太空香蕉‘天成1 號’枯萎病菌的分離鑒定

盧麗俐，林文珍，王金英，郭 鶯，蔡長福，蔡邦平*

(1. 廈門市園林植物園，福建 廈門 361003；2. 福建省亞熱帶植物研究所 / 福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361006)

香蕉Musa×paradisiaca是世界上最重要的水果之一，也是發(fā)展中國家最重要的四大作物之一[1]。我國是香蕉生產(chǎn)大國，也是重要的消費(fèi)大國[2]。然而，世界各地香蕉產(chǎn)業(yè)正受到各類病害的威脅，其中由古巴尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporumf. sp.cubense(Foc)引起的香蕉枯萎病是一種毀滅性的土傳病害[3—5]，給香蕉生產(chǎn)造成重大損失。

目前，已鑒定的尖孢鐮刀菌萎蔫專化型生理小種有8個(gè)，其中4個(gè)可以引起香蕉枯萎病[6—8]。這4個(gè)生理小種危害的香蕉品種各不相同，F(xiàn)oc1號生理小種主要侵染大蜜哈(Gros Michel，AAA)，全世界都有發(fā)生；Foc2號生理小種僅局限在中美洲，只侵染三倍體雜種棱香蕉(Bluggoe, ABB)和其他相近的煮食香蕉；Foc3號生理小種只侵染羯尾蕉屬Heliconia的野生種；Foc4號生理小種不僅侵染矮稈香芽蕉(Dwarf Cavendish，AAA)，還侵染所有對Foc1號和Foc2號生理小種感病的品種，是目前致病力最強(qiáng)的病菌[5,9]。在我國普遍存在的香蕉枯萎病致病菌多為Foc1和Foc4[10—11]。因此，香蕉枯萎病的防控及抗病育種已成為香蕉生產(chǎn)的研究熱點(diǎn)[12—13]，對香蕉產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。

本研究的香蕉品種為自主選育的太空誘變新品種‘天成1號’M.×paradisiaca‘Tiancheng No. 1’(MusaAAA Cavendish subgroup)。該品種是利用‘巴西蕉’M.×paradisiaca‘Baxijiao’為材料，于2002年搭載“神舟4號飛船”，經(jīng)外太空輻射誘變而獲得的，具有高產(chǎn)、早熟、抗逆性強(qiáng)、耐貯存等優(yōu)點(diǎn)，目前在福建東南沿海的漳州、廈門、莆田等地區(qū)進(jìn)行區(qū)域種植試驗(yàn)。在區(qū)域試驗(yàn)過程中，在漳州部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)有‘天成1號’枯萎植株，其癥狀與鐮刀菌枯萎病相似。本實(shí)驗(yàn)利用分子檢測技術(shù)對分離的病原菌進(jìn)行鑒定，以期明確該品種枯萎病病原菌，為‘天成1號’推廣種植的枯萎病防控提供重要的基礎(chǔ)資料，也為香蕉枯萎病的抗病種質(zhì)資源篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2022年7～8月從漳州天寶香蕉種植基地采集香蕉‘天成1號’典型發(fā)病植株，用于病菌分離(圖1)。由福建省林業(yè)科技中心提供的香蕉‘天成1號’組培無菌苗用于病菌致病性測定。組培苗用無菌盆土培養(yǎng)，待長出4～5片葉、株高12～16 cm時(shí)接種病菌。

圖1 太空香蕉‘天成1 號’枯萎病病株Fig. 1 Fusarium wilt of banana ‘Tiancheng No. 1’

1.2 方法

1.2.1 病菌分離純化

用常規(guī)的組織分離法分離香蕉‘天成1號’枯萎病病原菌[14]。將發(fā)病植株假莖基部作為分離材料，在病健交界處切取0.5 cm × 0.5 cm小塊組織，先用0.1%升汞消毒3～5 min，再用75%乙醇消毒35～50 s，之后用無菌水沖洗3次，把病菌組織放入PDA培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3～4 d。挑取病菌組織上產(chǎn)生的霉?fàn)钗镞M(jìn)行純化培養(yǎng)。觀察菌株生長性狀，在顯微鏡下觀察菌株形態(tài)特征。

