSY (━) 和HMBC (→) 信號

圖4 化合物1實(shí)測及計(jì)算ECD曲線及化合物4的實(shí)測ECD曲線

化合物2：棕色油狀物（甲醇），ESI-MS/806.5 [M＋Na]+，分子式C45H57N3O9，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.15～7.21 (1H, overlapped, H-5×3, H-6×3, H-7×3, H-8×3, H-9×3), 5.80 (1H, dd,= 12.1, 4.0 Hz, H-2×3), 4.84 (1H, d,= 8.2 Hz, H-12×3), 3.39 (1H, dd,= 14.3, 12.1 Hz, H-3×3), 3.14 (3H, s, 10-CH3×3), 1.81, (1H, m, H-13×3), 0.85 (3H, d,= 7.2 Hz, H-15×3), 0.25 (3H, d,= 7.2 Hz, H-14×3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 173.0 (C＝O, C-11×3), 170.9 (C＝O, C-1×3), 137.9 (C, C-4×3), 129.8 (CH, C-5×3, C-9×3), 129.7 (CH, C-6×3, C-8×3), 128.0 (CH, C-7×3), 77.2 (CH, C-12×3), 57.8 (CH, C-2×3), 35.4 (CH2, C-3×3), 32.2 (CH3, C-10×3), 31.2 (CH, C-13×3), 19.1 (CH3, C-14×3), 17.2 (CH3, C-15×3)。這些數(shù)據(jù)結(jié)合相對分子質(zhì)量推斷化合物2結(jié)構(gòu)中共有3個(gè)-MeVal和3-甲基丁酸（3-methyl-butanoic acid，Hiv）片段。最終通過和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[20]比對鑒定化合物2為白僵菌素。

化合物3：無色油狀物（甲醇），ESI-MS/690.5 [M＋Na]+，分子式C35H61N3O9，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 5.41 (1H, d,= 6.5 Hz, H-8), 5.35 (1H, d,= 6.5 Hz, H-8), 5.24 (1H, d,= 6.4 Hz, H-14), 4.75 (1H, m, H-2×3), 3.20 (3H, s, 6-NCH3), 3.18 (3H, s, 6-CH3), 3.17 (3H, s, 6-NCH3), 2.28 (1H, overlapped, H-3×3, H-15), 2.20 (1H, m, H-9), 1.47 (1H, m, H-10a), 1.25 (1H, m, H-10b), 1.08 (3H, m, H-4×3), 0.91-1.05 (3H, overlapped, H-5×3, H-11×2, H-12×2, H-16, H-17)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 172.1 (C＝O, C-1×3), 172.0 (C＝O, C-7×2), 171.8 (C＝O, C-13), 76.7 (CH, C-14), 75.3 (CH, C-8), 75.1 (CH, C-8), 63.8 (CH, C-2), 63.7 (CH, C-2×2), 37.8 (CH, C-9), 37.7 (CH, C-9), 33.1 (NCH3, C-6), 32.8 (NCH3, C-6), 32.7 (NCH3, C-6), 31.4 (CH, C-15), 29.4 (CH, C-3), 29.3 (CH, C-3), 29.2(CH, C-3), 26.5 (CH2, C-10×2), 20.6 (CH3, C-4×2), 20.5 (CH3, C-4), 20.3 (CH3, C-5×2), 20.2, (CH3, C-5), 18.9 (CH3, C-17), 18.7 (CH3, C-16), 15.1 (CH3, C-12×2), 11.8 (CH3, C-11×2)。經(jīng)過分析，此化合物由3個(gè)-MeVal、2個(gè)Hmp、1個(gè)Hiv組成，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]，故鑒定化合物3為恩鐮孢菌素I。

