基于“苦堅(jiān)腎”理念對(duì)黃柏改善糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的機(jī)制研究*

趙 麗,王鎖剛,馬繼偉,浩 飛

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000)

糖尿病腎病(diabetes nephropathy,DN)是糖尿病患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,也是造成糖尿病患者死亡的主要原因[1]。DN的組織病理學(xué)改變包括腎小管間質(zhì)纖維化、腎小管炎性浸潤(rùn)、腎小球硬化等[2],其中腎小球硬化可致腎小球?yàn)V過(guò)功能損傷。足細(xì)胞在維持腎小球?yàn)V過(guò)膜通透性方面起到重要作用,其數(shù)目與結(jié)構(gòu)的完整性是腎小球?yàn)V過(guò)作用正常的基礎(chǔ),足細(xì)胞數(shù)目、形態(tài)、功能一旦出現(xiàn)異常會(huì)引起腎小球?yàn)V過(guò)屏障損傷而致腎小球?yàn)V過(guò)率降低,繼而引起蛋白尿,并誘發(fā)腎損傷,推動(dòng)DN疾病進(jìn)展[3]。臨床研究[4]表明:高糖環(huán)境可對(duì)腎小球?yàn)V過(guò)膜造成直接與間接損傷,可導(dǎo)致足細(xì)胞數(shù)目減少并從基底膜脫落。殘余的足細(xì)胞為覆蓋基底膜會(huì)出現(xiàn)足突增寬、代償性肥大等變化,繼而增加腎小球?yàn)V過(guò)膜通透性并誘發(fā)蛋白尿,引起腎功能損傷?？梢?維持足細(xì)胞功能與數(shù)目的穩(wěn)定性是防治DN進(jìn)展的有效手段。黃柏的主要活性成分為生物堿,其中鹽酸小檗堿(berberine hydrochloride,BBR)含量最高。大量臨床研究均證實(shí)了BBR能夠有效減輕蛋白尿,延緩DN疾病進(jìn)展[5-7],但其對(duì)足細(xì)胞的影響尚無(wú)明確定論。本次研究觀察黃柏BBR對(duì)高糖誘導(dǎo)下小鼠足細(xì)胞的保護(hù)作用,以期探討其改善DN足細(xì)胞損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì) 胞

小鼠腎小球足細(xì)胞,購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院,BNCC 337685。

1.2 藥品、試劑與儀器

黃柏BBR,由安徽省立醫(yī)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供,RP-HPLC法檢測(cè)純度≥95%。精密稱取40.365 g BBR粉末,加入生理鹽水10 mL,加熱至BBR完全溶解,配制成1.2×104μmol/L的儲(chǔ)備液,采用0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后分裝保存,使用前溶解稀釋至所需倍數(shù)。 RPMI 1640培養(yǎng)液,美國(guó)賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品,批號(hào)11875;小鼠重組γ干擾素,美國(guó)派普泰克公司產(chǎn)品,批號(hào)315-05-100;胎牛血清,以色列生物工業(yè)公司產(chǎn)品,批號(hào)202005152;四甲基偶氮唑鹽(MTT)粉末,美國(guó)西格瑪奧德里奇公司產(chǎn)品,批號(hào)175252;Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒,南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品,批號(hào)A211-02;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗,美國(guó)派普泰克公司產(chǎn)品,批號(hào)SA00001-1、SA00001-2;磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、叉頭框蛋白01(FOX01)、磷酸化叉頭框蛋白01(p-FOX01)單克隆抗體,美國(guó)艾博抗公司產(chǎn)品,批號(hào)4249、4691S、4060S、2880、9461;抗腎病蛋白(nephrin)、足突蛋白(podocin)、結(jié)蛋白(desmin)、Bcl-2相互作用細(xì)胞死亡介體(Bim)蛋白多克隆抗體,美國(guó)圣克魯斯公司產(chǎn)品,批號(hào)bs-1026R、sc-21009、ab-136894、sc-20235。FC500型流式細(xì)胞儀,美國(guó)貝克曼·庫(kù)爾特公司產(chǎn)品;Elx×808型多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)伯騰儀器有限公司產(chǎn)品;BX53型倒置顯微鏡,日本奧林巴斯公司產(chǎn)品;DYY-10型電泳儀,北京六一儀器廠產(chǎn)品;LAS4000 mini型化學(xué)發(fā)光成像分析儀,美國(guó)通用公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的小鼠足細(xì)胞置于37 ℃水浴復(fù)蘇,RPMI 1640培養(yǎng)液加入100 mL/L胎牛血清、10 g/L雙抗、2 g/L γ干擾素,將細(xì)胞轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入配制好的RPMI 1640培養(yǎng)液,置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi),在37 ℃、50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。隔天換液,待細(xì)胞長(zhǎng)滿75%～80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在33 ℃、50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)滿約30%時(shí)轉(zhuǎn)入37 ℃、50 mL/L CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng),加入RPMI 1640培養(yǎng)液(不含γ干擾素)進(jìn)行細(xì)胞分化,隔天換液。10～14 d細(xì)胞分化成熟,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 足細(xì)胞增殖