1.2.2 致病性測定

采用灌根接種法將分離純化的病原菌回接蕉苗[15—16]。菌株在PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃，170 r·min–1，震蕩培養(yǎng)5 d，無菌紗布過濾培養(yǎng)液。將制備好的病原菌孢子懸液澆施在有傷根的香蕉‘天成1號’幼苗種植土壤中，每盆1株，3次重復(fù)。每盆澆施量50 mL，無菌水作空白對照。香蕉苗置于26 ℃人工氣候培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)。從接種后第5天開始觀察發(fā)病情況，并從病株上重新分離病原菌。

1.2.3 病原菌菌株鑒定

將純化的菌株接種至PDA培養(yǎng)基，28 ℃恒溫、避光培養(yǎng)4～5 d，觀察菌落形態(tài)特征，對病原菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[17—18]。

采用全式金的EasyPure? Genomic DNA Kit方法提取菌株的菌絲體DNA，擴(kuò)增ITS序列，擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司測序[19—20]。測序結(jié)果通過NCBI進(jìn)行BLAST比對分析，并從NCBI上下載同源性較高的堿基序列，用軟件MEGA11構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定病原菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌株的形態(tài)特征

從香蕉‘天成1 號’枯萎病病株上分離得到一株病原菌LWZ-XJ-4，在PDA 上純化培養(yǎng)，菌落圓形，培養(yǎng)4 d，菌落直徑5.5 cm。氣生菌絲絨狀、白色、纖細(xì)濃密，培養(yǎng)基底面呈紅色或紫紅色(圖2A)，能產(chǎn)生分生孢子。鏡檢發(fā)現(xiàn)，分生孢子較多(圖2B)，含質(zhì)體，略透明，大型分生孢子數(shù)量最多，鐮刀形，兩頭稍尖，稍彎，有3 至多個(gè)隔膜，一般為3 個(gè)隔膜，長30.1～54.1 μm × 3.6～4.0 μm，小型分生孢子多為橢圓形、無隔，長9.5～16.6 μm × 2.5～4.0 μm。厚垣孢子為透明狀球形(圖2C)，單生，直徑1.7～9.5 μm。根據(jù)菌落形態(tài)和顯微鏡鏡檢結(jié)果，初步確定該病原菌為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum。

圖2 病原菌菌落形態(tài)及顯微特征Fig. 2 Colony morphology and microscopic characteristics of pathogenic bacteria

2.2 接種蕉苗發(fā)病癥狀

人工灌根接種病菌5 d后，蕉苗開始出現(xiàn)黃葉癥狀。隨著時(shí)間的推移，蕉苗發(fā)病癥狀更嚴(yán)重，25 d后蕉苗基本枯萎死亡。發(fā)病初期，香蕉葉片邊緣變黃，逐漸擴(kuò)展至主脈。病葉由下至上、由外至里出現(xiàn)黃色斑塊、萎蔫，最后整株枯萎死亡(圖3)。剖開蕉苗球莖發(fā)現(xiàn)，球莖組織已全部變黑、腐爛，假莖組織可見紅色斑點(diǎn)和線條狀病變(圖3)，根黑褐色，基部腐爛，植株易倒伏。接種病原菌蕉苗植株生長不良、矮小、萎蔫，心葉抽不出，生長停滯枯萎。對照植株未出現(xiàn)任何病癥，長勢健壯良好。

圖3 灌根接種蕉苗25 d 后發(fā)病情況Fig. 3 Symptoms of banana ‘Tiancheng No. 1’ after 25 d artificial inoculation

2.3 病原菌株的分子鑒定

對病原菌菌株LWZ-XJ-4的ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增，測得堿基序列(圖4)，序列長573 bp。對病原菌株的測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果表明，菌株LWZ-XJ-4與尖孢鐮刀菌屬序列同源性≥90%，利用軟件MEGA11構(gòu)建以尖孢鐮刀菌rDNA-ITS序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)，發(fā)現(xiàn)菌株LWZ-XJ-4與尖孢鐮刀菌香蕉轉(zhuǎn)化型菌株Fusariumoxysporum，LT571434.1的進(jìn)化距離最近。

