5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體的制備工藝研究*

羅國平，任婉婷，閆夢茹，孟會寧

（1.西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西西安 710021；2.山東步長醫(yī)藥銷售有限公司，山東菏澤 274418）

光動力療法（PDT）是運用特定波長的光來激發(fā)光敏藥物，使其發(fā)生一定的光化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致機體細胞或分子發(fā)生形態(tài)及機能的改變，從而達到的診斷或治療作用[1]。5-氨基乙酰丙酸，又名5-氨基酮戊酸，目前市面上銷售的該產(chǎn)品大多以鹽酸鹽（5-ALA）的形式存在，屬于第二代光敏劑，可用于治療痤瘡、尖銳濕疣、銀屑病、鮮紅斑痣等皮膚疾病[2]，其作用的機理為：5-ALA 經(jīng)皮給藥后，能被病變細胞選擇性的吸收并大量積蓄于該類細胞中，然后進一步轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂泻軓姽饷艋钚缘脑策鳬X（Pp IX），在一定波長光的激發(fā)下，產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧，單線態(tài)氧可使病變細胞壞死，從而達到治療疾病的目的。

研究發(fā)現(xiàn)，5-ALA 在應(yīng)用時也存在一些問題，如穩(wěn)定性差[3]，尤其在堿性條件下；極性較大導(dǎo)致皮膚滲透性不好，難以到達皮膚深層，在外用制劑方面存在一定的限制。為此，本實驗將5-ALA 采用熱敏醇質(zhì)體進行包載，熱敏醇質(zhì)體是一種新型醇質(zhì)體[4，5]，其作用有：（1）可將5-ALA 封閉在類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)的水相中，提高藥物穩(wěn)定性[3，6]；（2）醇質(zhì)體[7]具有較好的變形性，能提高5-ALA 的透皮性能；（3）光動力-熱敏醇質(zhì)體由相變溫度（Tm）稍高于體溫的脂膜磷脂構(gòu)成[8]，用波長為635nm 的紅光照射患處，紅光的熱效應(yīng)會使患處局部溫度升高，當(dāng)超過熱敏醇質(zhì)體的相變溫度時，醇質(zhì)體會釋放出5-ALA，產(chǎn)生相應(yīng)的治療作用。本文主要研究5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體的制備工藝并進行藥劑學(xué)性質(zhì)評價[9]。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽原料藥（99% 上海麥克林生化科技有限公司）；膽固醇（東巨榮生物工程有限公司）；大豆卵磷脂（藥用）；無水乙醇、1,2-丙二醇，分析純，天津永晟精細化工有限公司；KH2PO4、NaH2PO4、H3PO4，均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；石油醚（色譜純天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；NaOH（AR 天津市化學(xué)試劑公司）。

DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Agilent Tech.1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；TG-1650-WS 型臺式高速離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；SB-5200DT 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BT125D 型電子天平（賽多斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；ZEN-3600Malvern 型馬爾文激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體的制備 采用乙醇注入-超聲法[10]。精密稱取大豆卵磷脂和膽固醇，置100mL 燒杯中，加一定體積無水乙醇超聲溶解；另在避光條件下，將5-ALA 溶解于一定體積的PBS溶液中，在100r·min-1轉(zhuǎn)速攪拌條件下用注射器緩慢勻速注入到上述乙醇溶液中，繼續(xù)攪拌一定時間，超聲處理（250W，40kHz）一定時間，即得。

1.2.2 熱敏性評價 采用DSC 法進行熱敏性評價。分別取上述制備的5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體，離心，將沉淀真空干燥后置于鋁制坩堝內(nèi)，在體積分數(shù)為99.99%的N2氛圍下，升溫速度為1℃·min-1，于25~50℃范圍內(nèi)檢測樣品的熱量變化。

1.2.3 包封率的測定 取5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體混懸液4mL，15000r·min-1轉(zhuǎn)速高速離心15min，取上清液，用0.45μm 微孔濾膜（水系）過濾，取續(xù)濾液，采用高效液相色譜法測定5-ALA 的濃度，得到游離5-ALA 的濃度（C游），代入式（1）計算包封率（EE%）。

式中 m總：加入藥物的總質(zhì)量，mg；V總：未包封的5-ALA 質(zhì)量，mg。

1.2.4 HPLC 法測定5-ALA 的含量[11]色譜條件：Agilent 5 TC-C18型色譜柱（250mm×4.6mm，5μm；流動相：乙腈∶1.36% KH2PO4溶液（用H3PO4調(diào)pH 值至2.0）=3∶97；柱溫：25℃；波長：265nm；流速：1mL·min-1；進樣體積：20μL。

