基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃芪治療慢傳輸型便秘的作用機(jī)制

施 敏 劉富林 夏旭婷 張 婷

(湖南中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)沙,410208)

慢傳輸型便秘(Slow Transit Constipation,STC)是指因?yàn)榻Y(jié)腸傳輸功能障礙而導(dǎo)致的腸內(nèi)容物滯留或排出不順利的狀態(tài)[1]。Preston和Lennard-Jones[2]在1986年首次提出STC的概念,認(rèn)為臨床主要以便意減退或消失、便次減少,糞質(zhì)干結(jié)、排便不暢并伴隨腹部不適等癥狀為主要表現(xiàn)。流行病學(xué)研究顯示,STC在慢性便秘中發(fā)病率占首位[3],其發(fā)病機(jī)制尚不明確,現(xiàn)有研究認(rèn)為可能與腸神經(jīng)遞質(zhì)、Cajal間質(zhì)細(xì)胞、腸道菌群等多種因素有關(guān)[4-6]。STC不僅嚴(yán)重影響患者的生命質(zhì)量,且易導(dǎo)致肛腸、心腦血管等危險(xiǎn)疾病發(fā)生。目前西醫(yī)主要有藥物和手術(shù)治療[7],而西藥有一定的依賴性和不良反應(yīng),手術(shù)治療存在風(fēng)險(xiǎn)性,STC在中醫(yī)學(xué)歸屬于便秘范疇,傳統(tǒng)中醫(yī)治療STC有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)作用[8]。STC多以虛證為主,少有實(shí)證?！兜は姆āて⒓s丸論》云:“胃強(qiáng)脾弱,約束津液不得四布……故曰脾約……脾弱不得通也。”故STC治療重點(diǎn)在于健脾益氣。黃芪有健脾益氣的功效,現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,黃芪有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用,尤其適用于體虛的老年便秘患者[9]。單崇武[10]用黃芪湯加味治療將50例肺脾氣虛型功能性便秘患者,觀察組總有效率為88.0%,高于對(duì)照組50例的70.0%。

本研究基于系統(tǒng)生物學(xué)相關(guān)理論[11],借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù),探討黃芪的活性化合物與靶點(diǎn)之間的關(guān)系,探究黃芪多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療STC的作用機(jī)制,以期為黃芪治療STC提供科學(xué)依據(jù)與臨床應(yīng)用參考。

1 資料與方法

1.1 黃芪活性成分和靶蛋白 應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索并結(jié)合文獻(xiàn)[12-17]篩選黃芪的活性成分,以類(lèi)藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18和口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%進(jìn)行篩選,得到黃芪的有效成分,并下載其分子結(jié)構(gòu),同時(shí)檢索活性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白。篩選完成后統(tǒng)一在Uniprot(https://www.uniprot.org/)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)、美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等數(shù)據(jù)庫(kù)輸入靶點(diǎn)蛋白名稱,限定物種為“Homo sapiens”將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

1.2 STC疾病靶點(diǎn)篩選 在人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,http://omim.org/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org)中輸入關(guān)鍵詞“slow transit contipation”檢索疾病靶點(diǎn)。去除重復(fù)靶點(diǎn)并經(jīng)Uniprot校正整合得到STC相關(guān)靶點(diǎn)。運(yùn)用R語(yǔ)言(VennDiagram包)將黃芪有效成分的靶蛋白與STC疾病靶點(diǎn)取交集,得到黃芪治療STC的靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建黃芪中藥-活性成分-疾病靶基因網(wǎng)絡(luò)圖 借助Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建中藥-活性成分-疾病基因網(wǎng)絡(luò),并計(jì)算其相關(guān)網(wǎng)絡(luò)特征值。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction,PPI) 將黃芪與STC交集靶基因?qū)隨tring(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù),將物種設(shè)定為“Homo sapiens”,相互作用閾值設(shè)定為“median confidence”(0.4),其余均為默認(rèn)設(shè)置,獲取交互作用,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并計(jì)算其網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)靶基因Degree,采用R語(yǔ)言繪制Degree最大的前20個(gè)靶基因的柱狀圖。將得到的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入CytoScape3.7.2,借助CytoNCA插件分析靶點(diǎn)的連接度(Degree)、介度(Betweenness)等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù),根據(jù)Degree和Betweenness≥2倍中位數(shù)篩選核心靶點(diǎn)。將疾病與中藥取交集得到的基因進(jìn)行PPI分析,得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖其中“邊”代表作用靶基因之間的關(guān)聯(lián),粗細(xì)用combine score表示,“邊”越粗,combine score值越大,代表其結(jié)合度越大;節(jié)點(diǎn)代表作用靶基因。

