響應面法優(yōu)化芡實醋酒精發(fā)酵階段工藝條件

戴緣緣，謝小花，陳 靜，肖陸飛，安曉婷

（滁州職業(yè)技術學院 食品與環(huán)境工程學院，安徽 滁州 239000）

芡實常被稱為雞頭果、雞嘴蓮、雞頭米等[1]，除了富含淀粉、蛋白質、氨基酸、無機鹽和維他命等營養(yǎng)成分之外[2-8]，還含有環(huán)肽類化合物、黃酮類化合物、甾醇類化合物等多種功效成分[9]．芡實具有抗疲勞、抗氧化、抗衰老、抗癌以及保護胃黏膜、抑菌、降糖、降壓等生物活性[10-17]，具備很高的藥理和開發(fā)價值．但目前對它的研究主要集中在化學成分和生理活性上，且市面上的芡實產品主要以速凍和干制等初級加工品為主，在發(fā)酵食品領域的開發(fā)利用較少，而以芡實為原料釀造食醋的研究更是鮮見報道[18]．芡實醋結合了芡實與食醋的營養(yǎng)價值和保健功能，符合人們對保健醋及其飲品的新期待和新要求，具有一定市場前景．

本研究以芡實為原料，經蒸煮、去殼、打漿、酶解后，接種酵母菌進行發(fā)酵，以酒精度為指標，采用響應面法優(yōu)化芡實醋酒精發(fā)酵階段工藝參數(shù)，旨在為芡實醋后續(xù)醋酸發(fā)酵階段創(chuàng)造有利條件，從而豐富芡實精深加工發(fā)酵制品類型，拓寬功能性保健醋的種類，為芡實醋及其保健飲料的生產提供相關的數(shù)據支撐和經驗參考．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芡實鮮果（安徽天長市華富尊雞頭果有限公司）；家庭裝干酵母粉（高活性、耐高糖型）（黑龍江九鼎酵母有限公司）；固態(tài)淀粉酶（耐高溫、酶活為20 000 U/g）、固態(tài)糖化酶（酶活為100 000 U/g）、葡萄糖，以上全部為食品級（上海鑫泰實業(yè)有限公司）；甲醇、乙醇，以上級別全部為色譜純（滕州中科譜分析儀器有限公司）．

1.2 儀器與設備

LLJ-C04W1 型榨汁機（佛山市小熊廚房電器有限公司）；FA2204 型電子天平（上海衡際科學儀器有限公司）；WB100-4F 型恒溫定時水浴鍋（寧波群安實驗儀器有限公司）；XFS-280MB 型蒸汽滅菌鍋（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）；LC-CJ-1FD 型全鋼超凈工作臺（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；303-00 型升級版電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津賽得利斯實驗分析儀器制作廠）；TGL-16M 型臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；GC-2010 型氣相色譜儀（日本島津制作所）．

1.3 試驗方法

（1）酒精度的測定

①色譜條件．色譜柱：DB-624 毛細柱（25 m×0.20 mm，1.12 μm）；其余條件包括升溫程序、進樣器溫度、FID 檢測器溫度、進樣量以及分流比等的具體參數(shù)均參考芋頭醋酒精發(fā)酵階段酒精度測定的色譜條件[19].

②標準曲線繪制．分別取1%（v/v）乙醇標準溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9 mL，用甲醇定容至10 mL 并混勻，用針管推動過0.45 μm 的有機膜進行過濾，檢測過濾后的樣液，結束后記錄儀器所產生譜圖中的峰面積．對檢測所得的數(shù)據進行處理后，得到標準曲線的具體方程為y= 3194.6x+ 48.678，其相關系數(shù)R2=0.999 9.

③樣品處理及測定．在6 000 r/min 的條件下，將酒精發(fā)酵結束后的芡實漿液離心10 min，用甲醇稀釋上清液至合適的稀釋度，后續(xù)過濾及檢測操作同上，測定芡實漿酒精發(fā)酵液中的酒精度．

（2）統(tǒng)計分析方法．每個試驗都進行3 次平行操作，最終試驗結果記錄為平均值±標準差的表示形式．充分利用Excel 和Design-Expert 8.06 軟件的數(shù)據處理及圖表功能，先對試驗結果進行統(tǒng)計分析，再進一步進行可視化分析．