化合物4：黃色油狀物（甲醇），ESI-MS/704.5 [M＋Na]+，分子式C36H63N3O9，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 5.42 (1H, d,= 6.7 Hz, H-8×3), 4.77 (1H, d,= 8.0 Hz, H-2×3), 3.19 (3H, s, 6-CH3×3), 2.31 (1H, m, H-3×3), 1.98 (1H, m, H-9×3), 1.49 (2H, m, H-10×2), 1.28 (3H, m, H-10), 1.10 (3H, d,= 6.6 Hz, H-4×3), 0.94～1.04 (3H, overlapped, H-5×3, H-11×3, H-12×3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 171.9 (C＝O, C-1×3), 171.7 (C＝O, C-7×3), 75.2 (CH, C-8×3), 63.8 (CH, C-2×3), 37.7 (CH, C-9×3), 32.8 (CH3, C-6×3), 29.2 (CH, C-3×3), 26.5 (CH2, C-10×3), 20.5 (CH3, C-4×3), 20.2 (CH3, C-5×3), 15.1 (CH3, C-12×3), 11.8 (CH3, C-11×3)。經(jīng)過分析，此化合物由3個(gè)-MeVal，3個(gè)Hmp組成，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]，故鑒定化合物4為恩鐮孢菌素MK1688。

化合物5：白色固體（甲醇），ESI-MS/676.5 [M＋Na]+，分子式C34H59N3O9，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 5.38 (1H, d,= 6.2 Hz, H-8), 5.27 (1H, d,= 7.8 Hz, H-14), 5.22 (1H, d,= 7.8 Hz, H-14), 4.70 (1H, overlapped, H-2×3), 3.22 (3H, s, 6-CH3), 3.20 (3H, s, 6-CH3), 3.18 (3H, s, 6-CH3), 2.29 (1H, overlapped, H-3×3, H-15×2), 2.21(1H, m, H-9), 1.48 (1H, m, H-10), 1.26 (1H, m, H-10), 1.09 (3H, m, H-4×3), 0.91～1.05 (3H, overlapped, H-4×3, H-5×3, H-11, H-12, H-16×2, H-17×2)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 172.3 (C＝O, C-1×3), 172.2 (C＝O, C-7), 172.0 (C＝O, C-13×2), 76.8 (CH, C-14), 76.6 (CH, C-14), 75.1 (CH, C-8), 63.9 (CH, C-2), 63.8, (CH, C-2), 63.7 (CH, C-2), 37.7 (CH, C-9), 33.2 (CH3, C-6), 33.0 (CH3, C-6), 32.8 (CH3, C-6), 31.5 (CH, C-15), 31.4 (CH, C-15), 29.4 (CH, C-3), 29.3 (CH, C-3), 29.2 (CH, C-3), 26.6 (CH2, C-10), 20.7 (CH3, C-4), 20.6 (CH3, C-4), 20.5 (CH3, C-4), 20.4 (CH3, C-5), 20.3 (CH3, C-5×2), 19.0 (CH3, C-16), 18.9 (CH3, C-16), 18.8 (CH3, C-17×2), 15.1 (CH3, C-12), 11.8 (CH3, C-11)。經(jīng)過分析，此化合物由3個(gè)-MeVal、1個(gè)Hmp、2個(gè)Hiv組成，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]，故鑒定化合物5為恩鐮孢菌素H。

化合物6：白色晶體（甲醇），ESI-MS/662.5 [M＋Na]+，分子式C33H57N3O9，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 5.22 (1H, d,= 8.0 Hz, H-8×3), 4.70 (1H, d,= 7.8 Hz, H-2×3), 3.21 (3H, s, 6-NCH3×3), 2.25～2.34 (1H, overlapped, H-3×3), 2.16-2.25 (3H, overlapped, H-9×3), 1.09 (3H, d,= 7.9 Hz, H-4×3), 1.03 (3H, d,= 7.5 Hz, H-11×3), 0.98 (3H, d,= 7.5 Hz, H-10×3), 0.95 (3H, d,= 8.0 Hz, H-5×3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 172.1 (C＝O, C-1×3), 171.7 (C＝O, C-7×3), 76.7 (CH, C-8×3), 63.8 (CH, C-2×3), 33.2 (CH3, C-6×3), 31.4 (CH, C-15×3), 29.4 (CH, C-3×3), 20.7 (CH3, C-4×3), 20.4 (CH3, C-5×3), 19.0 (CH3, C-10×3), 18.8 (CH3, C-11×3)。經(jīng)過分析，此化合物由3個(gè)-MeVal，3個(gè)Hiv組成。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]，故鑒定化合物6為恩鐮孢菌素B。

