天門冬總黃酮的提取工藝與抗氧化性研究*

張貴川

（四川衛(wèi)生康復(fù)職業(yè)學(xué)院，四川自貢 643000）

天門冬（Asparagus cochinchinensis）為百合科天門冬屬植物，分布于我國秦嶺以南各省份，具有養(yǎng)陰潤燥、清肺生津功效，其含有多糖、黃酮和皂苷等多種營養(yǎng)物質(zhì)，特別是以5,7-二羥基-6,8,4-三甲氧基黃酮為代表的黃酮類化合物是其主要成分之一[1，2]。黃酮類化合物以2-苯基色原酮為基本母核，結(jié)構(gòu)中存在較多的酚羥基和羰基，具有較好的還原性，常被用于自由基清除的抗氧化性研究[3]，如張麗君等[4]研究發(fā)現(xiàn)石榴皮黃酮對(duì)DPPH 自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）與超氧陰離子自由基的清除作用優(yōu)于Vc；米智等[5]研究表明黃花菜黃酮對(duì)DPPH·與ABTS 自由基均有較強(qiáng)的清除作用。由于目前暫未公開報(bào)道天門冬黃酮類化合物的提取工藝及抗氧化活性，而超聲波輔助提取法操作簡便、快速，提取效率較高，可避免高溫對(duì)活性成分的破壞，已被廣泛用于天然產(chǎn)物的提取分離[6，7]。因此，本研究通過單因素與正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化天門冬黃酮化合物的最佳超聲提取工藝條件后，采用體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)該黃酮提取物的抗氧化活性，以期為天門冬資源的開發(fā)與利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

天門冬干燥塊莖購于成都藥材批發(fā)市場；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（92.2% 中國藥品生物制品檢定所）；水楊酸、FeSO4、H2O2、Al（OH）3、NaNO2、NaOH、無水乙醇、三（羥甲基）氨基甲烷，均為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、Vc，均為分析純，上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州金壇宏華儀器廠）；ME204E 型電子分析天平（梅特勒-托利多有限公司）；KQ-600KDB 型超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司）；L550 型低速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FD-1B-50 型冷凍干燥器（江蘇天翎儀器有限公司）；722 型紫外-可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 天門冬黃酮提取操作 將干燥的天門冬塊根完全粉碎后，過60 目篩，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的天門冬粉末置于一定濃度與體積的乙醇溶液中，在適宜的溫度下于80W 的超聲功率中提取一段時(shí)間后，測定提取產(chǎn)物中黃酮含量。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定提取產(chǎn)物中黃酮含量[8]，具體如下：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，配制成0.1mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液后，精密量取1、2、3、5、6 mL 至10mL 容量瓶內(nèi)，各加入5%NaNO20.2mL 靜置5min 后，再加入10%Al（NO3）30.2mL，靜置5min 后，繼續(xù)加入4%NaOH 溶液2mL 搖勻，再加入蒸餾水定容搖勻。以試劑空白作參比溶液，于508nm 波長測定吸光度，并以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，該回歸方程為Y=12.51X+0.05，r = 0.9995，表明在0.01~0.06mg·mL-1范圍內(nèi)，吸光度值與濃度呈良好的線性關(guān)系。按照上述實(shí)驗(yàn)條件，測定不同提取物的吸光度后，根據(jù)回歸方程測得不同樣品的黃酮含量。

黃酮含量/%=C×V×D/W×100%（1）式中 C：待測樣品溶液的黃酮濃度，mg·mL-1；D：稀釋倍數(shù)；V：樣品溶液體積，mL；W：待測樣品的質(zhì)量，mg。

1.3.3 提取工藝條件

1.3.3.1 料液比 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定提取溶劑濃度為75%、提取溫度為45℃、提取時(shí)間為2.5h，考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 和1∶50（g∶mL）對(duì)提取物中黃酮含量的影響。

1.3.3.2 提取溶劑濃度 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定料液比為1∶30（g∶mL）、提取溫度為45℃、提取時(shí)間為2.5h，考察提取溶劑乙醇濃度55%、65%、75%、85%和95%對(duì)提取物中黃酮含量的影響。

1.3.3.3 提取溫度 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定料液比為1∶30（g∶mL）、提取溶劑濃度為75%、提取時(shí)間為2.5h，考察提取溫度為25、35、45、55 和65℃對(duì)提取物中黃酮含量的影響。