采用MTT法檢測(cè)。 取指數(shù)生長(zhǎng)期小鼠足細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度并接種于96孔板,每孔200 μL(約104個(gè)細(xì)胞)。將獲得的小鼠足細(xì)胞分為正常組(5.5 mmol/L葡萄糖)、模型組(30 mmol/L葡萄糖)、不同濃度BBR組(30 mmol/L葡萄糖+BBR 30、60、90 μmol/L)。干預(yù)24 h后,每孔加入10 μL 5 g/L MTT溶液,孵育4 h,棄除上清液,每孔加入150 μL DMSO,震蕩10 min。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm處吸光值并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4.2 足細(xì)胞凋亡

采用Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)。 小鼠足細(xì)胞分組、干預(yù)方式同1.4.1,消化離心收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞,懸浮于500 μL 稀釋5倍的結(jié)合緩沖液,加入10 μL PI和5 μL Annexin V-FITC溶液,混勻后室溫條件下避光孵育5 min,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.4.3 足細(xì)胞遷移能力

采用Transwell小室法檢測(cè)。 24孔板內(nèi)放置Transwell小室,其中加入RPMI 1640培養(yǎng)基(含100 mL/L 胎牛血清),分別給予高糖刺激與不同濃度BBR干預(yù),加入RPMI 1640培養(yǎng)基(含10 mL/L 胎牛血清)配制成單細(xì)胞懸液,并接種在Transwell小室,每孔約2×104個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。將Transwell小室取出,PBS漂洗后采用結(jié)晶紫染色,用棉簽將未遷移至Transwell上室的細(xì)胞輕輕擦去,采用倒置顯微鏡觀察小鼠足細(xì)胞遷移情況。每個(gè)樣本各取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.4.4 足細(xì)胞黏附作用

采用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。 足細(xì)胞傳代消化后,分組及干預(yù)方法同1.4.1。96孔板采用Ⅰ型鼠尾膠原鋪板,再將足細(xì)胞種在96孔板內(nèi)(每孔約1×105個(gè)細(xì)胞)。大部分細(xì)胞貼壁后棄除培養(yǎng)液,未貼壁細(xì)胞用PBS洗去。配制枸櫞酸緩沖液(2.5 g/L Triton X-100+3.75 mmol/L己糖激酶),每孔60 μL加入培養(yǎng)孔內(nèi),37 ℃下孵育1 h,加入甘氨酸緩沖液(含5 mmol/L依地酸二鈉),每孔60 μL(pH值調(diào)整為10.4),測(cè)定405 nm處吸光值,并以正常組吸光值為參考計(jì)算足細(xì)胞黏附能力。

1.4.5 足細(xì)胞標(biāo)志蛋白desmin、nephrin、podocin及PI3K/Akt/FOX01/Bim信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平