1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 應(yīng)用R語(yǔ)言(dose、clusterProfiler、enrichplot包)從生物過(guò)程(Biological Process,BP),細(xì)胞組分(Cellular Component,CC),分子功能(Molecular Function,MF)進(jìn)行GO通路富集分析,同時(shí)進(jìn)行KEGG通路富集分析,設(shè)定閾值P<0.05,繪制條形圖和氣泡圖以進(jìn)一步揭示黃芪治療STC的作用機(jī)制。

1.6 分子對(duì)接 在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)下載核心靶蛋白的3D結(jié)構(gòu)pdb格式文件,用Pymol軟件移去水分子和配體分子,在TCMSP中下載化合物3D結(jié)構(gòu)的mol格式。導(dǎo)入Swiss Dock在線分子對(duì)接工具(http://www.swissdock.ch/)將靶點(diǎn)與黃芪活性成分進(jìn)行對(duì)接,用以評(píng)價(jià)活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的對(duì)接效果。

2 結(jié)果

2.1 篩選黃芪的活性成分和靶蛋白 篩選到黃芪所含20個(gè)活性成分。見(jiàn)表1。篩選出作用靶基因953個(gè),去重后獲得相關(guān)靶基因189個(gè)。

表1 黃芪主要活性成分

2.2 STC疾病靶基因 篩選從GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分別得到STC靶基因3 278個(gè)、143個(gè),整合后共3 817個(gè),經(jīng)過(guò)Uniprot校正整合后得到3 174個(gè),將其與2.1得到的藥物作用靶基因189個(gè)借助R語(yǔ)言取交集得到PGR、NOS2、PTGS1、AR、SCN5A等共143個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 藥物-疾病交集基因韋恩圖

2.3 構(gòu)建黃芪中藥活性成分-疾病靶基因網(wǎng)絡(luò)圖 得到黃芪-活性成分-疾病靶基因網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2。各節(jié)點(diǎn)上連線越多,代表其相關(guān)的靶基因和成分越多。

圖2 黃芪活性成分-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)浞治?共有143個(gè)節(jié)點(diǎn)、2 353條邊,平均節(jié)點(diǎn)度為32.9,平均局部聚類(lèi)系數(shù)為0.619。見(jiàn)圖3。

圖3 靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)

Degree最大的前20個(gè)靶基因。Degree值排名前10位的核心節(jié)點(diǎn)分別為AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、JUN、MYC、MAPK8、EGF、EGFR、MAPK1。見(jiàn)圖4。

圖4 靶基因Degree值柱狀圖

Degree值排在前10位的分別為JUN、VEGFA、AKT1、CASP3、IL-6、MAPK1、EGF、MAPK8、MYC、EGFR。黃芪治療STC的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖5。

圖5 靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析 GO功能富集分析得到GO條目2 173個(gè),其中生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能各1 943個(gè)、77個(gè)、153個(gè)。生物過(guò)程主要與對(duì)脂多糖的回應(yīng)、對(duì)細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、對(duì)抗生素的反應(yīng)等信號(hào)通路有關(guān);在細(xì)胞組分主要與薄膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、突觸后膜的組成部分等信號(hào)通路有關(guān);在分子功能主要與核受體結(jié)合、類(lèi)固醇激素受體活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、組蛋白激酶活性、泛素-蛋白連接酶結(jié)合等信號(hào)通路有關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 GO功能富集分析結(jié)果

