Caspase-9 蛋白在亞慢性砷染毒大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)研究

秦海霞，韓 菲，戴研平，劉改萍

（1.烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校組胚教研室，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000；2.岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，湖南 岳陽(yáng)414000）

砷是一種生殖毒物，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，具有較強(qiáng)的雄性生殖毒性［1-2］。砷可損傷生精細(xì)胞，引起精子數(shù)量和質(zhì)量的下降［3］。在精子發(fā)生過(guò)程中，各級(jí)生精細(xì)胞都會(huì)發(fā)生凋亡，它是機(jī)體清除過(guò)量或異常生精細(xì)胞的一種重要方式。越來(lái)越多的研究證實(shí)天冬酰胺特異酶切的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）在細(xì)胞凋亡中起重要作用［4-6］。Caspase-9是線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑中的關(guān)鍵啟動(dòng)子，在大鼠的Leydig 細(xì)胞表達(dá)［7］。從線粒體釋放的細(xì)胞色素C與Caspase-9、凋亡蛋白酶激活因子1 結(jié)合形成復(fù)合物后激活Caspase-9，活化的Caspase-9 剪切并激活Caspase-3，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8-9］。該研究通過(guò)建立亞慢性砷中毒大鼠模型，利用透射電鏡觀察附睪精子的超微結(jié)構(gòu)，檢測(cè)睪丸組織中Caspase-9蛋白的表達(dá)，探討砷致生殖系統(tǒng)損害的機(jī)制，以期為進(jìn)一步研究砷的生殖毒理學(xué)特征提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)10 周齡雄性SD 大鼠40 只，體重為160～220 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCK（黔）2002-0001。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～25 ℃，相對(duì)濕度為60%～65%，正常光照。試驗(yàn)期間，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可自由采食和飲水。

1.1.2 主要藥物與試劑

亞砷酸鈉，分析純，購(gòu)自北京化工廠有限責(zé)任公司；Caspase-9 免疫組化鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）法檢測(cè)試劑盒，武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品；睪酮酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒，美國(guó)CSB 公司產(chǎn)品；醋酸鈾，上海瑞誠(chéng)化工有限公司產(chǎn)品；Epon812 環(huán)氧樹(shù)脂，沈陽(yáng)市強(qiáng)華試劑廠產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

9905014 型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，購(gòu)自上海Leica 儀器有限公司；BSll0 型電子天平，德國(guó)Sartorius 公司產(chǎn)品；EG1150 型包埋機(jī)，德國(guó)Leica 公司產(chǎn)品；JEE-5B 型真空冷凍干燥機(jī)，北京永光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；HITCHE-1010 型離子濺射儀，日本日立公司產(chǎn)品；S-3400N 型掃描電鏡，日本日立公司產(chǎn)品；CX21 型普通光學(xué)顯微鏡，日本Olympus 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 亞慢性砷染毒大鼠模型的建立

根據(jù)筆者所在課題組的前期研究并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［10-11］，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將大鼠隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組以及低、中、高劑量染毒組，每組10 只。采用自由飲水方式進(jìn)行染毒，低、中、高劑量染毒組染毒劑量分別為2.4、12、60 mg/L，連續(xù)染毒14 周。對(duì)照組給予蒸餾水。每天觀察大鼠的健康情況，每周測(cè)定并記錄大鼠體重。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.2.1 大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清TNF-a、IL-1 濃度的檢測(cè)

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用血常規(guī)管收集大鼠外周血，利用全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)；用采血EP 管收集心臟血液，3 000 r/min 離心8 min，取上清液，放入-20 ℃冰箱待測(cè)，嚴(yán)格按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，通過(guò)公式換算，得出TNF-α 及IL-1 的濃度值。

1.2.2.2 透射電鏡觀察附睪精子的超微結(jié)構(gòu)