采用Western blot檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,分組及干預(yù)方法同1.4.1。將足細(xì)胞種于6孔板(每孔1×108個(gè)細(xì)胞),處理24 h后加入預(yù)冷的PBS洗滌去除雜質(zhì)與死細(xì)胞,加入預(yù)冷的RIPA裂解液100 μL,冰面上靜置30 min。收集細(xì)胞,離心取上清液,加入蛋白上樣緩沖液,沸水煮沸5 min,在SDS-PAGE凝膠上上樣,完成凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作;加入蛋白抗體孵育過(guò)夜,TPBS洗膜,加入一抗,放入4 ℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜;次日TPBS漂洗,加入二抗,37 ℃孵育2 h,ECL顯色,進(jìn)行灰度分析評(píng)估desmin、nephrin、podocin、PI3K、p-Akt、p-FOX01、Bim蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 BBR對(duì)高糖損傷足細(xì)胞增殖的影響

與正常組對(duì)比,模型組足細(xì)胞存活率下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對(duì)比,3個(gè)BBR組的足細(xì)胞存活率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明BBR可以提高足細(xì)胞存活率。見表1。

表1 各組足細(xì)胞存活率對(duì)比

2.2 BBR對(duì)高糖損傷足細(xì)胞凋亡的影響

與正常組對(duì)比,模型組足細(xì)胞凋亡率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對(duì)比,3個(gè)BBR組的足細(xì)胞凋亡率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明BBR可以降低足細(xì)胞凋亡率,且表現(xiàn)出濃度依賴性。見表2、圖1。

注:FITC和PI熒光作雙參數(shù)散點(diǎn)圖,細(xì)胞分為4個(gè)區(qū),左上象限為機(jī)械性損傷細(xì)胞,左下象限為活細(xì)胞,右上象限為凋亡晚期細(xì)胞或壞死細(xì)胞,右下象限為早期凋亡細(xì)胞。

表2 各組足細(xì)胞凋亡率對(duì)比

2.3 BBR對(duì)高糖損傷足細(xì)胞遷移能力的影響

與正常組對(duì)比,模型組遷移至Transwell下室的足細(xì)胞數(shù)量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對(duì)比,3個(gè)BBR組的足細(xì)胞遷移數(shù)量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明BBR可以減少遷移至Transwell下室足細(xì)胞數(shù)量(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 各組足細(xì)胞遷移能力對(duì)比(結(jié)晶紫染色,×200)

表3 各組足細(xì)胞遷移數(shù)量對(duì)比

2.4 BBR對(duì)高糖損傷足細(xì)胞黏附作用的影響

與正常組對(duì)比,模型組黏附細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對(duì)比,3個(gè)BBR組的黏附細(xì)胞百分?jǐn)?shù)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明BBR提高足細(xì)胞黏附能力,且呈現(xiàn)濃度依賴性。見表4。

表4 各組足細(xì)胞黏附能力對(duì)比

2.5 BBR對(duì)高糖損傷足細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

與正常組對(duì)比,模型組足細(xì)胞desmin蛋白表達(dá)上調(diào),nephrin、podocin蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組對(duì)比,60、90 μmol/L BBR 組的標(biāo)志蛋白表達(dá)水平均改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明BBR可以顯著下調(diào)desmin蛋白表達(dá)水平,提高nephrin、podocin蛋白表達(dá)水平。見表5、圖3。

注:1-5依次為正常組,模型組,BBR 30、60、90 μmol/L組

表5 各組足細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)水平對(duì)比

2.6 BBR對(duì)高糖損傷足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與正常組對(duì)比,模型組足細(xì)胞PI3K、p-Akt、Bim蛋白表達(dá)水平上調(diào),p-FOX01蛋白表達(dá)水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組對(duì)比,3個(gè)BBR組的足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平均改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明BBR可以上調(diào)p-FOX01蛋白表達(dá)水平,降低PI3K、p-Akt與Bin蛋白表達(dá)水平。見表6、圖4。

