檸檬酸和醋酸對小鼠離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響

周鑫漪，范 楨，岳家田，劉馨博，趙紅瓊

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

檸檬酸是一種三羧酸類化合物，易溶于水，無氣味，品嘗時(shí)具有很強(qiáng)的酸味，是一種廣泛使用的具有增加酸度、增加溶解度、抗氧化等功能的食品添加劑和飼料添加劑［1-2］。天然檸檬酸在自然界中分布較廣，存在于檸檬、柑橘、菠蘿等植物果實(shí)以及動(dòng)物的骨骼、肌肉、血液中［3］。檸檬酸還可人工合成或用微生物發(fā)酵制備。醋酸也稱乙酸，是一種有機(jī)一元酸，為食醋主要成分，在自然界中主要以酯的形式存在［4］。在動(dòng)物的組織內(nèi)、排泄物和血液中以游離酸的形式存在。許多微生物都可以通過發(fā)酵將不同的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為醋酸［5］。醋酸可使pH值降低至低于微生物最適生長所需的pH 值從而發(fā)揮抗微生物作用［6］。檸檬酸和醋酸均為常用食品添加劑或飼料添加劑，具有抗菌和抗氧化等功能［7-8］。國內(nèi)外關(guān)于人或動(dòng)物食用這兩種酸后對消化道機(jī)能影響的研究相對較少［9-11］。該研究旨在通過探究檸檬酸和醋酸對小鼠離體腸平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響及可能的機(jī)制，為開發(fā)具有調(diào)控人或動(dòng)物消化道運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙的有機(jī)酸類產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小白鼠6 只，其中，雄性4 只，雌性2只，雌、雄分籠飼養(yǎng)，平均體重（32±5）g，來源于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

Powerlab 8/30（ML870）八通道生物信號(hào)采集系統(tǒng)，橋式放大器 （ML118），配套記錄軟件為Chart for Windows 5.3，均為澳大利亞ADInstruments 公司產(chǎn)品；張力換能器（MLT0201/RAD），量程5 mg～25 g，西班牙Panlab 公司產(chǎn)品；四通道離體器官浴槽，美國Radnoti 公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑

檸檬酸（分子量210.14）、醋酸（分子量60.05，含量99.5%）、碳酸氫鈉、無水氯化鈣和葡萄糖，均為天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；氯化鈉為天津市鑫鉑特化工有限公司產(chǎn)品；氯貝膽堿（Bethanechol chloride，BCh，分子量169.68，批號(hào)MK-BQ9916V）和氯化鉀（Potassium chloride，KCl，分子量74.55，批號(hào)WX-BC0510V）為Sigma-Aldrich 產(chǎn)品；臺(tái)氏營養(yǎng)液配方見參考文獻(xiàn)［12］，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 濃度遞增檸檬酸和醋酸對小鼠離體腸運(yùn)動(dòng)的影響研究

小鼠禁食、不禁水12 h 后，頸部脫臼處死，迅速剖腹取出小腸段，放入室溫臺(tái)氏營養(yǎng)液中，截成1.5 cm 左右腸段，一端固定到盛有10 mL 臺(tái)氏營養(yǎng)液的離體器官浴槽底部掛鉤，另一端固定到張力換能器上，腸段給予1 g 負(fù)重。離體器官浴槽循環(huán)水浴溫度設(shè)置為37 ℃，用泵往臺(tái)氏營養(yǎng)液通入適量空氣。檢測浴槽臺(tái)氏營養(yǎng)液中2 倍濃度遞增檸檬酸 （0.02～0.64 mmol/L）和醋酸 （0.13～2.00 mmol/L）對小鼠離體腸運(yùn)動(dòng)的影響。用藥前描記收縮曲線1 min，每次累積給藥后記錄3 min 收縮曲線，最后用臺(tái)氏營養(yǎng)液沖洗浴槽及腸段3 次，每次沖洗間隔1 min，待腸段恢復(fù)運(yùn)動(dòng)后繼續(xù)下一個(gè)試驗(yàn)。該研究每種處理均設(shè)置6 個(gè)重復(fù)。用Chart for Windows 5.3 軟件計(jì)算腸段收縮幅度和收縮張力，分別對應(yīng)軟件“周期測量”中的“平均幅值”和“平均最小值”。