KEGG富集分析共得到163條信號(hào)通路,可知黃芪可通過(guò)乙型肝炎、前列腺癌、IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等作用通路發(fā)揮對(duì)STC的治療作用,KEGG通路富集分析結(jié)果前20個(gè)條形圖和氣泡圖,條形圖顏色代表富集程度,條形長(zhǎng)度代表富集的基因數(shù)目,氣泡圖顏色代表富集程度,氣泡大小代表富集的基因數(shù)目。見(jiàn)圖6。

圖6 KEGG通路富集分析條形圖和氣泡圖

2.6 分子對(duì)接 分子對(duì)接結(jié)果顯示葉酸、1,7-二羥基-3,9-二甲氧基紫檀素、山柰酚、槲皮素4種成分與5個(gè)靶點(diǎn)結(jié)合比較緊密。見(jiàn)表3。蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合越緊密,結(jié)合能值越低,可看出葉酸和IL-6形成氫鍵作用,使得蛋白與化合物形成穩(wěn)定的復(fù)合物。見(jiàn)圖7。

圖7 葉酸與IL-6對(duì)接圖

表3 分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

慢傳輸型便秘是由于大腸傳導(dǎo)功能紊亂而導(dǎo)致的排便困難,中醫(yī)學(xué)歸屬不大便、脾約等范疇[18]。其病機(jī)主要為氣虛大腸傳導(dǎo)無(wú)力。本病屬本虛標(biāo)實(shí),主要以脾氣虛為主?！栋Y因脈治》中指出氣虛則大腸傳道失司,腸失濡潤(rùn)致糟粕傳送失常,形成腑氣不通,而致便秘[19]。黃芪有補(bǔ)氣健脾、升陽(yáng)舉陷、利水消腫的功效,臨床上用于治療肺脾氣虛證等。有研究表明,黃芪可明顯升高脾虛小鼠Hb值、LAK細(xì)胞活性、白細(xì)胞介素-2活性及CD4+/CD8+細(xì)胞比值,并對(duì)其免疫功能低下有改善作用[20]。余克強(qiáng)等[21]通過(guò)對(duì)26項(xiàng)研究1 955例患者進(jìn)行Meta分析證明以黃芪為主的中成藥或方劑治療氣虛型功能性便秘安全有效。

本研究從化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖可知,黃芪中山柰酚、葉酸、槲皮素、異鼠李素、芒柄花素等20個(gè)化合物作用于STC疾病相關(guān)的143個(gè)靶點(diǎn),說(shuō)明了黃芪是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮治療STC的作用。String在線數(shù)據(jù)庫(kù)所得PPI網(wǎng)絡(luò)顯示節(jié)點(diǎn)度排名前的核心節(jié)點(diǎn)有AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、JUN。核心基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖拓?fù)浞治鼋Y(jié)果中Degree值靠前的有JUN、VEGFA、AKT1、CASP3、IL-6。二者取交集得到黃芪治療STC的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)AKT1、JUN、IL-6、VEGFA、CASP3。

AKT1是PI3K/AKT信號(hào)通路下游的主要靶點(diǎn),主要參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[22]。張高松[23]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究推導(dǎo)出AKT在STC大鼠表達(dá)的減少可能是STC發(fā)病機(jī)制之一?，F(xiàn)有研究認(rèn)為JUN主要與癌癥的發(fā)生有關(guān),JUN癌基因激活后其蛋白以JUN或JUN同源二聚體的形式結(jié)合到轉(zhuǎn)錄激活蛋白1啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn),誘導(dǎo)癌基因表達(dá),參與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[24-25]。IL-6具有廣泛的促炎癥反應(yīng)作用,其過(guò)度表達(dá)會(huì)造成腸道炎性病變[26],并可導(dǎo)致胃腸運(yùn)動(dòng)及分泌功能紊亂,其作用機(jī)制可能與激活胃腸道黏膜下層的神經(jīng)元影響腎上腺應(yīng)激反應(yīng)和胃腸蠕動(dòng)有關(guān)[27]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A基因的表達(dá)可使腸道細(xì)胞間的緊密連接松弛,損傷腸黏膜屏障從而導(dǎo)致腸道微生物入侵腸壁[28]。李超[29]報(bào)道胱天蛋白酶3是細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵角色,腸細(xì)胞的非正常凋亡可能會(huì)引起腸黏膜屏障破壞受損,進(jìn)一步造成STC的發(fā)生。GO富集分析預(yù)測(cè)出黃芪對(duì)STC的治療機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)脂多糖的回應(yīng)、對(duì)細(xì)菌起源的分子反應(yīng)、薄膜筏、膜微區(qū)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、核受體結(jié)合、類(lèi)固醇激素受體活性產(chǎn)生作用的。