1.2.5 變形性測定[13]取4mL 5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體混懸液和4mL 水，分別測定在0.8kg 重物的壓力下通過0.45μm 微孔濾膜的性能，按式（2）計算變形性（D）。

式中 V醇質(zhì)體∶光動力-熱敏醇質(zhì)體的通過速度，mL·min-1，；V水：水的通過速度，mL·min-1。

1.2.6 平均粒徑和粒度分布的測定 取制備好的5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體，采用Malvern 激光粒度儀進行檢測。

1.2.7 單因素實驗[13]

1.2.7.1 不同m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）對相變溫度（Tm）和包封率的影響 按照“1.2.1”項下的制備方法加入10mg 5-ALA，乙醇10mL，pH 值為7.4 的PBS 溶液12mL，攪拌20min，超聲2min?？疾靘（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）分別為6∶1、9∶1、12∶1 時，制備的5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體的Tm和包封率的變化情況。

1.2.7.2 不同m（囊材）∶m（藥物）對包封率的影響 按照“1.2.1”項下的制備方法加入大豆卵磷脂240mg，膽固醇40mg，乙醇10mL，pH 值為7.4 的PBS 溶液12mL，攪拌20min，超聲2min?？疾炷也呐c藥物質(zhì)量比分別為35∶1、28∶1、21∶1 時，制備的5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體的包封率的變化情況。

1.2.7.3 溶液pH 值對包封率的影響 按照“1.2.1”項下的制備方法加入大豆卵磷脂240mg，膽固醇40mg，5-ALA 10mg，乙醇10mL，PBS 溶液12mL，攪拌20min，超聲2min。采用pH 梯度法，即在形成醇質(zhì)體前，PBS 溶液的pH 值為3.0，注入法制備醇質(zhì)體后，調(diào)節(jié)溶液的pH 值，考察pH 值分別為3.0、7.4、10.0 時，制備的5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體的包封率的變化情況。

1.2.7.4 攪拌時間對包封率的影響 按照“1.2.1”項下的制備方法加入大豆卵磷脂240mg，膽固醇40mg，5-ALA 10mg，乙醇10mL，PBS 溶液12mL，超聲2min?？疾鞌嚢钑r間分別為10、20、30min 時，制備的5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體的包封率的變化情況。

1.2.7.5 乙醇體積對變形性的影響 按照“1.2.1”項下的制備方法加入大豆卵磷脂240mg，膽固醇40mg，5-ALA 10mg，pH 值為7.4 的PBS 溶液12mL，攪拌20min，超聲2min?？疾煲掖俭w積分別為6、10、14mL 時，制備的5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體的變形性變化情況。

1.2.7.6 超聲時間對粒徑分布系數(shù)（PDI）的影響按照“1.2.1”項下的制備方法加入大豆卵磷脂240mg，膽固醇40mg，5-ALA 10mg，無水乙醇10mL，pH 為7.4的PBS 溶液12mL，攪拌20min，考察超聲時間分別為1、2、4、10min 時，制備的5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體平均粒徑和粒度分布的變化情況。

1.2.8 正交實驗篩選最優(yōu)制備條件[14]在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用正交實驗法，以包封率為評價指標，選擇m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）（A）、m（囊材）∶m（藥物）（B）和攪拌時間（C）3 個因素，每個因素設(shè)置3 個水平進行正交實驗，因素水平見表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and their levels

1.2.9 藥劑學(xué)性質(zhì)評價 按照優(yōu)選出的條件制備5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體，分別采用“1.2.3”項下方法測定包封率，采用“1.2.5”項下方法測定變形性，采用“1.2.6”項下方法測定平均粒徑和粒度分布。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）對相變溫度（Tm）和包封率的影響（圖1、圖2）

圖1 不同m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）制備的醇質(zhì)體DSC 圖Fig.1 DSC diagram of glycosome prepared with different mass ratios of soybean lecithin and cholestero

圖2 不同m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）對包封率的影響Fig.2 Effect of different proportions of soybean lecithin and cholesterol on encapsulation efficiency

由圖1 可見，m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）=12∶1 時，Tm值約為40℃；m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）=9∶1 時，Tm值約為41℃；m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）=6∶1 時，Tm值約為42.5℃?？梢姡琓m值隨著囊材中膽固醇的比例增加略有升高。另外，從圖的形狀可看出，大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比為6∶1 時，相變特性最為明顯。