2 試驗方案設計

2.1 芡實醋發(fā)酵工藝及操作要點

（1）工藝流程

圖1 芡實醋工藝流程

（2）操作要點

①芡實漿的制備．將無腐爛、無霉變、品質好的芡實清洗后蒸煮10 min．去殼后按料液比1 ∶2（W/W）加水，用榨汁機攪打制備芡實勻漿．

②酶解．向芡實漿中加入160 U/g 事先用漿液溶解的耐高溫淀粉酶，85 ℃恒溫液化處理2 h，升高溫度滅酶后，加入用漿液溶解的糖化酶300 U/g，55 ℃恒溫糖化處理2 h，滅酶后，獲得芡實漿可發(fā)酵性糖液．

③酒精發(fā)酵．將芡實漿可發(fā)酵性糖液滅菌后，添加適量的葡萄糖，用以調整漿液糖度，接著調整漿液的pH 值，然后在無菌的超凈臺里接種活力良好的酵母菌，提供適宜的發(fā)酵條件，讓酵母菌能夠進行充分且高效的發(fā)酵，最終獲得品質較好的芡實漿酒精發(fā)酵液．

④醋酸發(fā)酵及芡實醋成品的制備．酒精發(fā)酵階段結束后，在135℃條件下滅菌10 s，并向滅菌后的芡實漿酒精發(fā)酵液中添加葡萄糖、蛋白胨等對醋酸菌有益的成分，同時將初始酒精度調整為8．00 %，然后在無菌條件下接種10 %醋酸菌滬釀1.01，于31℃保溫發(fā)酵5.0 d，獲得芡實漿醋酸發(fā)酵液，此時的總酸度為5.80 %．將芡實漿醋酸發(fā)酵液密封后室溫放置15.0 d，進行陳釀，結束后添加0.45 %殼聚糖處理1 h，于6 000 r/min 離心5 min，將亮黃澄清的上清液虹吸至事先消毒好的玻璃容器中，加蓋密封后，75 ℃水浴殺菌0.5 h，擦瓶并迅速冷卻后制得芡實醋成品，可進一步調配出芡實醋飲料.

2.2 響應面法優(yōu)化芡實醋酒精發(fā)酵階段工藝

（1）單因素試驗

①葡萄糖添加量的選擇．向芡實漿可發(fā)酵性糖液中分別添加6、8、10、12、14 g/100 mL 的葡萄糖，酵母菌的接種量控制為0.2 %，在30℃的恒溫箱中保溫發(fā)酵4.0 d，分析芡實醋酒精發(fā)酵階段漿液中酒精度隨葡萄糖添加量的變化規(guī)律．

②接種量的選擇．葡萄糖添加量取上述試驗較好值，接種量分別取0.1 %、0.2 %、0.4 %、0.8 %、1.6 %，其他條件不變，分析芡實醋酒精發(fā)酵階段漿液中酒精度隨接種量的變化規(guī)律．

③發(fā)酵溫度的選擇．接種量取上述試驗最好值，發(fā)酵溫度分別取24 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃，其他條件不變，分析芡實醋酒精發(fā)酵階段漿液中酒精度隨發(fā)酵溫度的變化規(guī)律.

④發(fā)酵時間的選擇．發(fā)酵溫度取上述試驗最好值，發(fā)酵時間分別取2.0 d、2.5 d、3.0 d、3.5 d、4.0 d，其他條件不變，分析芡實醋酒精發(fā)酵階段漿液中酒精度隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律．

⑤pH 的選擇．發(fā)酵時間取上述試驗最好值，pH 分別取4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，其他條件不變，分析芡實醋酒精發(fā)酵階段漿液中酒精度隨pH 的變化規(guī)律．

（2）Box-Behnken 試驗．以單因素試驗所得的現(xiàn)象規(guī)律作為主要依據，進而利用Box-Behnken 響應面設計探索酒精發(fā)酵階段工藝條件．篩選出的試驗因素與其對應的水平編碼見表1．完成相應試驗以分析獲得該發(fā)酵階段最適工藝參數(shù)．

表1 芡實醋酒精發(fā)酵階段Box-Behnken 試驗因素及水平表

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果與分析

（1）葡萄糖添加量對芡實醋酒精發(fā)酵階段的影響

由圖2 可知，芡實漿發(fā)酵液的酒精度與葡萄糖添加量呈現(xiàn)明顯的正相關關系，但葡萄糖添加量高于10 g/100 mL 以后酒精度的升高幅度有所下降，葡萄糖添加量12 g/100 mL 時酒精度為7.70 %，葡萄糖添加量14 g/100 mL 時酒精度僅為8.20 %．造成這種現(xiàn)象的可能原因是，芡實漿的滲透壓因還原糖濃度升高而過高，酵母菌對糖分的利用受到抑制，漿液中殘留的糖分反而增多，酒精產量降低．同時葡萄糖添加量過大還會較大程度的增加成本，使生產過程產生浪費．考慮到此階段過高的酒精積累反而會抑制下一階段醋酸發(fā)酵過程中菌體的生長，進而降低醋酸的生成量，最終影響芡實醋的釀造品質．因此，后續(xù)試驗的探究中葡萄糖添加量均定為10 g/100 mL 而不再改動．

