2個芽變蘋果品種枝條主要性狀比較

李文芳,任振碩,李 龍,馬宗桓,毛 娟,陳佰鴻

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 園藝學院,蘭州 730070)

蘋果短枝型品種是普通型蘋果品種在內(nèi)、外因素綜合作用下自發(fā)突變形成的天然矮化種源。其樹冠矮小,樹姿直立,萌芽率高,成枝力弱,短枝比例高,成花容易,坐果率高[1-3],管理簡便,具有較強的適應(yīng)性、早果性、豐產(chǎn)性和穩(wěn)定性的特點[4]。此外,短枝型品種枝條粗而短,枝上芽間距較窄,單位長度枝條上的葉片數(shù)量多,加之葉片大而厚,具有較高的光飽和點和較低的光補償點,光能利用率高、呼吸消耗少,光合制造能力強,能夠積累更多的光合產(chǎn)物,有利于提升蘋果品質(zhì),同時充足的養(yǎng)分積累保證了樹體的營養(yǎng)[5]。矮化密植是世界蘋果栽培的發(fā)展方向,選用短枝型品種是蘋果矮化密植的主要途徑之一[6]。

研究表明,植物枝條節(jié)間變短現(xiàn)象與赤霉素(GA)密切相關(guān)。GA能夠參與調(diào)控植物莖的伸長、種子萌發(fā)、葉片展開和果實發(fā)育等多個生長發(fā)育過程[7]。GA20-氧化酶(GA20ox)是植物GA合成途徑中的關(guān)鍵酶,過量表達能導致赤霉素的過量合成和明顯加快植株生長[8]。脫落酸(ABA)對植物的生長發(fā)育的調(diào)節(jié)作包括種子休眠、萌發(fā)、營養(yǎng)生長、環(huán)境脅迫反應(yīng)等[9]。

ABA信號通路的關(guān)鍵參與者是ABA結(jié)合受體(RCAR/PYR1/PYL),能夠與蛋白磷酸酶(PP2C)一起形成功能性全受體,與Snf1相關(guān)激酶SnRK2蛋白家族在ABA信號轉(zhuǎn)錄途徑和抗?jié)B透脅迫中扮演著重要的角色[10]。生長素IAA參與多種生理活動,包括細胞擴大、細胞周期調(diào)節(jié)和分化過程等[11]。生長素極性運輸抑制劑響應(yīng)蛋白(TIR1)是F-box蛋白家族的一員,為植物生長素受體,是植物生長素信號轉(zhuǎn)導途徑的關(guān)鍵因子。

在植物中,光合作用和源庫組織中的碳代謝產(chǎn)生不同的糖信號,以調(diào)節(jié)生長、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)。果樹不同器官中碳水化合物的種類和含量在很大程度上影響并維持著果樹的生長發(fā)育以及其他生理代謝過程[12],碳水化合物在果樹體內(nèi)主要以糖類物質(zhì)及其代謝所產(chǎn)生的其他化合物的形式存在[13]。糖不僅為細胞碳和能量代謝提供燃料,而且作為信號分子發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

可溶性糖如蔗糖、葡萄糖、果糖可以通過液泡膜上相應(yīng)的轉(zhuǎn)運蛋白運輸?shù)揭号葜?液泡中糖濃度的增加會激活與糖代謝途徑相關(guān)的酶和基因的表達,調(diào)節(jié)細胞不同腔室的滲透平衡[14]。蔗糖在轉(zhuǎn)化酶的催化不可逆水解為葡萄糖和果糖,作為植物生長、產(chǎn)量形成和脅迫響應(yīng)的營養(yǎng)物質(zhì)、能量來源以及信號分子[15]。SnRKs蛋白激酶家族也在植物糖信號和碳代謝中起關(guān)鍵作用[16]。

本研究通過分析內(nèi)源激素和可溶性糖含量在普通型和短枝型富士蘋果品種之間的差異,結(jié)合PCR熒光定量分析相關(guān)基因的表達差異,分析判斷不同種類、不同濃度激素和可溶性糖與短枝型芽變品種形成的關(guān)系,為探索蘋果短枝芽變品種的形成機理提供理論基礎(chǔ),從而為蘋果定向芽變育種提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

供試材料選用普通型品種富士‘煙富8號’,短枝型品種‘惠民短枝’,砧木為山定子,樹齡為10年,株行距為3 m×4 m,果園位于甘肅省天水市秦州區(qū)玉泉鎮(zhèn)楊河村(34°34′N,105°50′E),常規(guī)管理。每個品種選取樹勢健壯、長勢一致的蘋果樹9株,每3株為1個重復,在枝條快速生長期每株隨機選取中上部外圍1年生枝8～10個,同時隨機采集一年生枝條中部的葉片、莖和莖尖,并將其速凍于液氮中2 h,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 枝條數(shù)據(jù)測定使用游標卡尺測量‘煙富8號’和‘惠民短枝’枝條中部的粗度;卷尺測定一年生枝條長度,統(tǒng)計一年生枝的節(jié)位數(shù),根據(jù)節(jié)位數(shù)計算節(jié)間長度。