KEGG富集分析預(yù)測(cè)出黃芪對(duì)STC的治療機(jī)制可能是通過(guò)流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎、IL-17信號(hào)通路產(chǎn)生作用的,結(jié)合黃芪主要活性成分和其作用靶點(diǎn),我們推測(cè)黃芪可能通過(guò)抗炎、提高免疫、保護(hù)腸黏膜屏障、調(diào)節(jié)腸道菌群和神經(jīng)遞質(zhì)等作用機(jī)制,從而促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng),達(dá)到益氣健脾、通陽(yáng)利水的功效,改善STC癥狀。

本研究得到的相關(guān)通路雖然與目前研究較多的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子/生長(zhǎng)因子受體α1/神經(jīng)細(xì)胞黏附分子、SCF/c-kit、5-羥色胺、cAMP依賴性蛋白激酶和促分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酶C-γ1/PLC-γ2等典型的治療STC信號(hào)通路不大相同[30-34],說(shuō)明了黃芪治療STC是以多靶點(diǎn)、多通路的形式來(lái)發(fā)揮作用的,也恰恰體現(xiàn)了黃芪多功效治療STC的特點(diǎn)。

黃芪有效成分與STC疾病靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果顯示山柰酚、葉酸、槲皮素與JUN、VEGFA、AKT1、CASP3、IL-6核心靶點(diǎn)結(jié)合較好。相關(guān)研究顯示槲皮素可抑制腸炎小鼠血清中髓過(guò)氧化物酶、丙二醛和一氧化氮水平升高,減輕細(xì)胞氧化損傷,從而改善腸道微生物群失調(diào)[35]。湯利華等[36]研究發(fā)現(xiàn),山柰酚可通過(guò)抑制DN大鼠NLRP3炎性小體的激活,從而抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)。葉酸可增強(qiáng)機(jī)體免疫能力,因此可用于免疫功能低的便秘患者治療,但目前尚無(wú)公開(kāi)發(fā)表的葉酸與STC相關(guān)的研究文獻(xiàn)。

黃芪可能通過(guò)抗炎、提高免疫力、保護(hù)腸黏膜屏障、調(diào)節(jié)腸道菌群和神經(jīng)遞質(zhì),從而促進(jìn)腸道運(yùn)動(dòng)等過(guò)程改善STC癥狀;通過(guò)調(diào)控對(duì)脂多糖的回應(yīng)、對(duì)細(xì)菌起源的分子的反應(yīng)、薄膜筏、膜微區(qū)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、核受體結(jié)合、類(lèi)固醇激素受體活性、乙型肝炎、IL-17信號(hào)通路等信號(hào)通路發(fā)揮治療STC作用。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與分子對(duì)接技術(shù),探討了黃芪活性成分、靶點(diǎn)、通路之間相互作用的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)黃芪能通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮治療STC的作用,證明了黃芪是通過(guò)多途徑發(fā)揮行氣健脾,通陽(yáng)利水的功效,達(dá)到治療STC的目的,為黃芪用于治療STC的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及臨床研究提供了思路與理論基礎(chǔ)。

利益沖突聲明:無(wú)。