圖4 菌株LWZ-XJ-4 的rDNA-ITS 序列Fig. 4 rDNA-ITS sequence of strain LWZ-XJ-4

圖5 基于rDNA-ITS 序列構(gòu)建的菌株LWZ-XJ-4 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree constructed by strain LWZ-XJ-4 based on rDNA-ITS sequence

對發(fā)病植株再次組織分離獲得的病原菌，其病原形態(tài)特征與接種病原菌形態(tài)完全一致。根據(jù)菌落形態(tài)、致病性測定結(jié)果和結(jié)合田間癥狀，最終確定引起太空香蕉‘天成1號’枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum；經(jīng)分子檢測，該病原菌與尖孢鐮刀菌古巴?；? 號生理小種Fusariumoxysporumf. sp.cubenseRace 4 進(jìn)化距離最近。

3 討論

香蕉枯萎病是一種傳染性較強(qiáng)的國際檢疫性病害，對全球香蕉產(chǎn)業(yè)造成了巨大的損失[21]。在我國香蕉主產(chǎn)區(qū)枯萎病的發(fā)病情況也十分嚴(yán)重，不僅直接影響香蕉產(chǎn)量，而且迫使蕉農(nóng)頻繁地?fù)Q地種植，從而造成生產(chǎn)資料和土地資源浪費(fèi)，導(dǎo)致種植成本居高不下[22]。目前在病區(qū)除了種植抗病品種，尚無十分有效的防治措施[23]，因此選育和種植抗病品種是防控香蕉枯萎病的主要途徑[24]。近年來，我國通過雜交育種[25]、突變育種[2]、生物技術(shù)育種等手段開展香蕉抗病品種的研究工作，并取得一些成果, 先后培育出多個(gè)抗(耐)病品種，如廣東省農(nóng)科院選育的‘粵科1號’‘粉雜1號’‘中蕉9號’等[12—13,25—26]。在國外，Bhagwat等[28]利用咖嗎射線培養(yǎng)香蕉外植體后發(fā)現(xiàn)，部分組培苗表現(xiàn)出一定的抗病性。印度研究人員通過香蕉懸浮細(xì)胞輻射誘變獲得抗香蕉枯萎病1號生理小種的抗病系“Maca”[29]。太空香蕉‘天成1號’是經(jīng)過外太空輻射選育的新品種，具有優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的特點(diǎn)，但對枯萎病的抗性情況一直未有研究。本研究首次就該品種枯萎病感病情況及致病菌開展研究，通過病原菌的分離、純化及鑒定，明確了引起香蕉‘天成1號’枯萎病的病菌為尖孢鐮刀菌，且其與古巴?；?號生理小種親緣性最近。明確該病害及其致病菌，可為今后香蕉枯萎病研究和綜合防治提供依據(jù)。

尖孢鐮刀菌的遺傳變異存在復(fù)雜性和多樣性，不同生理小種的致病性差異明顯，同一生理小種的不同菌株之間也存在致病性差異[30]。目前尖孢鐮刀菌有4 個(gè)生理小種，其中Foc4 號生理小種是我國香蕉枯萎病的主要致病菌，在熱帶和亞熱帶地區(qū)均可以致病，且致病力最強(qiáng)，幾乎可以侵染所有香蕉栽培品種[21]，曾經(jīng)使得我國臺灣地區(qū)的香蕉種植面積在20 世紀(jì)70 年代減少了90%[31]。本文結(jié)合rDNAITS 分子檢測手段對分離的病原物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)引起太空香蕉‘天成1 號’枯萎病病原菌與Foc4 號生理小種進(jìn)化距離最近。目前太空香蕉‘天成1 號’處于試種栽培階段，其抗病性及果實(shí)品質(zhì)有待進(jìn)一步驗(yàn)證。