1.2.2 高效液相色譜(HPLC)法測定內(nèi)源激素含量稱取0.5 g冷凍樣品用于測定IAA、ABA和GA3。每個樣品與10 mL 80%色譜純甲醇(用無DNase/RNase雙蒸餾水制備)混合,洗滌3次,轉(zhuǎn)移到試管中,在4 ℃的冰箱黑暗條件下保存10 h,然后,高速(13 000g)冷凍(4 ℃)離心20 min,將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中進行濃縮,在40 ℃下通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使甲醇揮發(fā),獲得2 mL濃縮液。用50%色譜純甲醇連續(xù)洗滌蒸發(fā)瓶壁,定容至10 mL,用0.22 μm有機相微孔濾膜過濾。用于HPLC的設(shè)備是LC-20AD系統(tǒng)(日本京都島津),配備Zorbax Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×250 mm×5.0 μm,Agilent,Palo Alto,CA,USA)和SPD-20A UV檢測器。

配制不同濃度梯度的IAA、ABA和GA3的標樣,繪制標準標曲。進樣量為2 μL;流速為1 mL/min;柱溫30 ℃;流動相為A∶B=(甲醇/0.1%甲酸)∶(水/0.1%甲酸)。

1.2.3 HPLC法測定可溶性糖含量冷凍樣品加液氮快速研磨后,準確稱取0.5 g至離心管中,加入5 mL 80%的乙醇,35 ℃超聲提取20 min,4 ℃ 13 000g離心15 min,吸取上清液至新的10 mL離心管中。

用80%乙醇重復提取2次,每次加2 mL,最后定容至10 mL。用真空離心濃縮儀(60 ℃)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),除去多余的乙醇,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)結(jié)束后,用1 mL超純水1 mL乙腈復溶,然后過0.22 μm有機相微孔濾膜,至棕色進樣品瓶中待測。配制不同濃度梯度的果糖、蔗糖、葡萄糖和山梨糖醇的標樣,繪制標準標曲。進樣量為10 μL,流速為0.8 mL/min,柱溫40 ℃,流動相為乙腈(75%)+三乙胺(0.2%)+超純水(24.8%)。

1.2.4 實時定量 qRT-PCR引物設(shè)計根據(jù)GenBank與蘋果參考基因組上查詢的蘋果基因TIR1(MD11G1299000)、PYL(MD10G1257900)、SnRK2(NM_001301724.1)和GA20ox(XM_008378277.3)的CDS序列設(shè)計特異性引物(表1)。通過上海生工生物有限公司進行引物設(shè)計并合成。

表1 試驗所用引物序列

1.2.5 RNA提取和cDNA合成使用RealPure普通植物RNA提取試劑盒[中科瑞泰(北京)生物科技有限公司]提取總RNA,RNase-free DNase I[寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]用于純化RNA。使用瓊脂糖凝膠(1%W/V)分析評估RNA質(zhì)量,Pultton P200超微量分光光度計(Pultton Technology Limited)測量RNA純度(D260/280),測定260 nm處的吸光值對RNA定量。之后,定量的RNA使用SuperScriptTMⅢ第一鏈合成 SuperMix InvitrogenTM[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.6 實時定量 qRT-PCR分析以蘋果GADPH為內(nèi)參基因,用LightCycler96實時熒光定量PCR儀進行熒光定量,對激素相關(guān)基因進行特異性表達分析。反應(yīng)體系參照蘇麗艷[17]的方法進行,具體為2 μL cDNA,上下引物各1 μL,SYBR Green Pro Taq HS 10 μL,6 μL ddH2O補足20 μL。反應(yīng)程序為:95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s共40個循環(huán),3次重復,采用2-ΔΔCT法對基因相對表達量進行計算[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,IBM SPSS statistics 22軟件對均值之間的所有差異采用雙向ANONA和Fisher’s least significant difference(LSD)進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘煙富8號’與‘惠民短枝’枝條表型差異

從表型來看,‘煙富8號’的節(jié)間長度大于‘惠民短枝’突變體,而莖粗小于‘惠民短枝’(圖1,A)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),‘煙富8號’的枝條粗度為5.10 mm,極顯著低于‘惠民短枝’(5.51 mm)(圖1,B),而節(jié)間長度為3.54 cm,極顯著高于‘惠民短枝’1.2倍(圖1,C)。

*和**分別表示2個品種間P< 0.05和P<0.01水平的差異。下同。圖1 2個蘋果品種枝條的表型性狀* and ** indicate differences at 0.05 and 0.01 levels between two cultivars. The same as below.Fig.1 Phenotypic traits of branches from two cultivars