1.2.2 一次性有效濃度檸檬酸或醋酸對小鼠離體腸運(yùn)動(dòng)影響研究

通過濃度遞增試驗(yàn)，推測檸檬酸和醋酸抑制小鼠離體腸運(yùn)動(dòng)的有效濃度（小腸收縮活動(dòng)完全抑制前一梯度藥物濃度）分別為0.32 mmol/L（=67 mg/L）和1.00 mmol/L（=60 mg/L），檢測用藥后3 min 以及清洗后小鼠離體腸段收縮幅度和收縮張力的變化。

1.2.3 檸檬酸或醋酸對KCl 和BCh 引起小鼠離體腸段收縮影響研究

將檸檬酸或醋酸與KCl 或毒蕈堿型受體（muscarinic receptor，M-受體）激動(dòng)劑BCh 聯(lián)合使用，初步探索檸檬酸或醋酸抑制腸段運(yùn)動(dòng)的可能機(jī)制。用藥前描記腸段收縮曲線1 min，然后加入有效濃度的檸檬酸、醋酸或等體積水（空白對照），記錄描記曲線1 min，再向臺(tái)氏營養(yǎng)液中加入終濃度為25 mmol/L KCl 或3×10-5mol/L BCh，記錄描記曲線2 min 后清洗腸段，比較KCl 用藥后峰值（為Chart for Windows 5.3 軟件中 “周期測量”的“最大值”）變化、BCh 用藥后收縮幅度和收縮張力的變化。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

計(jì)算每次用藥后指標(biāo)除以用藥前相應(yīng)指標(biāo)的百分比，然后用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）”的形式表示。用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行LSD 的單因素方差分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃度遞增的檸檬酸和醋酸對小鼠離體腸段運(yùn)動(dòng)的影響

檢測了2 倍濃度遞增 （0.02～0.64 mmol/L）檸檬酸對小鼠離體腸段運(yùn)動(dòng)的影響。收縮曲線顯示（見圖1A），隨著檸檬酸濃度遞增，用藥后腸段收縮力遞減，濃度達(dá)到0.64 mmol/L 后完全抑制。每次用藥后3 min 內(nèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（見圖1B），檸檬酸濃度達(dá)0.16 mmol/L 時(shí)收縮幅度較用藥前顯著（P＜0.05）減小，濃度達(dá)0.32 mmol/L 和0.64 mmol/L時(shí)收縮幅度極顯著（P＜0.01）低于用藥前，分別為用藥前的（49±8）%和（11±2）%；用藥濃度達(dá)0.32 mmol/L 和0.64 mmol/L 時(shí)收縮張力分別顯著 （P＜0.05）和極顯著（P＜0.01）低于用藥前，分別為用藥前的（82±3）%和（79±5）%。

收縮曲線顯示（見圖2A），隨著醋酸濃度遞增（0.13～2.00 mmol/L），用藥后腸段收縮力遞減，濃度達(dá)到2.00 mmol/L 后完全抑制。每次用藥后3 min 內(nèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（見圖2B），醋酸濃度達(dá)2.00 mmol/L 時(shí)，收縮幅度極顯著（P＜0.01）低于用藥前，為用藥前的（16±3）%；醋酸濃度達(dá)1.00 mmol/L 和2.00 mmol/L 時(shí)，收縮張力均極顯著（P＜0.01）低于用藥前，分別為用藥前的（82±3）%和（76±5）%。