注:1-5依次為正常組,模型組,BBR 30、60、90 μmol/L組

表6 各組足細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平對(duì)比

3 討 論

高血糖是引起足細(xì)胞損傷的重要原因之一。在高糖誘導(dǎo)作用下足細(xì)胞凋亡,而足細(xì)胞凋亡發(fā)生后又會(huì)通過(guò)復(fù)雜機(jī)制誘導(dǎo)剩余的足細(xì)胞發(fā)生凋亡,從而形成惡性循環(huán),推動(dòng)DN疾病進(jìn)展。郭維文等[8]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn):高糖環(huán)境可以誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生凋亡,且凋亡率隨著高糖誘導(dǎo)時(shí)間增長(zhǎng)而增加。可見高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡是一個(gè)緩慢的病理過(guò)程,機(jī)體難以通過(guò)自我調(diào)節(jié)的方式抑制該病理過(guò)程的進(jìn)展。研究證明,BBR具有良好的降糖作用,可以通過(guò)調(diào)控多元醇活化、氧化應(yīng)激反應(yīng)、機(jī)體血糖水平等途徑減輕腎功能損傷[9]。郭維文等[8]發(fā)現(xiàn)BBR可以對(duì)高糖損傷的足細(xì)胞起到保護(hù)作用,有效抑制足細(xì)胞凋亡,從而延緩DN疾病進(jìn)展,故推測(cè)BBR的藥理作用可能與調(diào)節(jié)某種信號(hào)通路有關(guān)。

高雪等[10]發(fā)現(xiàn),芪地糖腎顆?？梢砸种萍?xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路,從而降低大鼠尿白蛋白水平,減輕DN足細(xì)胞損傷。曹璐璐等[11]研究發(fā)現(xiàn),疏利三焦法可以抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)/Smad信號(hào)通路激活,起到抑制足細(xì)胞凋亡、延緩DN疾病進(jìn)展的作用?？梢?各種信號(hào)通路誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致DN進(jìn)展的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn),高糖刺激下,小鼠足細(xì)胞PI3K、p-Akt、Bim蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05),p-FOX01蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。FOXO家族是具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、代謝反應(yīng)、細(xì)胞周期、糖尿病并發(fā)癥等作用的調(diào)節(jié)蛋白,FOX01是可以調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程的重要轉(zhuǎn)錄因子。劉青等[12]研究發(fā)現(xiàn),FOX01蛋白表達(dá)水平受到PI3K/Akt信號(hào)通路磷酸化級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié),p-FOX01表達(dá)水平上調(diào)將減少FOX01核轉(zhuǎn)位并抑制凋亡基因Bim表達(dá),Bim表達(dá)水平下調(diào)使細(xì)胞凋亡受到抑制。加入BBR干預(yù)后,高糖損傷足細(xì)胞p-FOX01蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào),PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著下降,提示BBR對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路起到調(diào)節(jié)作用,通過(guò)PI3K/Akt/FOX01/Bim信號(hào)通路下調(diào)凋亡基因Bim表達(dá)水平從而抑制足細(xì)胞凋亡。裂孔隔膜由nephrin、podocin等足細(xì)胞相關(guān)蛋白分子組成,與足突共同組成腎小球?yàn)V過(guò)屏障的關(guān)鍵部分[13]。馬冰沁等[14]研究發(fā)現(xiàn),腎小球發(fā)生病理變化時(shí)可引起如nephrin、podocin等裂孔隔膜蛋白表達(dá)異常,繼而影響足細(xì)胞正常功能,引起蛋白尿。湯志奇等[15]指出,上調(diào)足細(xì)胞nephrin、podocin表達(dá)水平可以有效保護(hù)腎臟,對(duì)DN起到治療效果。本次研究表明,高糖損傷會(huì)導(dǎo)致nephrin、podocin蛋白表達(dá)水平顯著下降,與上述學(xué)者研究結(jié)果一致。采用BBR干預(yù)后,小鼠足細(xì)胞nephrin、podocin蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)不同水平上調(diào),提示腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能得到修復(fù),可以有效改善蛋白尿,延緩DN疾病進(jìn)展。desmin是肌源性細(xì)胞標(biāo)志物,正常情況下足細(xì)胞無(wú)明顯表達(dá),足細(xì)胞受損時(shí)由于足細(xì)胞骨架重新排列desmin表達(dá)水平會(huì)顯著上調(diào)[16-17]。本研究表明,高糖誘導(dǎo)可顯著上調(diào)小鼠足細(xì)胞desmin表達(dá)水平,采用BBR干預(yù)可以有效降低小鼠足細(xì)胞desmin表達(dá)水平,提示BBR可以減輕足細(xì)胞損傷并改善足細(xì)胞功能。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),在BBR干預(yù)下小鼠足細(xì)胞增殖能力與黏附作用顯著改善,細(xì)胞凋亡率及遷移能力顯著下降,推測(cè)BBR通過(guò)PI3K/Akt/FOX01/Bim信號(hào)通路等途徑抑制足細(xì)胞凋亡,從而提高腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能,繼而改善蛋白尿等癥狀并延緩DN疾病進(jìn)展。

