部分水解瓜爾豆膠對(duì)阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用

李 濤, 許云聰, 陳峻波, 李延嘯, 閆巧娟, 江正強(qiáng),3,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院/食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)),北京 100083;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院,北京 100083; 3.中原食品實(shí)驗(yàn)室,河南 漯河 462300)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種普遍存在的神經(jīng)退行性疾病,會(huì)導(dǎo)致腦細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞之間的突觸連接喪失,從而導(dǎo)致認(rèn)知能力的逐步下降[1]。AD的特征是在大腦中存在與疾病相關(guān)的不同蛋白質(zhì)聚集物,即β淀粉樣蛋白(Aβ)組成的斑塊,以及Tau蛋白組成的神經(jīng)纖維纏結(jié)[2]。正常情況下,星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)清理碎片、回收神經(jīng)遞質(zhì)分子和支持突觸間的通信來(lái)幫助維持神經(jīng)元的健康和功能[3]。在AD患者的大腦中,星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,產(chǎn)生炎癥分子并聚集在蛋白斑塊周?chē)?。小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放促炎因子,如白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子α,這些炎性因子過(guò)度表達(dá)引起的神經(jīng)炎癥可導(dǎo)致磷酸化Tau的增加和海馬功能的損傷[4]。飲食是保證人體健康的一個(gè)重要因素,合理的飲食和營(yíng)養(yǎng)管理會(huì)降低與年齡相關(guān)疾病的發(fā)病率[5]。不健康的飲食習(xí)慣會(huì)破壞腸道菌群的平衡引起機(jī)體代謝異常和炎癥反應(yīng)等,進(jìn)而通過(guò)腸-腦軸誘發(fā)許多慢性疾病,也是導(dǎo)致AD的主要原因[6-7]。因此,健康飲食是緩解AD的一種安全有效的策略。

益生元被腸道微生物代謝,產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物,特別是短鏈脂肪酸,影響宿主生理健康[8]。研究表明益生元可通過(guò)改善抗氧化、降低腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)Aβ沉積和調(diào)節(jié)腸-腦軸等途徑減輕AD小鼠的認(rèn)知和行為障礙[9-11]。部分水解瓜爾豆膠(partially hydrolyzed guar gum,PHGG)是瓜爾豆膠通過(guò)β-甘露聚糖酶水解制備而成,是一種具有良好益生元活性及多種生理功能活性的水溶性膳食纖維。研究發(fā)現(xiàn),PHGG具有降膽固醇、降血脂和降血糖等利于機(jī)體代謝平衡的生理功效[12-13]。同時(shí),PHGG通過(guò)調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸影響脂聯(lián)素、胰島素的分泌,進(jìn)而改善高脂高糖飲食引起的糖脂代謝紊亂[14]。Liu等[15]研究表明,PHGG可通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和恢復(fù)腸道微生物群來(lái)改善D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠衰老。研究發(fā)現(xiàn),PHGG作為一種益生元,可被結(jié)腸內(nèi)腸道菌群利用,促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸菌和阿克曼菌的生長(zhǎng),增加短鏈脂肪酸的濃度,從而改善腸道功能[16-18];同時(shí),PHGG能夠通過(guò)改善機(jī)體腸道菌群進(jìn)而抑制便秘和炎癥反應(yīng)[19-21]。但是,PHGG對(duì)APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬通過(guò)行為學(xué)表現(xiàn)、神經(jīng)元損傷、病理特征蛋白表達(dá)和神經(jīng)炎癥等方面,探討PHGG對(duì)AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及其機(jī)理,旨在為研發(fā)天然抗AD的食品配料提供新資源和研究基礎(chǔ),并為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用PHGG提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

雄性SPF級(jí)APP/PS1小鼠12只及同窩野生型小鼠(C57BL/6J)6只,8月齡,體質(zhì)量為(30±2) g,至善健康(北京)醫(yī)學(xué)研究院,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(京)2021-0010。大小鼠繁殖飼料,含有碳水化合物(質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%)、脂肪(質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%)、蛋白質(zhì)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%),北京華阜康生物科技股份有限公司。飼料生產(chǎn)許可證編號(hào):京飼證(2019)06076。