觀察指標(biāo)：①正常精子頭部形態(tài)（頂體為雙層膜性結(jié)構(gòu)，雙層頂體膜間為低電子密度，核染色質(zhì)較均勻）；②正常精子尾部形態(tài)（頸部和尾部結(jié)構(gòu)完整，尾部自然彎曲，其中央纖維鞘呈平行排列，可見(jiàn)微管“9+2”結(jié)構(gòu)）；③精子頂體完整狀況、頸部線粒體鞘腫脹情況。

每組隨機(jī)取4 只大鼠，在附睪尾部用眼科剪剪出約5 mm 小口，交替擠壓，將精子擠出，用PBS液洗滌3 次并離心（2 000 r/min），每次10 min；取1～2 滴精液標(biāo)本，采用3%戊二醛固定3 h；PBS 洗3 次，每次15 min，1%鋨酸固定2 h；PBS 洗3 次，每次15 min；30%、50%、70%、90%丙酮梯度脫水各1 次，每次10 min，100%丙酮脫水3 次，每次10 min；環(huán)氧樹(shù)脂浸透、包埋、聚合；超薄切片機(jī)切片；醋酸鈾染色30 min；檸檬酸鉛染色10 min；透射電鏡觀察精子超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.2.2.3 免疫組化法檢測(cè)睪丸組織中間質(zhì)細(xì)胞Caspase-9 蛋白表達(dá)情況

染毒結(jié)束后，大鼠乙醚麻醉，股動(dòng)脈放血處死，取左側(cè)睪丸分成4 份，迅速置于10%中性甲醛溶液（磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH 值至7.4）中固定，備用。常規(guī)方法脫水，用石蠟包埋。取方位相同的標(biāo)本連續(xù)切片4 張（厚度4 μm），采用免疫組化法檢測(cè)Caspase-9 蛋白的表達(dá)情況，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。40 倍目鏡下觀察5 個(gè)視野，采用Biomias 圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值，數(shù)值越高表明Caspase-9 蛋白的表達(dá)量越高。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，先進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，然后進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。若方差齊時(shí)，組間兩兩比較用LSD 檢驗(yàn)，反之用Games-Howell 檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)及血清TNF-α、IL-1 濃度檢測(cè)結(jié)果

由表1 可知，隨著亞砷酸鈉染毒濃度的升高，大鼠血清中TNF-α、IL-1 濃度及白細(xì)胞計(jì)數(shù)均呈上升趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，中、高劑量染毒組大鼠血清中TNF-α、IL-1 濃度及白細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著升高（F=6.31，P=0；F=7.22，P=0；F=5.07，P=0）。

2.2 精子透射電鏡檢查結(jié)果

由圖1 可知，對(duì)照組大鼠精子頂體結(jié)構(gòu)完整，厚度及染色均勻，頂體為雙層膜性結(jié)構(gòu)，平行貼于核表面，雙層頂體膜間為低電子密度，胞核染色質(zhì)均勻；低劑量染毒組與對(duì)照組相比，精子結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，頂體胞膜腫脹，核染色質(zhì)較均勻；中劑量染毒組精子頂體與核分離，胞膜腫脹；高劑量染毒組精子尾部中斷，軸絲排列紊亂。

圖1 亞慢性砷染毒大鼠精子形態(tài)的透射電鏡圖（15 000×）

2.3 大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中Caspase-9 蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

光鏡下，各組大鼠睪丸組織中均可見(jiàn)Caspase-9 蛋白表達(dá)陽(yáng)性信號(hào)，定位于睪丸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色。對(duì)照組，陽(yáng)性細(xì)胞染色淺；低劑量染毒組，陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組染色深；中劑量染毒組，陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組、低劑量染毒組染色深；高劑量染毒組陽(yáng)性細(xì)胞染色深（見(jiàn)圖2）。由表2 可知，與對(duì)照組相比，各劑量染毒組陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值均顯著升高（F=8.50，P＜0.05）。

圖2 免疫組化法檢測(cè)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中Caspase-9 蛋白表達(dá)情況（400×）

