HPLC 法測定復方鮮竹瀝液中南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷的含量*

肖小武，潘 蕾，林凱鵬，付輝政，周志強

（江西省藥品檢驗檢測研究院江西省藥品與醫(yī)療器械質量工程技術研究中心國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西南昌 330029）

復方鮮竹瀝液具有清熱化痰、止咳的功效，臨床上主要用于痰熱咳嗽、痰黃黏稠等，處方是由鮮竹瀝、魚腥草、生半夏、生姜、枇杷葉，桔梗以及薄荷素油組成，方中鮮竹瀝為君藥，占比40%[1-3]。復方鮮竹瀝液現(xiàn)行質量標準收載在《中國藥典》2020 年版（一部），標準中僅對魚腥草、枇杷葉以及桔梗3 味藥進行了鑒別控制，并未對占處方量最大的君藥鮮竹瀝進行控制[4]，且收載在《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》（1992 版）的鮮竹瀝質量標準也僅有性狀、以酪氨酸為對照的薄層色譜鑒別及pH 值等檢查項[5]。上述標準控制技術水平較低，標準落后，均難以有效控制產品的質量，直接影響鮮竹瀝及其復方制劑臨床用藥的有效性和安全性。南燭木樹脂酚-3α-O-βd-葡萄糖苷是課題組在鮮竹瀝中提取分離出的指標成分[6-8]，且也為竹子中的成分[9，10]。據(jù)課題組調研得知，市場上鮮竹瀝工藝混亂，存在嚴重價格倒掛現(xiàn)象。因此，建立鮮竹瀝及其復方制劑中指標成分南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷的質量控制項目可保證鮮竹瀝的來源真實性。本實驗在課題組前期研究基礎上參考文獻[ 11，12 ]建立了復方鮮竹瀝液中指標成分南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷的含量的HPLC 測定方法，可為復方鮮竹瀝液的質量標準研究以及質量評價提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260II 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Sartorius BSA 124S-CW 型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；C apcell pak C18柱（250mm×4.6mm×5μm,資生堂）。

南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷為實驗室自制，且經標化純度為98.2%。復方鮮竹瀝液來自生產、流通以及使用環(huán)節(jié)的市場抽樣，覆蓋了市場上全部在生產的5 家生產企業(yè)。陰性樣品為按照復方鮮竹瀝液生產工藝制備不含鮮竹瀝的陰性樣品。

乙腈（色譜純迪馬科技有限公司）；H3PO4、甲醇、正丁醇，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為資生堂capcell pak C18（250mm×4.6mm×5μm）, 以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B,按表1 中的規(guī)定進行梯度洗脫；流速為1mL·min-1；柱溫為30℃,進樣量為10μL,檢測波長為220nm。

表1 流動相洗脫程序Tab.1 Mobile phase elution procedure

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷14.15mg，置于25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品母液；精密吸取上述溶液5mL 置于50mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品50mL，用水飽和的正丁醇振搖提取4 次，每次50mL,合并正丁醇提取液，蒸干，殘渣加入甲醇，溶解后轉移至25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.4 陰性樣品溶液的制備 按照處方工藝，制備不含鮮竹瀝藥材的陰性樣品，按照1.2.3 項下供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2 結果與討論

2.1 前處理方法的確定

本實驗最初考察了未經處理的原液進樣測定，但因基質復雜難以分離，且樣品含糖量較高，對色譜柱損傷較大。因此，實驗考察了乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取以及大孔樹脂柱層析等前處理方式，結果發(fā)現(xiàn)，用同比體積水飽和的正丁醇萃取4 次的方法簡單、方便且準確度高，故實驗采用水飽和的正丁醇萃取的前處理方法。

2.2 檢測波長的確定

取對照品溶液用DAD 檢測器對（+）-南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-吡喃葡萄糖苷對照品與樣品溶液中與（+）-南燭木樹脂酚-3α-O-β-d 吡喃葡萄糖苷對照品相應位置上色譜峰在400～200nm 波長范圍內進行光譜掃描，結果顯示，（+）-南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-吡喃葡萄糖苷在210nm 波長處有最大吸收。由于210nm 處于末端吸收，干擾較大，故選擇220nm 作為檢測波長。

2.3 專屬性實驗考察

取對照品、供試品以及陰性樣品溶液按照1.2.1條件進行測定，結果對照品與供試品溶液中南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷色譜峰理論塔板數(shù)均大于5000，且復方鮮竹瀝液中其他成分對南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷色譜峰無干擾（圖1），表明方法的專屬性強。

圖1 專屬性實驗色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of specificity test

2.4 線性關系考察

精密吸取上述對照品母液10、15、20μL 以及對照品溶液2、5μL 注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，以進樣量為橫坐標進行回歸計算并繪制標準曲線，南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷的回歸方程為Y=6090.7X+283.79，R2=0.9999,說明南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷在0.2264~11.32μg·mL-1之間線性關系良好。

2.5 精密度實驗

精密吸取對照品溶液，注入液相色譜儀，連續(xù)測定6 次，結果對照品峰面積RSD 為0.43%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性實驗

取本品（S1）6 份，依照1.2 實驗方法制備供試品溶液并進行測定，結果供試品溶液中南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷含量平均值為22.78μg·mL-1，RSD 為1.67%，結果表明，該方法具有較好的重復性。

2.7 穩(wěn)定性實驗

取本品（S1）1 份，依照1.2 實驗方法制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、18、24h 進行測定，結果南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷峰面積的RSD 為1.09%，表明南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷峰在24h 內穩(wěn)定性較好。

2.8 加標回收實驗

采用加樣回收實驗，精密量取已知含量的本品（S1）25mL, 按相對于本品的80%、100%、120% 3 個含量比例精密添加南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷對照品溶液，按“1.2.3”項下供試品溶液制備方法制備，并照“1.2.1”項下條件測定，計算回收率，結果見表2。

表2 加標回收率實驗結果Tab.2 Result of recovery experiments

由表2 可見，南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷的平均回收率為97.06%，RSD 為1.08%。表明方法回收率良好。

2.9 實際樣品測定

按上述擬定的方法，對收集樣品中南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷的含量進行測定，結果發(fā)現(xiàn)，D 企業(yè)的6 批次樣品南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-吡喃葡萄糖的含量遠高于其他4 家企業(yè)。根據(jù)課題組調研得知，因鮮竹瀝溫度等生產工藝參數(shù)不固定，導致其成分含量差別較大，且該企業(yè)投料的鮮竹瀝來源不同于其他4 家生產企業(yè)，故其含量明顯偏高。結果見表3。

表3 樣品測定結果（n=4）Tab.3 Result of sample test

由表3 可見，同時采用該方法對市場上在生產的5 家企業(yè)的多批次樣品中南燭木樹脂酚-3α-Oβ-d-葡萄糖苷含量進行測定，從樣品測定結果可知其含量范圍為16.97~84.65μg·mL-1，平均含量為34.43μg·mL-1，考慮到鮮竹瀝生產工藝差異等，故擬定其限度以平均值的70%計，即34.43*70%=24μg·-1mL，暫定本品每1ml 含南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-吡喃葡萄糖不得少于24μg。

3 結論

本研究選擇鮮竹瀝中指標成分南燭木樹脂酚-3α-O-β-d-葡萄糖苷并采用高效液相色譜法進行含量測定，通過對實驗方法的方法學考察，結果表明，該方法專屬性強、準確穩(wěn)定，可為復方鮮竹瀝液以及其他含鮮竹瀝的復方制劑質量標準研究、質量控制與評價提供實驗依據(jù)和參考。