由圖2 可見，隨著大豆卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比增大，包封率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，但差異不大。

2.1.2 不同m（囊材）∶m（藥物）對包封率的影響（圖3）

圖3 囊材與藥物質(zhì)量比對包封率的影響Fig.3 Effect of different quality ratios of capsule materials and drugs on encapsulation efficiency

由圖3 可見，包封率隨著m（囊材）∶m（藥物）的增大呈先增后降的趨勢，但差異較小。

2.1.3 溶液pH 值對包封率的影響（圖4）

圖4 pH 值對包封率的影響Fig.4 Effect of pH value on encapsulation efficiency

由圖4 可見，包封率隨溶液pH 值的增大而增大，但pH 值為7.4 和10 時的包封率相差不大。分析原因是，采用pH 梯度法制備醇質(zhì)體時，醇質(zhì)體形成之前用HCl 調(diào)節(jié)水溶液的pH 值偏酸性至5-ALA鹽酸鹽等電點以下，采用注入法形成醇質(zhì)體后，再調(diào)節(jié)溶液pH 值至5-ALA 鹽酸鹽等電點以上，結(jié)果醇質(zhì)體內(nèi)水相中藥物主要以解離型存在，而外水相則主要以非解離型存在，由于醇質(zhì)體膜屬于脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，外水相的非解離型藥物可通過被動擴散從膜外進入膜內(nèi)，進入膜內(nèi)的藥物受pH 值的影響轉(zhuǎn)變?yōu)榻怆x型；而膜內(nèi)的解離型藥物無法通過膜向外擴散，因此，醇質(zhì)體中藥物的包封率就會增大?？梢?，pH 梯度法可顯著提高藥物的包封率?？紤]到皮膚用藥的刺激性問題，選取溶液pH 值為7.4。

2.1.4 攪拌時間對包封率的影響（圖5）

圖5 攪拌時間對包封率的影響Fig.5 Effect of mixing time on encapsulation efficiency

由圖5 可見，隨著溶液攪拌時間的增加，包封率持續(xù)增大，但趨勢逐漸減弱。

2.1.5 乙醇體積對變形性的影響（圖6）

圖6 乙醇體積對變形性的影響Fig.6 Effect of ethanol volume on deformability

由圖6 可見，隨著乙醇體積的增大，藥物的變形性逐漸增大，但趨勢逐漸減弱，因此，選擇乙醇體積為10mL。

2.1.6 超聲時間對粒徑分布系數(shù)（PDI）的影響（圖7）

圖7 超聲時間對粒徑分布系數(shù)（PDI）的影響Fig.7 Effect of ultrasound time on PDI

由圖7 可見，隨著超聲時間的延長，PDI 持續(xù)減小，即醇質(zhì)體的粒徑隨超聲時間延長變得更為均勻，但4min 后減小的趨勢顯著變緩，故選擇超聲時間為4min。

2.2 正交實驗篩選最優(yōu)制備條件[10]

正交實驗結(jié)果和直觀分析見表2，方差分析見表3。

表2 正交實驗結(jié)果Tab.2 Design and results of the orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of the analysis of variance

由表2 可見，因素影響由大到小依次為：A>C>B，即m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）>攪拌時間>m（囊材）∶m（藥物）；篩選出的最佳搭配為A2B3C3，即m（大豆卵磷脂）∶m（膽固醇）=9∶1，m（囊材）∶m（藥物）=23.3∶1，攪拌時間為30min。

2.3 最優(yōu)工藝條件制備的5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體的藥劑學(xué)性質(zhì)評價

2.3.1 包封率的測定 測得包封率為69.73%，包封率較高。

2.3.2 變形性的測定 測得變形性為19.15%，變形性較好。

2.3.3 粒度分布的測定（圖8）

圖8 5-ALA 光動力-熱敏醇質(zhì)體的粒徑分布Fig.8 Particle size distribution of 5-ALA photodynamic-thermosensitive electrosol bodies

由圖8 可見，PDI 測得為0.280，平均粒徑為325.4nm，表明醇質(zhì)體的粒徑在納米級別且粒度分布均勻。

3 結(jié)論

本文以大豆卵磷脂和膽固醇為囊材，無水乙醇為柔軟劑，采用乙醇注入-pH 梯度法制備的5-ALA光動力-熱敏醇質(zhì)體藥物的包封率高，具有較好的熱敏性和變形性，粒徑分布均勻。