《素問·臟氣法時(shí)論篇》云:“腎欲堅(jiān),急食苦以堅(jiān)之?！薄墩渲槟摇吩?“苦能燥,能堅(jiān)?！惫识苌觥翱嗄軋?jiān)陰”之說(shuō)。其含義為苦寒藥物可以通過(guò)瀉火起到存陰的作用,其中“堅(jiān)陰”指“堅(jiān)腎陰”[18-19]?！兜门浔静荨吩?“以黃柏補(bǔ)水,以其能清自下泛上之陰火……不妨用苦寒者除之?！睔v代醫(yī)家都認(rèn)為:黃柏等苦寒藥物可祛除火邪,使陰液不耗,間接起到滋陰之效,而非滋補(bǔ)腎陰[20-21]。陰傷由火熱亢盛所致,故凡溫?zé)岵∏屑稍缬酶屎擞诳嗪??！鹅o香樓醫(yī)案》云:“陰不足者,陽(yáng)必上亢而內(nèi)燔……徒恃清涼無(wú)益也。”《醫(yī)學(xué)心悟·治法八論》曰:“大抵清火之藥……必歸本于滋陰?！笨梢娪龟幍脠?jiān),需苦寒清熱藥截?cái)嗷馃?陰傷的病理循環(huán)[22]。當(dāng)前“苦堅(jiān)陰”理論在臨床中應(yīng)用廣泛,多用于治療虛火偏旺、陰虛陽(yáng)亢等證。大量臨床研究證實(shí)DN病位在腎臟[23-24],其主要特征是蛋白尿大量排泄,繼而出現(xiàn)腎功能損傷,加之糖尿病患者始終存在腎虛癥狀,故而認(rèn)為DN發(fā)病原因在于腎氣不固。DN屬中醫(yī)學(xué)“腎消”“腎勞”等范疇[25],中醫(yī)證型演變規(guī)律為陰虛燥熱-脾腎氣虛-陰陽(yáng)兩虛[26],黃柏祛除火邪、堅(jiān)固腎陰之效與之相契合。本課題從中醫(yī)學(xué)經(jīng)典理論“內(nèi)熱”出發(fā),將“苦堅(jiān)腎”理論作為切入點(diǎn),以苦味中藥黃柏作為代表藥物,以其有效成分BBR進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證BBR對(duì)足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,并結(jié)合西醫(yī)學(xué)理論,分析BBR改善DN的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明:BBR可以有效減輕高糖誘導(dǎo)引起的足細(xì)胞損傷,減少足細(xì)胞凋亡并改善足細(xì)胞黏附功能,故推測(cè)黃柏通過(guò)“苦堅(jiān)腎”改善DN足細(xì)胞損傷。

綜上所述,BBR能減少小鼠足細(xì)胞凋亡,延緩DN疾病進(jìn)展,推測(cè)與其符合“苦堅(jiān)腎”的特征、能調(diào)節(jié)PI3K/Akt/FOX01/Bim信號(hào)通路有關(guān)。