PHGG,北京瓜爾潤(rùn)科技有限公司,生產(chǎn)控制參照GB 1886.301—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑半乳甘露聚糖》,平均分子質(zhì)量為2.5×104Da,寡糖(聚合度<7)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.9%,總膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.6%[22];β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(Bcl-2)抗體、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bax)抗體、Toll樣受體4(TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子κB-p65[NF-κB(p65)]、β淀粉樣多肽1-42(Aβ1-42)抗體、磷酸化Tau蛋白(p-Tau Thr231)抗體,英國(guó)Abcam公司;山羊抗兔IgG抗體,艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司;BCA蛋白檢測(cè)試劑盒,北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiskan FC型酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;Nikon Ci-S型倒置顯微鏡,日本尼康株式會(huì)社;BM-19AY型激光共聚焦顯微鏡,上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司;Tanon 4800型自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像儀,上海天能科技有限公司;XR-XM101型Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試儀、YLS-17B型避暗穿梭儀,上海欣軟信息科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物分組及處理

小鼠的飼養(yǎng)溫度保持在(25±2)℃,相對(duì)濕度保持在50%±10%,燈光始終保持12 h明暗交替狀態(tài)(7:00至19:00為白晝時(shí)間、19:00至次日7:00為黑夜時(shí)間)。所有小鼠均飼喂SPF級(jí)大小鼠繁殖飼料,飲用水為蒸餾水,保持小鼠自由飲水及攝食。經(jīng)過(guò)1周適應(yīng)期后,將小鼠隨機(jī)分為3組:野生型(C57BL/6J小鼠,WT)組,模型(APP/PS1小鼠,AD)組,部分水解瓜爾豆膠(APP/PS1小鼠,PHGG)組,每組6只。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和先前報(bào)道[15],設(shè)定PHGG組按照小鼠體質(zhì)量的PHGG干預(yù)劑量為1 000 mg/kg,將其添加在水中,野生型組和模型組不干預(yù)。采用自由飲水的給藥方式,實(shí)驗(yàn)周期3個(gè)月,期間每天監(jiān)測(cè)并記錄各組小鼠的體質(zhì)量。

實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后,小鼠禁食16 h,快速解剖,低溫取小鼠的腦、肝臟、心臟、腎臟、脾臟等臟器組織并稱(chēng)重,用生理鹽水清洗組織。用濾紙吸干后,稱(chēng)質(zhì)量。部分樣品固定于體積分?jǐn)?shù)10%的福爾馬林溶液中,保存在4 ℃冰箱,用于形態(tài)觀察。部分樣品凍存于-80 ℃冰箱,用于后續(xù)指標(biāo)分析。

1.3.2小鼠老化評(píng)分測(cè)定

采用日本京都大學(xué)竹田俊男和細(xì)川昌則教授制定的老化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[23],評(píng)定基于行為學(xué)和外觀改變的小鼠衰老等級(jí)。根據(jù)程度不同,每項(xiàng)指標(biāo)分為0～5共5個(gè)等級(jí)。

1.3.3水迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)圓形不銹鋼水池,池壁為白色,將水池分為4個(gè)虛擬象限。目標(biāo)象限的中央位置放直徑為10 cm,高為23.5 cm的圓形平臺(tái),整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間其位置保持不變,水池中水面高于平臺(tái)頂端約1.5 cm,水溫控制在(21±1)℃,實(shí)驗(yàn)期間迷宮周?chē)鷧⒄瘴锊蛔?迷宮上方安置攝像機(jī),同步記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡,實(shí)驗(yàn)分為2部分:1)定向航行實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持平臺(tái)的位置不變,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)將小鼠面向池壁放入水中,記錄其找到平臺(tái)的時(shí)間,即為逃避潛伏期。動(dòng)物上臺(tái)10 s后自動(dòng)停止采集。若小鼠在 60 s 規(guī)定時(shí)間內(nèi)未找到平臺(tái),則將逃避潛伏期記作 60 s,并人為誘導(dǎo)小鼠到達(dá)平臺(tái),停留10 s。2)空間探索實(shí)驗(yàn)。定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,撤除平臺(tái),將小鼠放入池中,自由探索60 s,記錄規(guī)定時(shí)間內(nèi)小鼠在虛擬平臺(tái)所在象限游泳的時(shí)間、路程及穿臺(tái)次數(shù)等指標(biāo)。

1.3.4避暗實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)裝置有避暗箱,分為明室和暗室,明室上方為鎢燈用以照明,暗室底部銅柵除靠近明室的3根外都可以通電,電壓為36 V,受接觸調(diào)壓器控制,兩室間有一門(mén)洞,供小鼠出入。實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)部分,即學(xué)習(xí)階段和記憶保持測(cè)驗(yàn)。1)學(xué)習(xí)階段。實(shí)驗(yàn)時(shí)小鼠面部背向洞口放入明室,未通電,讓其自由活動(dòng)3 min,再將小鼠趕入暗室,通交流電,小鼠受到電擊,其正常反應(yīng)是跑回明室,以躲避傷害性刺激。每只小鼠訓(xùn)練5 min。2)記憶保持測(cè)驗(yàn)。學(xué)習(xí)階段完成24 h后,重復(fù)測(cè)驗(yàn),保持銅柵處于通電狀態(tài),將小鼠面部背向洞口放入明室,記錄每只小鼠進(jìn)入暗室的潛伏期和3 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)。