圖2 濃度遞增的醋酸對小鼠離體腸段運(yùn)動(dòng)的影響

2.2 一次性有效濃度檸檬酸或醋酸對小鼠離體腸段運(yùn)動(dòng)的影響

該試驗(yàn)研究了能夠抑制離體腸段收縮幅度的0.32 mmol/L（有效抑制濃度）檸檬酸或1.00 mmol/L（有效抑制濃度）醋酸對小鼠離體腸運(yùn)動(dòng)的影響。腸收縮曲線顯示（見圖3A、圖3B），一次性有效濃度檸檬酸或醋酸使腸段收縮力明顯減小，在3 次用營養(yǎng)液清洗后收縮力基本恢復(fù)到用藥前。用藥后3 min 內(nèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（見圖3C、圖3D），檸檬酸或醋酸使腸段收縮幅度同用藥前比較均極顯著（P＜0.01）減小，分別為用藥前的（41±5）%和（39±6）%；而收縮張力變化均不顯著（P＞0.05）；清洗3次后，腸段收縮幅度和收縮張力同用藥前比較差異均不顯著（P＞0.05）。

圖3 一次性有效濃度檸檬酸或醋酸對小鼠離體腸段運(yùn)動(dòng)的影響

2.3 檸檬酸或醋酸與KCl 聯(lián)合用藥對小鼠離體腸段運(yùn)動(dòng)的影響

該研究探索了檸檬酸或醋酸與KCl 聯(lián)合用藥對小鼠離體腸段運(yùn)動(dòng)的影響。收縮曲線顯示（見圖4A），檸檬酸或醋酸用藥后腸段收縮力均減弱，而加等體積水不影響腸段收縮，但2 種酸分別與KCl 聯(lián)合用藥后收縮曲線均出現(xiàn)陡峭波峰。KCl 用藥后峰值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（見圖4B），3 個(gè)處理間峰值差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 檸檬酸或醋酸與KCl 聯(lián)合用藥對小鼠離體腸段運(yùn)動(dòng)的影響

2.4 檸檬酸或醋酸與BCh 聯(lián)合用藥對小鼠離體腸段運(yùn)動(dòng)的影響

該研究探索了檸檬酸或醋酸與M-受體激動(dòng)劑BCh 聯(lián)合用藥對小鼠離體腸段運(yùn)動(dòng)的影響。收縮曲線顯示（見圖5A），檸檬酸、醋酸或水與BCh聯(lián)合用藥后，腸段均出現(xiàn)緊張性收縮。聯(lián)合用藥后2 min 內(nèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示（見圖5B），檸檬酸+BCh 聯(lián)合用藥后較水+BCh 聯(lián)合用藥收縮幅度顯著 （P＜0.05）增強(qiáng)，檸檬酸或醋酸+BCh 用藥后收縮張力與水+BCh 聯(lián)合用藥相比無顯著（P＞0.05）差異。

圖5 檸檬酸或醋酸與BCh 聯(lián)合用藥對小鼠離體腸段運(yùn)動(dòng)的影響

3 討論

該研究結(jié)果表明，2 倍濃度遞增的檸檬酸和醋酸均劑量依賴性地抑制小鼠離體腸段收縮運(yùn)動(dòng)。袁夢等［9］報(bào)道，0.1 g/L 和0.15 g/L 檸檬酸可提高小鼠與家兔離體腸段活動(dòng)力（收縮強(qiáng)度×收縮頻率）（P＜0.01），這一結(jié)果似乎與該研究結(jié)果相反。但值得注意的是，在平滑肌被抑制時(shí)，記錄軟件在計(jì)算收縮頻率時(shí)會(huì)將由于電流或系統(tǒng)干擾的非常小的波計(jì)算在內(nèi)，而從數(shù)據(jù)上看收縮頻率增加，導(dǎo)致收縮活動(dòng)力增加。因此，在檢測具有抑制平滑肌運(yùn)動(dòng)藥物時(shí)，需要在軟件系統(tǒng)人為設(shè)定采集的最小波，不宜將干擾波采集到數(shù)據(jù)中。劉俊棟等［10］報(bào)道，8～35 mmol/L 乙酸能抑制牛真胃平滑肌的收縮強(qiáng)度（P＜0.01），而40～50 mmol/L 乙酸能增大真胃平滑肌的收縮強(qiáng)度（P＜0.05），可見藥物使用劑量、動(dòng)物種類、采集平滑肌部位不同，均可能影響藥物對平滑肌的收縮作用。