圖2 葡萄糖添加量對芡實漿發(fā)酵液酒精度的影響

（2）接種量對芡實醋酒精發(fā)酵階段的影響

由圖3 可知，當接種酵母菌量在一定范圍內不斷增大時，芡實漿發(fā)酵液中酵母產酒精的量不斷升高，并在菌量為0.40 %時達到峰值7.30 %，而后接種量繼續(xù)增大，酒精度不增反降．因為接種量較少時，酵母菌無法形成群體優(yōu)勢，而且還容易被其他與主發(fā)酵無關的雜菌所污染，環(huán)境適應較慢，菌體生長表現(xiàn)出較為緩慢的狀態(tài)，主發(fā)酵時間被一定程度拉長；但接種量絕不是越大越好，不然芡實漿中一部分營養(yǎng)成分會被酵母菌的生長、繁殖所消耗，因而留給菌體發(fā)酵的糖分有所減少，使得整體酒精度明顯降低，此外大量代謝廢物的累積引起發(fā)酵環(huán)境的劣變也使酵母菌無法很好的繼續(xù)發(fā)酵產酒精．因此，接種量選擇0.40 %為宜．

圖3 接種量對芡實漿發(fā)酵液酒精度的影響

（3）發(fā)酵溫度對芡實醋酒精發(fā)酵階段的影響

由圖4 可知，發(fā)酵溫度較低時，芡實漿發(fā)酵液的酒精度跟溫度的變化一致，且在30 ℃時達到峰值7.58 %，當溫度越過30 ℃以后，酒精度跟溫度的變化相反．這可能是因為外界環(huán)境溫度較低時，酵母菌無法充分發(fā)揮其發(fā)酵活力，其代謝糖分的速率不高，完成主發(fā)酵所需的時間相對延長；溫度較高時，酵母菌雖然前期急劇生長，但菌體衰老也將相應提前，不利于發(fā)酵產物酒精的積累，此時芡實漿發(fā)酵液也極易感染雜菌導致最終風味不良．此外，醇類、酯類、酸類等對發(fā)酵液風味有益的揮發(fā)性物質的產生和積累都需要在較低的溫度條件下進行，因此發(fā)酵溫度選擇30 ℃為宜.

圖4 發(fā)酵溫度對芡實漿發(fā)酵液酒精度的影響

（4）發(fā)酵時間對芡實醋酒精發(fā)酵階段的影響

由圖5 可知，發(fā)酵初期特別是前1.0～2.0 d，芡實漿發(fā)酵液酒精度急劇增加同時伴隨著大量氣泡產生，發(fā)酵2.0～3.0 d，酒精度繼續(xù)增加但速度有所下降，發(fā)酵3.0 d 以上，酒精度變化不大，基本維持在7.76 %．這主要是因為發(fā)酵前3.0 d，芡實漿中營養(yǎng)充足且pH 適宜，酵母菌在此良好環(huán)境下能旺盛的生長、繁殖并進行正常的代謝，酒精含量不斷增加，直至芡實漿液中養(yǎng)分被消耗殆盡．發(fā)酵3.0 d 以后，發(fā)酵環(huán)境不適大大影響酵母菌的活力，直至發(fā)酵過程終止酒精度都變化不大．因此，發(fā)酵時間選擇3.0 d 為宜.

圖5 發(fā)酵時間對芡實漿發(fā)酵液酒精度的影響

（5）pH 對芡實醋酒精發(fā)酵階段的影響

由圖6 可知，芡實漿發(fā)酵液的酒精度在一定pH 值范圍內先逐漸增加，達到峰值7.85 %后隨pH 值的繼續(xù)增加而明顯下降．這可能是因為不適宜的pH 值，易引發(fā)酵母菌異常的生長和代謝，進而影響芡實漿發(fā)酵液中酒精的積累．此外，過酸的條件往往伴有刺激性酸味，且不利于酯類物質的穩(wěn)定存在，這些都會嚴重影響芡實漿發(fā)酵液的風味；pH 過高使得發(fā)酵液的色澤偏深，不利于芡實漿發(fā)酵液的感官品質．因此，pH 選擇5.5 為宜.