表2 大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞Caspase-9陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度檢測(cè)結(jié)果

3 討論

機(jī)體的生殖發(fā)育過(guò)程對(duì)外源化學(xué)物的作用比較敏感。外源化學(xué)物質(zhì)可干擾機(jī)體生殖發(fā)育多個(gè)環(huán)節(jié)，并造成損傷作用，對(duì)生殖過(guò)程的影響范圍廣泛且深遠(yuǎn)［12-13］。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，睪丸巨噬細(xì)胞和生精細(xì)胞都能分泌大量的TNF，其中，TNF-α 參與影響FSH對(duì)支持細(xì)胞生精功能的調(diào)節(jié)［14］。TNF-α 可增加IL-1 對(duì)睪酮分泌的抑制作用，降低Leydig 細(xì)胞對(duì)促性腺激素的反應(yīng)敏感性。IL-l 能改變血睪屏障的固有防御功能，增加細(xì)菌或氧自由基等有害物質(zhì)進(jìn)出睪丸的機(jī)會(huì)［15］。該研究結(jié)果表明，隨著染砷濃度的增加，大鼠血清中TNF-a、IL-1 濃度以及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)也增加，中、高劑量染毒組3 項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組相比差異顯著，推測(cè)可能長(zhǎng)期砷暴露導(dǎo)致了睪丸的炎癥反應(yīng)。

電子顯微鏡是目前觀察精子形態(tài)的最有效工具，其分辨率超高［16］。精子分為頭部和尾部，頭部有一個(gè)高度濃縮的細(xì)胞核，核的前2/3 有頂體。頂體是一種特殊的溶酶體，內(nèi)含多種水解酶，如頂體酶、透明質(zhì)酸酶等，在受精過(guò)程中發(fā)揮重要作用。該研究中，透射電鏡觀察下可見(jiàn)中、高劑量染毒組大鼠精子胞膜受損，頂體與核分離，核內(nèi)出現(xiàn)空泡，進(jìn)一步證實(shí)亞砷酸鈉可使精子頂體超微結(jié)構(gòu)改變，胞膜受損，主要表現(xiàn)為頂體內(nèi)外膜分離，頂體內(nèi)容物丟失或頂體膜上結(jié)合的透明質(zhì)酸酶等活性降低［17-18］。

生精細(xì)胞的凋亡可以有效清除不正常的生精細(xì)胞，并嚴(yán)格控制生精細(xì)胞和支持細(xì)胞的適當(dāng)比例，以保證精子的數(shù)量和質(zhì)量［19］，維持精子發(fā)生與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡，保證遺傳穩(wěn)定性。但是，如果生精細(xì)胞的凋亡程序發(fā)生紊亂，則可能造成雄性不育。Caspase-9 是與線粒體凋亡途徑直接相關(guān)的功能蛋白，目前認(rèn)為Caspase-9 是啟動(dòng)酶［20］，無(wú)機(jī)砷通過(guò)ROS 積累的間接作用或巰基氧化性的直接作用，誘導(dǎo)線粒體的基質(zhì)濃縮和滲透通道開(kāi)放，從而誘發(fā)線粒體損傷并引發(fā)凋亡，使生精細(xì)胞凋亡增加，影響精子的發(fā)育，產(chǎn)生生殖毒性。該研究結(jié)果顯示，Caspase-9 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在睪丸間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，隨著染砷劑量的增加，Caspase-9 蛋白的表達(dá)量增加。砷對(duì)睪丸生殖毒性可能的機(jī)制是其直接通過(guò)對(duì)線粒體的損傷，激活Caspase-9 蛋白，引起Caspase 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使間質(zhì)細(xì)胞凋亡增加。

4 結(jié)論

睪丸間質(zhì)細(xì)胞Caspase-9 蛋白表達(dá)水平升高可能是亞砷酸鈉致雄性大鼠慢性生殖毒性的機(jī)制之一。