1.3.3.4 提取時(shí)間 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定料液比為1∶30（g∶mL）、提取溶劑濃度為75%、提取溫度為45℃，考察提取時(shí)間為1.5、2、2.5、3、3.5h 對(duì)提取物中黃酮含量的影響。

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)以確定超聲輔助提取天門冬黃酮類化合物的最佳工藝條件，具體考察因素與水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab．1 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH·清除率的測定 采用75%乙醇溶液配制不同濃度的天門冬黃酮提取液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg·mL-1） 后，分別向5 支試管中各加入1.0mL，另外每支各加入0.2mmol·L-1DPPH 溶液2mL，再加入2mL 無水乙醇，混勻后置于暗處30min后，于517nm 處測定溶液吸光度，記為As，另用蒸餾水代替DPPH·溶液，同法操作，測得的吸光度記為A0，同時(shí)以去離子水代替樣品，同法操作，測得的吸光度記為Ab，通過式（2）計(jì)算不同物質(zhì)對(duì)DPPH·的清除率。所有結(jié)果均平行測定3 次，另以VC作陽性對(duì)照，并比較不同物質(zhì)對(duì)DPPH·的半數(shù)清除率（IC50）[9]。

1.3.5.2 ·OH 清除率的測定 移取上述相同5 種質(zhì)量濃度的天門冬黃酮提取液各1.0mL 分別至5 支試管中，另加入9mmol·L-1FeSO4溶液1mL 和9mmol·L-1水楊酸乙醇溶液1mL，混勻后繼續(xù)加入8.8mmol·L-1H2O21.0mL，置于35℃反應(yīng)30min 后，于510nm 處測定溶液吸光度，記為As。另用蒸餾水代替H2O2，同法操作，測得的吸光度記為A0，同時(shí)以去離子水代替樣品，同法操作，測得的吸光度記為Ab，通過式（2）計(jì)算不同物質(zhì)對(duì)·OH 的清除率。所有結(jié)果均平行測定3 次，另以VC作陽性對(duì)照，并比較不同物質(zhì)對(duì)·OH的半數(shù)清除率（IC50）[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 料液比對(duì)提取物中黃酮含量的影響

圖1為不同料液比對(duì)提取物中黃酮含量的影響。

圖1 料液比對(duì)提取物中總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of solid - liquid ratio on content of total flavonoids in extract

由圖1 可見，隨著料液比的提高，提取物中黃酮的含量先增大后減小，當(dāng)料液比為1∶30（g∶mL）時(shí)，提取物中黃酮含量達(dá)到最大值。提取溶劑用量的增多，有助于天門冬中黃酮化合物游離至提取溶液內(nèi)，但隨著提取溶劑用量的繼續(xù)增多，溶于乙醇的其它組分也易游離至溶劑內(nèi)。因此，選擇料液比1∶20、1∶30、1∶40（g∶mL）作為正交實(shí)驗(yàn)因素考察水平。

2.2 乙醇濃度對(duì)提取物中黃酮含量的影響

圖2為不同乙醇濃度對(duì)提取物中黃酮含量的影響。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取物中總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on content of total flavonoids in extract

由圖2 可見，隨著提取溶劑乙醇濃度的增大，提取產(chǎn)物中黃酮的含量先增大后減小，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到75%時(shí)，提取物中黃酮含量達(dá)到最高值。這可能歸因于乙醇濃度越高，提取溶劑的極性越小，而天門冬黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在較多的酚羥基，具有一定的極性，若乙醇溶度過高，一方面黃酮化合物難以溶出，另一方面其它脂溶性雜質(zhì)的游離量增多，造成產(chǎn)物中黃酮的含量下降。因此，選擇乙醇濃度65%、75%和85%作為正交實(shí)驗(yàn)因素考察水平。

2.3 超聲溫度對(duì)提取物中黃酮含量的影響

圖3為超聲溫度對(duì)提取物中黃酮含量的影響。

圖3 超聲溫度對(duì)提取物中總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on content of total flavonoids in extract