檸檬酸和醋酸均為有機(jī)酸，前者分子中有3個(gè)羧基，后者分子中有1 個(gè)羧基，檸檬酸分子量約為醋酸的3 倍。該研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸和醋酸對離體腸段收縮有效抑制濃度分別為0.32 mmol/L 和1.00 mmol/L，即醋酸有效抑制濃度約為檸檬酸的3倍，提示這兩種有機(jī)酸對離體腸段的抑制作用，可能以羧基為主要功能單位。

KCl 促進(jìn)離體腸的興奮作用是基于其引起平滑肌細(xì)胞膜去極化，而導(dǎo)致細(xì)胞膜上Ca2+電壓門控通道打開，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，而使平滑肌快速收縮［13-14］。在該研究中，無論是檸檬酸還是醋酸用藥后，并未影響KCl 引起的腸段收縮峰值，提示這兩種有機(jī)酸不能影響平滑肌細(xì)胞的去極化。消化道平滑肌的運(yùn)動(dòng)受到外來神經(jīng)和壁內(nèi)神經(jīng)叢的調(diào)節(jié)。外來神經(jīng)中的副交感神經(jīng)節(jié)前纖維與壁內(nèi)神經(jīng)元形成突觸，然后發(fā)出節(jié)后纖維支配平滑肌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。大部分節(jié)后纖維釋放乙酰膽堿，通過激活毒蕈堿型受體（muscarinic receptor，M-受體），促進(jìn)消化道的運(yùn)動(dòng)及影響其他功能［15］。在該研究中，檸檬酸或醋酸用藥后，并未影響M-受體激動(dòng)劑BCh 對腸段收縮張力的提高，但檸檬酸用藥后使BCh 對腸段收縮幅度減小得到緩解，提示檸檬酸對離體腸段的痙攣具有緩解作用，且可能部分通過抑制M-受體實(shí)現(xiàn)。檸檬酸和醋酸對離體腸段抑制作用的機(jī)制有待進(jìn)一步研究，例如是否調(diào)節(jié)胃腸道Cajal 間質(zhì)細(xì)胞功能而調(diào)節(jié)收縮活動(dòng)［16］。

在動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中，檸檬酸或醋酸及衍生物被廣泛用作飼料添加劑。黃興海［7］報(bào)道，添加0.4%檸檬酸能有效促進(jìn)草魚的生長。李亦漢等［17］認(rèn)為，用兩歧雙歧桿菌灌胃小鼠可升高消化道中醋酸水平，進(jìn)而可緩解由于炎癥引起的便秘的癥狀。曹山川等［18］研究表明，將檸檬酸添加到基礎(chǔ)日糧中可影響消化道菌群數(shù)量并影響消化性能。但是，在使用檸檬酸和醋酸作為添加劑時(shí)，需要注意使用劑量，該研究結(jié)果顯示，如果劑量太高，可能會(huì)抑制消化道運(yùn)動(dòng)。也有報(bào)道醋酸可損傷大鼠腸黏膜［19-20］。

4 結(jié)論

檸檬酸和醋酸均劑量依賴性地抑制小鼠離體平滑肌的運(yùn)動(dòng)，有效抑制濃度分別為0.32 mmol/L和1.0 mmol/L，且檸檬酸和醋酸可能并不影響平滑肌細(xì)胞膜的去極化過程，但檸檬酸可能部分影響M-受體的作用而對消化道平滑肌具有解痙作用。該研究結(jié)果為人類或獸醫(yī)臨床利用有機(jī)酸干預(yù)消化道運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙相關(guān)疾病提供了參考。