1.3.5組織形態(tài)觀察

解剖小鼠,取大腦組織,放入體積分?jǐn)?shù)為10%中性福爾馬林溶液進(jìn)行固定,固定48 h后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)和尼氏染色,用倒置顯微鏡觀察H&E和尼氏染色組織切片。

1.3.6蛋白表達(dá)分析

冷凍小鼠全腦組織在蛋白裂解緩沖液裂解均質(zhì),然后離心收集上層清液。采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的SDS-PAGE將等量的蛋白樣品(20 μg)分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后,膜與一抗[Bax、Bcl-2、TLR4、NF-κB(p65),體積比1∶1 000稀釋]在4 ℃下過(guò)夜。用洗滌緩沖液洗滌后,用二抗(體積比 1∶5 000 稀釋)孵育1 h,用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶灰度進(jìn)行定量。以β-actin作為內(nèi)參。

1.3.7免疫組化檢測(cè)

免疫組化法檢測(cè)小鼠腦組織中β淀粉樣多肽1-42(Aβ1-42)的表達(dá)水平。玻片用二甲苯脫蠟,過(guò)氧化氫淬火。然后用體積分?jǐn)?shù)為10%正常山羊血清在室溫下阻斷1 h。切片與一抗(Aβ1-42抗體;體積比1∶100稀釋)4 ℃過(guò)夜,與二抗(體積比 1∶500 稀釋)孵育30 min。采用3,30-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色,使用熒光顯微鏡觀察圖像。

1.3.8免疫熒光檢測(cè)

小鼠腦組織經(jīng)體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定后,進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟和抗原修復(fù),用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%牛奶室溫封閉處理1 h。采用1∶200稀釋 p-Tau Thr231抗體室溫避光處理1 h。用體積分?jǐn)?shù)為1%牛奶清洗3遍,每次10 min。將山羊抗兔IgG抗體按稀釋比1∶500于體積分?jǐn)?shù)為5%牛奶中稀釋,室溫避光處理1 h。磷酸鹽緩沖液室溫避光清洗3遍,每次10 min。用DAPI染液處理15 min,PBS室溫避光清洗1遍,加一滴甘油,用蓋玻片覆蓋于載玻片上,指甲油密封蓋玻片和載玻片間的縫隙,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad prism 8軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。組間數(shù)據(jù)的顯著性分析采用一維方差分析(One-Way ANOVA)中的Tukey’s多重比較進(jìn)行。P<0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著差異,P<0.01表示數(shù)據(jù)具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PHGG對(duì)小鼠衰老特征的影響

小鼠衰老特征變化見(jiàn)圖1。由圖1(a)和圖1(b)可知,PHGG干預(yù)13周引起APP/PS1小鼠體質(zhì)量和攝食量增加,但差異不顯著(P>0.05)。由圖1(c)可知,相比WT組,AD組和PHGG組小鼠脾臟和腎臟組織的質(zhì)量均降低;與AD組相比,PHGG組小鼠腦、脾臟、心臟和腎臟的質(zhì)量增加。由圖1(d)和圖1(e)可知,與AD組相比,PHGG干預(yù)降低APP/PS1小鼠的衰老程度,其中反應(yīng)性、脫毛程度和脊柱后凸評(píng)分分別降低了38.9%(P<0.01)、31.3%(P<0.05)和35.7%(P<0.05)。

與WT組相比,*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01);與AD組相比,#表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),##表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。

2.2 PHGG對(duì)APP/PS1小鼠主動(dòng)學(xué)習(xí)記憶的影響

Morris水迷宮的定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2(a)和圖2(b)可知,第1天,各組的逃避潛伏期和游動(dòng)總距離無(wú)顯著差異。與WT組相比,AD組小鼠的逃避潛伏期和游動(dòng)總距離隨訓(xùn)練天數(shù)增加而顯著增加;與AD組相比,在第3和4天時(shí)PHGG組小鼠逃避潛伏期和游動(dòng)總距離均顯著降低(P<0.05)。第5天拆除平臺(tái),Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2(c)～2(f)。與WT組小鼠相比,AD組在目標(biāo)象限游動(dòng)的時(shí)間和距離明顯減少,穿越虛擬平臺(tái)的次數(shù)明顯減少(P<0.01)。與AD組相比,PHGG組小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的時(shí)間、距離和穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著增加,增加量分別為81.6%、58.0%和171.4%(P<0.05)。