2.2 內(nèi)源激素和可溶性糖含量分析

在莖中,GA3含量最高,ABA次之,IAA含量最低。其中,‘煙富8號’的GA3和IAA含量分別為54.72 μg/g和4.79 μg/g,是‘惠民短枝’的2.7倍和9.8倍,2個品種間達到極顯著水平,而ABA含量僅為‘惠民短枝’的0.6倍(圖2,A)。莖尖中,IAA含量最高,GA3次之,ABA含量最低。‘煙富8號’的GA3和IAA含量分別為30.52 μg/g和48.66 μg/g,為‘惠民短枝’的1.5倍和1.4倍,而ABA含量為‘惠民短枝’的0.7(圖2,B)。

圖2 2個品種莖(A)和莖尖(B)中不同激素含量比較Fig.2 Contents of GA3, IAA and ABA in stems (A) and stem tips (B) of two cultivars

在莖中,山梨糖醇含量最高,果糖次之,蔗糖和葡萄糖含量較低(圖3,A)。其中,果糖和葡萄糖在‘煙富8號’和‘惠民短枝’之間無顯著差異,而‘煙富8號’的蔗糖和山梨糖醇含量分別為‘惠民短枝’的2.5倍和1.3倍,在2個品種間達到極顯著水平。莖尖中,山梨糖醇和果糖含量較高,蔗糖和葡萄糖含量較低(圖3,B)。其中,果糖、蔗糖和山梨糖醇在‘煙富8號’和‘惠民短枝’之間無顯著差異,而‘煙富8號’的葡萄糖含量僅為0.82 mg/g,是‘惠民短枝’的0.3倍。

圖3 2個品種莖(A)和莖尖(B)中可溶性糖含量Fig.3 Sugar content in stems (A) and stem tips (B) of two cultivars

2.3 激素相關(guān)基因的表達分析GA3

圖4顯示:莖尖中,‘煙富8號’TIR1和GA20ox基因的表達水平均顯著高于‘惠民短枝’,分別達54.5倍和1.2倍,而SnRK2和PYL分別為‘惠民短枝’的0.3倍和0.5倍。莖中,‘煙富8號’TIR1和GA20ox基因的表達水平分別為‘惠民短枝’的3.1倍和1.6倍,而SnRK2和PYL僅為‘惠民短枝’的0.1倍和0.2倍。葉片中,‘煙富8號’GA20ox基因的表達水平為‘惠民短枝’的7.0倍,達顯著水平,而TIR1、SnRK2和PYL在2個品種間無顯著差異。

圖4 2個品種莖尖(A)、莖(B)和葉片(C)中相關(guān)基因的表達Fig.4 Expression of related genes in stem tips (A), stems (B) and leaves (C) of two cultivars

3 討 論

‘惠民短枝’是一種短枝型自然芽變突變體,具有樹勢強,樹冠小,萌芽率高,成枝力弱,以短果枝結(jié)果為主,結(jié)果早,易豐產(chǎn),果實較大,色澤鮮艷,風味好等特點,通過縮短莖部營養(yǎng)生長的時間和縮短節(jié)間長度,使樹體矮小、適應(yīng)性強[2]。

GA作為植物六大激素之一,在植物的生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)等多個途徑中起著重要作用[19]。GA3是植物的生長調(diào)節(jié)劑,可以加快莖與幼枝的生長,具有促進植株生長發(fā)育的作用。適當濃度GA能夠促進植物的伸長生長,植物體內(nèi)若缺乏GA,則導致植物矮化。GA含量差異和GA合成關(guān)鍵酶基因差異表達與短枝型蘋果枝條節(jié)間長度相關(guān)聯(lián),低GA含量和GA合成關(guān)鍵酶基因的下調(diào)表達抑制了‘龍富短枝’蘋果枝條的伸長[20]。IAA具有調(diào)節(jié)植物生長的作用,在適宜的濃度下可以促進植物生長,當濃度過高或過低時會抑制植物生長。脫落酸(ABA)能夠促進種子發(fā)芽與幼苗生長,促進光合效率與幼胚發(fā)育, 短枝型蘋果植株的ABA含量是普通型蘋果的2.6倍以上[21]。同時GA3、IAA、ABA之間還具有協(xié)調(diào)作用,不同濃度的激素協(xié)同對植物的影響不同,具體的影響還需要進行數(shù)據(jù)分析才能證明。本研究中,莖和莖尖中的GA3、IAA含量顯著高于‘惠民短枝’,而ABA含量顯著低于‘惠民短枝’。這一結(jié)果與‘長富2號’嫩枝中的GA和ABA含量顯著高于短枝型品種‘神富6號’,而IAA含量無明顯差異[22]的研究結(jié)果有出入。說明這3種植物激素在短枝型性狀的形成中均扮演著非常重要的角色,但是三者之間的協(xié)同機制還有待進一步研究。

