地龍藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 的含量檢測*

李正剛，程 焱，王丹彧，趙 艷，馬 彧

（1.四平市食品藥品檢驗所，吉林四平 136000；2.吉林省藥品檢驗研究院，吉林長春 130000）

黃曲霉毒素主要包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，是目前已知最強致癌物之一[1]。其毒性遠高于氰化物、重金屬及有害元素等，對人類健康危害極大[2，3]。當(dāng)微量持續(xù)攝入，可造成慢性中毒、生長障礙，引起纖維性病變，致使纖維組織增生。當(dāng)攝入量大時，可發(fā)生急性中毒，出現(xiàn)急性肝炎、出血性壞死、肝細胞脂肪變性和膽管增生[4，5]。

根據(jù)被檢測樣品的基質(zhì)性質(zhì)、檢測儀器設(shè)備情況以及檢測時限要求等，黃曲霉毒素有多種檢測分析方法，包括酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、膠體金快速定量法、實時熒光PCR 方法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[6，7]，但以上方法均需要多種分析試劑及儀器，操作復(fù)雜，并且如質(zhì)譜分析儀器多為進口國外產(chǎn)品，價格較為昂貴，因此，開發(fā)更加簡便快捷、低成本的方法仍然是現(xiàn)階段分析工作者需要努力解決的問題。

地龍為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓或櫛盲環(huán)毛蚓的干燥體。具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿的功效。前3 種習(xí)稱“廣地龍”，后1 種習(xí)稱“滬地龍”。臨床常用于高熱神昏、驚癇抽搐、關(guān)節(jié)痹痛、肢體麻木、半身不遂、肺熱喘咳、水腫尿少等病癥的治療。地龍保存不當(dāng)非常容易出現(xiàn)黃曲霉毒素超標(biāo)。本文建立了超聲提取-免疫親和柱凈化-柱后光化學(xué)衍生，高效液相色譜-熒光檢測法進行多產(chǎn)地、多批次地龍藥材中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量測定。經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，所用儀器簡單，可用于地龍中黃曲霉毒素含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器

Agilent LC1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Agilent LC1260II 型熒光檢測器（美國安捷倫科技有限公司）；KRC-25 型光化學(xué)柱后衍生器（青島普瑞邦生物工程有限公司）；KQ-350VDB 型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；Pribo Fast IAC 免疫親和柱（青島普瑞邦生物科技有限公司）。

1.2 藥材和試劑

黃曲霉毒素（AF）混合對照品溶液（B1、B2、G1、G2標(biāo)示濃度分別為1.04μg·mL-1、0.38μg·mL-1、1.08μg·mL-1、0.38μg·mL-1），批號：610001-202006，來源為中國食品藥品檢定研究院。

NaCl（AR 上海國藥化學(xué)試劑公司）；甲醇（色譜純美國賽默飛世爾科技有限公司）；實驗用水為超純水。

本次收集到不同產(chǎn)地和批次的地龍藥材共10批，基本信息見表1。

表1 地龍藥材樣品基本信息Tab.1 Basic information of Pheretima samples

1.3 儀器工作條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，50×4.6mm）；流動相：甲醇-乙腈-水（40∶18∶42）；流速為1.0mL·min-1；柱溫為25℃；柱后光化學(xué)衍生波長為254nm；熒光檢測器檢測，激發(fā)波長λex=360nm，發(fā)射波長λex=450nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密量取AF 混合對照品溶液0.5mL, 置10mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，作為儲備溶液。精密量取儲備溶液1mL，置25mL 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，即得。

1.5 樣品溶液制備

樣品粉碎過120 目篩網(wǎng)，取供試品粉末約5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入NaCl 3g,精密加入70%甲醇溶液75mL，超聲30min，4500r·min-1離心5min，精密量取上清液15mL，置50mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，4500r·min-1離心10min，精密量取續(xù)濾液10.0mL，通過免疫親和柱，流速3mL·min-1，再用20mL 水洗脫，棄去洗脫液，使空氣進入免疫親和柱，將水?dāng)D出，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方式