與WT組相比,*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01);與AD組相比,#表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),##表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。

2.3 PHGG對(duì)APP/PS1小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)記憶能力的影響

小鼠避暗測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖3。與WT組小鼠相比,AD組小鼠逃避潛伏期顯著降低,錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加(P<0.01);與AD組小鼠相比,PHGG干預(yù)顯著增加了AD小鼠的逃避潛伏期,增加量為71.6%(P<0.05),錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少了39.1%(P<0.05)。

與WT組相比,*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01);與AD組相比,#表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),##表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。

2.4 PHGG對(duì)小鼠神經(jīng)元損傷的影響

小鼠大腦組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4(a)可知,與WT小鼠相比,AD小鼠大腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞疏松散亂,部分細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)不清晰的現(xiàn)象,細(xì)胞形狀發(fā)生改變,呈現(xiàn)不規(guī)則齒狀形態(tài)。與AD模型小鼠相比,PHGG組小鼠錐體細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞形態(tài)較完整,核仁清晰。由圖4(b)可知,大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量均顯著增加,增加量分別為76.1%和30.8%(P<0.05)。由圖4(c)和圖4(d)可知,與AD模型小鼠相比,PHGG組顯著降低了小鼠大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷,表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量均顯著增加,增加量分別為47.4%(P<0.01)和19.0%(P<0.05)。由圖4(e)和圖4(f)可知,免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與WT小鼠相比,AD小鼠全腦組織中Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比率顯著下降;而與AD組小鼠相比,PHGG干預(yù)組顯著增加了54.9%(P<0.05)。

與WT組相比,*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01);與AD組相比,#表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),##表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。

2.5 PHGG對(duì)小鼠大腦Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達(dá)的影響

小鼠大腦組織HE染色結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5(a)可知,與WT組相比,AD組APP/PS1小鼠大腦組織有大量的Aβ1-42斑塊沉積。小鼠大腦組織尼氏染色結(jié)果見(jiàn)圖5(b)。然而,PHGG干預(yù)組較AD組小鼠大腦皮層和海馬區(qū)Aβ1-42蛋白表達(dá)量顯著降低,降低量分別為32.0%和55.0%(P<0.05)。小鼠大腦組織中Aβ1-42和磷酸化Tau蛋白表達(dá)水平見(jiàn)圖5(c)和圖5(d)。AD組小鼠大腦皮層和海馬區(qū)磷酸化Tau(Thr231)蛋白表達(dá)量較WT組小鼠顯著升高(P<0.01)。與AD組相比,PHGG組小鼠大腦皮層和海馬區(qū)磷酸化Tau蛋白表達(dá)水平分別下降了52.3%和62.6%(P<0.01)。

與WT組相比,*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01);與AD組相比,#表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),##表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。

2.6 PHGG對(duì)小鼠大腦TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

小鼠大腦組織中TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平見(jiàn)圖6。與WT組相比,AD組APP/PS1小鼠全腦組織中TLR4和NF-κB的蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)。然而,PHGG干預(yù)顯著下調(diào)了TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá),降低量分別為42.0%(P<0.05)和46.8%(P<0.05)。結(jié)果表明,PHGG抑制了AD小鼠全腦組織中TLR4/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)。

與WT組相比,*表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),**表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01);與AD組相比,#表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05),##表示組間數(shù)據(jù)差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

AD與各種腦功能障礙有關(guān),主要病理特征包括記憶障礙、神經(jīng)元喪失、Aβ斑塊沉積和過(guò)度磷酸化Tau蛋白纏結(jié)聚集[24-25]。益生元促進(jìn)了腸道有益菌及其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,進(jìn)一步調(diào)節(jié)腸道免疫和黏膜穩(wěn)態(tài),從而有效地改善阿爾茨海默病[26-27]。APP/PS1小鼠作為一種理想的AD動(dòng)物模型,6月齡時(shí)大腦開(kāi)始出現(xiàn)Aβ斑塊沉積并表現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙[28]。PHGG作為可溶性膳食纖維,具有改善腸道健康的生理作用[29]。研究表明,PHGG通過(guò)改善腸道菌群來(lái)抑制炎癥、非酒精性脂肪肝或衰老[15,21,30]。因此,PHGG可能會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)改善阿爾茨海默病。本研究則主要探討PHGG獨(dú)立于腸道菌群對(duì)APP/PS1小鼠的改善作用。