3.3 細(xì)胞毒活性測試

測試化合物1～6對HepG2細(xì)胞、A549細(xì)胞、Hela細(xì)胞、HCT116細(xì)胞共4種腫瘤細(xì)胞及人正常肝細(xì)胞L02的細(xì)胞毒活性。結(jié)果表明，化合物1～4均對HepG2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞顯現(xiàn)出一定的抑制活性（IC50＜10 μmol/L），且對于HepG2細(xì)胞的活性均優(yōu)于陽性藥蘇尼替尼；化合物2～4于HCT116細(xì)胞有一定的抑制活性，且活性均優(yōu)于蘇尼替尼；化合物2對于HeLa細(xì)胞的抑制活性也優(yōu)于蘇尼替尼（表2）。

3.4 NPC1L1蛋白活性測試

使用SPR技術(shù)測試6種化合物進(jìn)行與固定化NPC1L1蛋白的相互作用，結(jié)果顯示化合物2（白僵菌素）與化合物4（恩鐮孢菌素MK1688）在20 μmol/L濃度下與NPC1L1蛋白能夠相互結(jié)合并存在分子互作（圖5），因此白僵菌素和恩鐮孢菌素MK1688可能為具有開發(fā)為膽固醇吸收抑制劑的潛力。

表2 化合物1～6對4種腫瘤細(xì)胞及L02細(xì)胞半數(shù)抑制濃度

Table 2 IC50 values of compounds 1—6 on four tumor cells and L02 cells

化合物IC50/(μmol·L?1) HepG2細(xì)胞A549細(xì)胞HeLa細(xì)胞HCT116細(xì)胞L02細(xì)胞 1 5.87±0.2211.62±1.06 9.21±0.1820.93±1.83 8.78±0.15 2 6.20±0.1810.29±0.58 3.95±0.04 4.93±0.14 5.43±0.14 3 7.41±0.5412.25±1.60 7.11±1.39 5.20±0.32 4.38±0.34 4 7.24±0.3513.51±0.61 7.02±0.22 8.03±0.52 6.47±0.25 520.62±0.4232.12±1.9413.68±0.3413.67±0.19 9.07±1.08 649.39±6.28＞50＞5024.87±5.29＞50 蘇尼替尼 8.24±0.34 8.95±0.82 4.12±0.46 9.99±0.2512.91±0.02 阿霉素 0.34±0.04 2.52±0.24 0.07±0.01 1.67±0.34 1.19±0.12

A-化合物2與固定化NPC1L1蛋白的相互作用 B-化合物4與固定化NPC1L1蛋白的相互作用

4 討論

植物內(nèi)生真菌是中草藥研究的一個(gè)重要研究方向。本研究從落花生根內(nèi)生真菌LHS-P1-3中分離得到6種化合物，均為環(huán)狀三羧酸肽類結(jié)構(gòu)化合物，其中化合物1為新結(jié)構(gòu)化合物?；衔?～5均表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性?；衔?即白僵菌素曾被發(fā)現(xiàn)具有多種生物活性，如對人類、動物和植物的多種致病細(xì)菌、病毒有抑制作用，且其抗腫瘤活性也曾多次被報(bào)道，而其抗腫瘤活性可能與其破壞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有關(guān)[23]，本研究發(fā)現(xiàn)白僵菌素對于HepG2、HeLa和HCT116細(xì)胞的體外抑制活性優(yōu)于蘇尼替尼。恩鐮孢菌素I（3）、恩鐮孢菌素MK1688（4）及恩鐮孢菌素H（5）也曾被報(bào)道有抗菌、抗體外HIV-1病毒及抗腫瘤作用[24]，本研究發(fā)現(xiàn)化合物3和4對于HepG2及HCT116細(xì)胞的體外抑制活性也優(yōu)于蘇尼替尼。恩鐮孢菌素B（6）針對本研究中的4種腫瘤細(xì)胞來說，抗腫瘤活性明顯弱于化合物1～5，這可能與其取代基中的結(jié)構(gòu)改變而影響與作用靶點(diǎn)的相互作用進(jìn)而影響了細(xì)胞毒活性有關(guān)。