擬南芥中GA20ox1、GA20ox2和GA20ox3的沉默會導致植株矮化,影響生長發(fā)育[23]。棉花GhGA20ox6基因過表達擬南芥能顯著增加株高,且抽薹提前[24]。MdGA20ox1的表達量在半矮化類型砧木SH28嫁接‘嘎啦’的莖尖、幼葉、成熟葉和枝皮中均高于矮化類型SH40嫁接‘嘎啦’[25]。TIR1家族基因作為生長素受體,處于生長素信號通路中關(guān)鍵位置,參與調(diào)控植物生長與發(fā)育過程中生長素反應(yīng)[26]。AtPYL4,AtPYL5,AtPYL8和AtPYL9轉(zhuǎn)基因擬南芥對ABA的敏感性提高主要表現(xiàn)在種子萌發(fā)、幼苗的生長、氣孔開閉及提高植物的抗旱能力等方面[27]。研究者還發(fā)現(xiàn)過表達OsPYL5的轉(zhuǎn)基因水稻抗脅迫能力增強,但株高和總產(chǎn)量略有下降[28]。SnRK2是生長促進與脅迫應(yīng)激信號通路交匯的關(guān)鍵調(diào)控因子。在擬南芥中,SnRK2蛋白激酶可以通過調(diào)節(jié)蔗糖6-磷酸合酶的活性來調(diào)節(jié)蔗糖代謝,以及植物生長和種子形成過程中的光合作用和碳固定[29]。同樣,在本研究中,莖和莖尖中的TIR1和GA20ox基因的表達水平顯著高于‘惠民短枝’,而SnRK2和PYL顯著低于‘惠民短枝’,葉片中的GA20ox基因的表達水平顯著高于‘惠民短枝’。說明較低表達水平的TIR1和GA20ox,以及較高表達水平的SnRK2和PYL是短枝性狀形成的關(guān)鍵因子。

可溶性糖各個組分的含量對蘋果短枝芽變都有重要作用。植物體內(nèi)蔗糖轉(zhuǎn)化酶可以吸收和利用蔗糖,且在高等植物蔗糖代謝中起著關(guān)鍵的作用[30]。研究表明,轉(zhuǎn)化酶參與植物的生長、器官建成、糖分運輸、韌皮部卸載及調(diào)節(jié)庫組織糖分構(gòu)成及水平,近年來關(guān)于該酶的生化特性、基因表達與調(diào)控以及結(jié)構(gòu)與功能等的研究取得了重要進展[31]。因而蔗糖對于蘋果枝條的發(fā)育和芽變具有重要作用。山梨糖醇在薔薇科植物中,主要是作為光合產(chǎn)物,運輸物質(zhì)和儲藏物質(zhì),在許多植物中作用與蔗糖相同,也經(jīng)常被用于植物組培中來與蔗糖混用[32]。前人研究發(fā)現(xiàn),山梨糖醇有利于芽的增值而不利于芽的生長,利于莖干物質(zhì)的增加而不利于葉片的擴大[33]。研究發(fā)現(xiàn),高氮條件下蘋果莖尖積累的山梨醇和蔗糖為蘋果莖尖的快速生長發(fā)育提供了充足的物質(zhì)和能量[34]。葡萄糖則主要用于轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維素,擴大樹干和枝葉、根部的生長,會在花芽分化后期大量生成[35]。與本研究結(jié)果一致,莖中的蔗糖和山梨糖醇含量分別顯著高于‘惠民短枝’,莖尖中的葡萄糖顯著低于‘惠民短枝’。因此,可推斷較高含量的蔗糖和山梨糖醇對于枝條快速生長期的伸長生長提供了能量。此外,研究發(fā)現(xiàn),小麥TaSnRK2s參與了小麥的糖代謝和脅迫信號傳遞,過表達TaSnRK2s可以改善根的生長和發(fā)育[30]。本研究中,SnRK2在‘惠民短枝’莖和莖尖中的表達水平顯著高于‘煙富8號’,與ABA、蔗糖和山梨糖醇的變化一致。綜合以上結(jié)果推測,SnRK2在糖代謝和激素信號中可能具有關(guān)鍵的介導作用,但它們之間的聯(lián)合參與調(diào)控機理目前還不清楚,有待進一步研究。

綜上所述,蔗糖、山梨糖醇和葡萄糖對蘋果短枝形成具有主要影響,果糖則影響較小或無影響。但內(nèi)源激素之間的協(xié)同作用及其與可溶性糖之間的相互調(diào)控對短枝型芽變品種產(chǎn)生的作用機制還有待研究。