記憶力的減退和喪失是AD的主要表現(xiàn)[31]。水迷宮和避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,膳食補(bǔ)充PHGG顯著改善了APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)和記憶障礙,表現(xiàn)為進(jìn)入目標(biāo)象限的時(shí)間、距離和穿越平臺(tái)的次數(shù)增加了81.6%、58.0%、171.4%;進(jìn)入電場(chǎng)錯(cuò)誤次數(shù)降低了39.1%(圖2和圖3)。水迷宮實(shí)驗(yàn)表明,巴戟天寡糖干預(yù)APP/PS1小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的時(shí)間僅增加了31.7%[32]。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的功能單位,也是學(xué)習(xí)記憶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[33]。本研究PHGG干預(yù)顯著增加了APP/PS1小鼠大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量[圖4(b)和圖4(d)]。海馬區(qū)是學(xué)習(xí)和記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的重要區(qū)域。海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量的減少會(huì)影響樹(shù)突棘的形成,進(jìn)而引起突觸可塑性變化,從而影響學(xué)習(xí)和記憶能力[34]。研究表明,攝入廣西長(zhǎng)壽老人飲食的膳食纖維復(fù)合物能夠抑制小鼠大腦組織海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量的減少[35]。目前,普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡最常見(jiàn)的機(jī)制。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡蛋白和促進(jìn)凋亡蛋白,其比率決定細(xì)胞凋亡發(fā)生與否[36]。PHGG干預(yù)導(dǎo)致APP/PS1小鼠腦組織Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比率增加了54.9%[圖4(f)]。因此,PHGG可能通過(guò)改善細(xì)胞凋亡來(lái)抑制神經(jīng)元損傷,從而提升APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

AD最主要的一個(gè)病理學(xué)特征是Aβ在大腦中過(guò)度積累[37]。Aβ沉積導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)目減少,進(jìn)而影響突觸的傳遞性和可塑性,損害學(xué)習(xí)和記憶功能。PHGG干預(yù)導(dǎo)致APP/PS1小鼠大腦皮層和海馬區(qū)Aβ1-42蛋白表達(dá)量分別降低了32.0%和55.0%[圖5(b)],PHGG可能通過(guò)抑制Aβ在腦中的積累來(lái)改善神經(jīng)元損傷。研究發(fā)現(xiàn),龍舌蘭果聚糖復(fù)合物能夠抑制AD小鼠腦中Aβ聚集[38]。磷酸化Tau蛋白在大腦皮層和海馬區(qū)的聚集反映了AD的發(fā)生和發(fā)展情況[39]。Tau蛋白過(guò)度磷酸化,形成神經(jīng)纖維纏結(jié),導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[40]。與AD組相比,PHGG組小鼠大腦皮層和海馬區(qū)磷酸化Tau蛋白表達(dá)水平均顯著下降[圖5(d)],這表明PHGG可通過(guò)降低腦組織內(nèi)磷酸化Tau蛋白水平來(lái)抑制神經(jīng)元損傷進(jìn)而改善AD。因此,PHGG可能通過(guò)降低腦組織內(nèi)β淀粉樣蛋白與磷酸化Tau蛋白水平來(lái)抑制神經(jīng)元損傷,進(jìn)而改善APP/PS1小鼠的認(rèn)知障礙。

神經(jīng)炎癥是AD的標(biāo)志和發(fā)病的主要原因[41]。研究表明,TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活了大腦的神經(jīng)炎癥[42]。PHGG干預(yù)抑制了AD小鼠全腦組織中TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)(圖6),表明PHGG可改善AD小鼠大腦神經(jīng)炎癥。NF-κB可被Aβ激活并促進(jìn)Aβ產(chǎn)生,而過(guò)度激活NF-κB信號(hào)通路可增強(qiáng)Tau蛋白纏結(jié)[43]。因此,PHGG可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路降低大腦中β淀粉樣蛋白與磷酸化Tau蛋白的表達(dá)改善AD小鼠神經(jīng)元損傷。

4 結(jié) 論

本研究從行為學(xué)表現(xiàn)、神經(jīng)元損傷、β淀粉樣蛋白與磷酸化Tau蛋白表達(dá)和神經(jīng)炎癥等方面,闡明PHGG對(duì)AD的改善作用。PHGG改善了APP/PS1 AD小鼠的衰老特征和記憶損傷。同時(shí),PHGG干預(yù)增加了大腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量,降低了β淀粉樣蛋白和磷酸化Tau蛋白表達(dá),抑制了TLR4和NF-κB蛋白的表達(dá)。因此,PHGG可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB炎癥通路降低了大腦中病理特征蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制神經(jīng)元損傷,從而改善了APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。PHGG有望作為功能性食品的配料,發(fā)揮抗AD的功能活性。