NPC1L1蛋白在腸道膽固醇吸收中起核心作用，抑制NPC1L1蛋白可減少人體對膽固醇的吸收，從而降低罹患心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。本研究首次發(fā)現(xiàn)環(huán)狀三羧酸肽類結(jié)構(gòu)白僵菌素（2）與恩鐮孢菌素MK1688（4）能與NPC1L1蛋白結(jié)合并存在相互作用，可能為NPC1L1蛋白的潛在抑制劑，具有開發(fā)為膽固醇吸收抑制劑的潛力。

本研究拓展了對于植物內(nèi)生真菌次級代謝研究的豐富度，對藥用植物落花生根內(nèi)生真菌的次生代謝進(jìn)行研究，也為環(huán)狀三羧酸肽類結(jié)構(gòu)化合物的生物活性探索研究提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Enniatins of endophytic fungusLHS-P1-3 fromand their bioactivities

ZHOU Li-man, SUN Jian, PAN Liu-ting, GUO Meng-fei, TANG Yun-wen, WANG Cong, XU Hai-tang, KONG Fan-dong

Key Laboratory of universities in Guangxi for Excavation and Development of ancient ethnomedicinal recipes, Guangxi Collaborative Innovation Center for Chemistry and Engineering of Forest Products, Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, State Ethnic Affairs Commission, School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi Minzu University, Nanning 530006, China

To study the secondary metabolites and biological activities of the endophytic fungusLHS-P1-3 fromroots.The crude metabolite was separated and purified by silica gel chromatography and high performance liquid chromatography. The structure of the compounds was determined by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. The inhibitory activity of the compounds on the proliferation of several tumor cells was tested by cell technology kit-8 (CCK-8). The interaction between compounds and niemann-pick c1-like 1(NPC1L1) protein was investigated by surface plasmon resonance (SPR) experiment.A total of six compounds were isolated from the endophytic fungusLHS-P1-3. There was one new compound enniatin W (1), and five known compounds beauverine (2), enniatin I (3), enniatin MK1688 (4), enniatin H (5) and enniatin B (6). Compounds 1—4 exhibited IC50values of less than 10 μmol/L on HepG2 and Hela cells, and compounds 2—4 alsoinhibited HCT116 activity with IC50values less than 10 μmol/L. SPR study demonsrated that compounds 2 and 4 could interact with NPC1L1 protein at a concentration of 20 μmol/L.Compound 1 was a new enniatin benzaldehyde named enniatin W. Compounds 1—5 exhibited strong antitumor activity. Compounds 2 and 4 can interact with NPC1L1 protein and may be potential inhibitors of NPC1L1 protein.

L.;LHS-P1-3; enniatin; beauverine; cytotoxic activity; NPC1L1 protein

R284.1

A

0253 - 2670(2023)17 - 5473 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.001

2023-03-10

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021GXNSFBA220040）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021GXNSFBA075036）；國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（82104034）；廣西民族大學(xué)校級引進(jìn)人才科研啟動項(xiàng)目（2020KJQD09，2021KJQD09）；廣西民族大學(xué)相思湖青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2021RSCXSHQN01）；廣西民族大學(xué)研究生創(chuàng)新計(jì)劃（gxun-chxs2022086）

周麗曼，女，博士，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail: zhouliman88@126.com

許海棠，碩士，高級實(shí)驗(yàn)員，研究方向天然藥物提取及開發(fā)。Tel: 15078888280 E-mail: xhthellen@163.com

孔凡棟，男，博士，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail: kongfandong0127@126.com

[責(zé)任編輯 王文倩]