樣品的提取方式有多種多樣，需要根據(jù)樣品的具體基質(zhì)情況進行處理，不同基質(zhì)，如動物藥和植物藥的基質(zhì)有很大差別，則提取的方式也不同。同時測定方法的選擇也要根據(jù)實驗室的儀器設(shè)備情況來選擇。本次實驗采用超聲提取法，離心過濾后，經(jīng)過免疫親和柱凈化，液相色譜分離后，再經(jīng)光化學(xué)衍生，熒光檢測器檢測。經(jīng)方法學(xué)驗證，方法的專屬性、重復(fù)性、回收率均滿足要求。且方法所用儀器簡單，適合大批量樣品的檢驗檢測及分析[8-10]。

2.2 色譜圖

分別精密吸取“1.4”項下混合對照品溶液5、10、15、20、25μL，注入液相色譜儀。另精密吸取“1.5”項下供試品溶液20μL，注入液相色譜儀。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且無雜質(zhì)干擾峰，結(jié)果見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 的色譜圖Fig.1 Chromatograms of aflatoxin of AF B1、B2、G1、G2

2.3 線性范圍和檢出限

分別精密吸取“1.4”項下混合對照品溶液5、10、15、20、25μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣量（ng）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取不含AF 的樣品5g，加入適當(dāng)稀釋的AF 混合對照品溶液，同供試品溶液制備、測定，以信噪比（S/N）為3 作為4 種黃曲霉毒素的檢出限（LOD），結(jié)果見表2。表明方法的線性關(guān)系較好，靈敏度均滿足要求。

表2 回歸方程、線性范圍、檢出限Tab.2 Regression equation, linear range and detection limit

2.4 穩(wěn)定性實驗

取“1.4”項下對照品溶液，分別于0、4、8、16、18、24h 按“1.3”色譜條件進樣10μL，記錄所測各組分峰面積，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2峰面積的RSD（n=6）分別為3.1%、2.5%、2.5%、2.8%，結(jié)果表明，對照品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性實驗

取供試品（樣品編號：DL7）粉末約5g，精密稱定6 份，按“1.5”供試品溶液制備方法操作，按“1.3”色譜條件進樣10μL，進行測定。結(jié)果6 份樣品中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2含量的RSD（n=6） 分別為2.5%、2.1%、2.3%、2.5%，結(jié)果表明，方法的重復(fù)性較好。

2.6 回收率實驗

精密稱取6 份不含AF 的供試品（樣品編號：DL1）粉末約5g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入黃曲霉毒素混合對照品儲備液25μL，按“1.5”供試品溶液制備方法操作，按“1.3”色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表3，表明方法的準(zhǔn)確性較好。

表3 回收率實驗結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery rate test（n=6）

2.7 樣品測定

本次共收集到10 批次地龍藥材，每份樣品平行取樣，測定結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果（μg·kg-1，n=2）Tab．4 Sample determination results（μg·kg-1，n=2）

由表4 可見，10 批樣品中有8 批未檢出AF，其它2 批檢出AF，且4 種AF 均有檢出，有1 批樣品中的AF 總含量超出《中國藥典》2020 年版（一部）中藥材中AF 總含量不大于10μg·kg-1的限量規(guī)定。

3 結(jié)論

采用超聲萃取-免疫親和柱凈化-柱后光化學(xué)衍生法對樣品進行提取凈化，并結(jié)合高效液相色譜熒光檢測技術(shù)，建立了地龍中4 種黃曲霉毒素的快速測定方法。該方法操作簡便，所用設(shè)備簡單，檢測效率高，可以實現(xiàn)批量樣品的快速提取。且方法準(zhǔn)確可靠，適用于地龍中黃曲霉毒素定量檢測。特別適合于中小企業(yè)作為內(nèi)部質(zhì)量控制的檢測方法。