由圖3 可見，提取物中黃酮含量隨著溫度的升高逐漸增大，在45℃后呈下降趨勢。超聲溫度越高使得溶液體系中分子運(yùn)動(dòng)越劇烈，從而可增強(qiáng)黃酮化合物與溶劑的相互作用程度，進(jìn)而有利于其游離至溶劑內(nèi)，但溫度過高，可能會(huì)造成天門冬黃酮類化合物的氧化或分解，從而使得其含量下降。為此，選擇超聲提取溫度35、45 和55℃作為正交實(shí)驗(yàn)因素考察水平。

2.4 超聲時(shí)間對(duì)提取物中黃酮含量的影響

圖4為超聲時(shí)間對(duì)提取物中黃酮含量的影響。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)提取物中總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on content of total flavonoids in extract

由圖4 可見，在1.5 ~ 2.5 h 內(nèi)，提取物中黃酮含量隨著超聲時(shí)間的延長而增大，當(dāng)超聲時(shí)間延長至2.5h 時(shí)，提取物中黃酮含量達(dá)到最高，隨后逐漸降低。較長的超聲時(shí)間不僅容易產(chǎn)生熱效應(yīng)，致使黃酮類物質(zhì)發(fā)生氧化或分解反應(yīng)而被破壞，同時(shí)可使提取物中的不溶物、黏液質(zhì)等雜質(zhì)游離至提取液中，從而降低提取物中黃酮的含量[11]，因此，選擇提取時(shí)間2、2.5、3h 作為正交實(shí)驗(yàn)因素考察水平。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取天門冬黃酮的提取條件，結(jié)果與分析見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．2 Results of orthogonal experiment

由表2 可見，3 個(gè)因素對(duì)提取物中黃酮含量的影響順序依次為乙醇濃度>超聲時(shí)間>料液比>超聲溫度，確定的最佳組合均為A2B3C1D3，即料液比為1∶30（g∶mL），乙醇濃度為85%，超聲溫度為35℃，超聲時(shí)間為3h。在該最佳提取條件下，提取物中黃酮含量為10.6%，均高于正交實(shí)驗(yàn)各實(shí)驗(yàn)組結(jié)果。

2.6 抗氧化活性

2.6.1 天門冬黃酮提取物對(duì)DPPH·的清除作用

圖5為不同物質(zhì)對(duì)DPPH·的清除作用比較。

圖5 不同物質(zhì)對(duì)DPPH·的清除作用Fig.5 Scavenging effect of DPPH·on different sample

由圖5 可見，隨著天門冬黃酮提取物濃度的增大，DPPH·的清除率逐漸升高，IC50值為1.04mg·mL-1，表明天門冬黃酮提取物具有一定清除DPPH·的能力。這歸因于黃酮類化合物的抗氧化能力與其結(jié)構(gòu)中酚羥基的數(shù)量有關(guān)，而天門冬黃酮類化合物以5,7-二羥基-6,8,4-三甲氧基黃酮為主，具有的酚羥基數(shù)量較多[12]，因此，具有良好的抗氧化活性。

2.6.2 天門冬黃酮提取物對(duì)·OH 的清除作用

圖6為不同物質(zhì)對(duì)·OH 的清除作用比較。

圖6 不同物質(zhì)對(duì)·OH 的清除作用Fig.6 Scavenging effect of·OH on different sample

由圖6 可見，隨著天門冬黃酮提取物濃度的增大，其對(duì)·OH 的清除率越來越高，IC50值為1.18mg·mL-1，表明天門冬黃酮提取物對(duì)·OH 具有一定的清除作用。由于天門冬黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)，可與·OH 形成穩(wěn)定的半醌式自由基結(jié)構(gòu)，能夠終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行[13]，從而表現(xiàn)出良好的清除能力。

3 結(jié)論

本研究以天門冬作為提取原料，利用超聲輔助法提取其黃酮類化合物。通過單因素與正交實(shí)驗(yàn)確定該提取工藝最佳條件為：料液比為1∶30（g∶mL），乙醇濃度為85%，超聲溫度為35℃，超聲時(shí)間為3h，總黃酮提取率可達(dá)10.6%，另外發(fā)現(xiàn)該黃酮提取物對(duì)DPPH·與·OH 的IC50分別為1.04mg·mL-1與1.18mg·mL-1，表明其具有良好的DPPH·與·OH 清除能力。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為天門冬黃酮化合物的提取及后續(xù)相關(guān)資源的開發(fā)與利用提供參考與借鑒。