圖6 pH 對芡實漿發(fā)酵液酒精度的影響

3.2 芡實醋酒精發(fā)酵階段響應面試驗結果與分析

（1）響應面設計、結果及方差分析．芡實醋酒精發(fā)酵階段Box-Behnken 設計方案與對應的試驗結果見表2．方差分析具體情況見表3．

表2 芡實醋酒精發(fā)酵過程Box-Behnken 設計與對應結果

表3 回歸模型的方差分析表

各發(fā)酵參數(shù)與芡實醋酒精發(fā)酵階段漿液中酒精度之間的回歸模型構建如下：

分析表3 數(shù)據和結果可知：該模型的P值小于0.000 1，因此極顯著，且失擬項的P值為0.069，因此不顯著；校正決定系數(shù)為0.968 1，即本試驗所選取的4 個變量可以解釋芡實漿酒精發(fā)酵液酒精度96.81 %的變異性；精密度RSN為25.25，即本試驗的精密度合理．以上分析表明，該回歸方程無論是擬合度還是可信度都很高，因此能較準確的分析和預測芡實醋酒精發(fā)酵階段的酒精度．

（2）交互作用影響．芡實醋酒精發(fā)酵階段不同因素兩兩之間的交互作用，可通過3D 響應面圖和與之相對應的等高線圖來體現(xiàn)．這樣立體圖和平面圖的表達形式也使得交互作用對試驗指標酒精度的影響規(guī)律變得更易觀察．

圖7 中a1和a2體現(xiàn)的是發(fā)酵各條件中，僅分析接種量X1與發(fā)酵溫度X2對芡實漿酒精發(fā)酵液酒精度的影響規(guī)律．a1圖呈現(xiàn)較明顯的陡坡，且投影得到的a2圖是非常明顯的橢圓形，這些都意味著兩參數(shù)的交互作用是顯著的．從a2圖還可以看出，酒精度沿發(fā)酵溫度軸向改變的更為稠密，即試驗指標酒精度受該因素影響相較于接種量更大一些．圖7 中b1所示的雙曲面同樣較為陡峭，b2所示的是與b1相對應的橢圓形等高線，b1和b2共同體現(xiàn)出發(fā)酵的溫度X2及時間X3具有明顯的交互影響．繼續(xù)分析可知，試驗指標酒精度隨因素發(fā)酵時間的變化幅度明顯小于發(fā)酵溫度，這就說明芡實醋酒精發(fā)酵階段的酒精度受發(fā)酵溫度的影響更大．圖7 中c1和c2反映在發(fā)酵溫度保持一定的情況下，芡實醋酒精發(fā)酵階段試驗指標酒精度隨pH 值的升高呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢；而在pH 值保持一定的情況下，芡實醋酒精發(fā)酵階段試驗指標酒精度隨發(fā)酵溫度的提高也呈現(xiàn)出先增后減的變化趨勢.由圖分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度X2和pHX4的交互較為明顯，且發(fā)酵溫度對芡實醋酒精發(fā)酵階段試驗指標的影響更大．

圖7 不同交互作用對芡實漿發(fā)酵液酒精度影響的響應面3d 圖及等高線平面圖

（3）響應面驗證試驗．由回歸模型分析可知，當所探究的發(fā)酵參數(shù)選取為接種量0.41 %，發(fā)酵溫度30.84 ℃，發(fā)酵時間2.97 d，pH 5.58 時，可得到最大響應值8.14 %.為了實驗更好操作和實施，也為了實驗的準確性和可控性，故將發(fā)酵工藝條件進行近似調整為接種量0.40 %，發(fā)酵溫度31.0 ℃，發(fā)酵時間3.0 d，pH5.6．按照修正后的參數(shù)開展驗證實驗，測得芡實醋酒精發(fā)酵結束后漿液中的酒精度為（8.09±0.05） %．此結果恰好在區(qū)間[8.06 %，8.23 %]內，即在95 %預測區(qū)間內，表明在所選的試驗范圍內，該模型是比較可靠和可信的.

4 結 論

利用天然食材中的生物活性成分結合優(yōu)良菌種的發(fā)酵作用釀造保健醋，進而開發(fā)保健醋飲料，是未來醋飲發(fā)展的趨勢和潮流．芡實因其獨特的功效性，作為保健醋的開發(fā)原料研究前景廣闊．在葡萄糖添加量10 g/100 mL，接種量0.40 %，發(fā)酵溫度31.0 ℃，發(fā)酵時間3.0 d，pH 5.6 的條件下，芡實醋酒精發(fā)酵液酒精度可達（8.09±0.05）%．滅菌后調整成分，接種醋酸菌繼續(xù)發(fā)酵，可制備酸度適宜、色澤亮黃的芡實醋成品．本研究可為芡實醋及其飲料的開發(fā)打下良好基礎.