CRHR1基因rs242941位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘兒童ICS長(zhǎng)期安全用藥的關(guān)系

嚴(yán) 慧,吳小磊,王蘭英,彭建霞,洪 源

河北省唐山市婦幼保健院:1.兒內(nèi)科急診;2.兒內(nèi)科呼吸科;3.兒童保健科;4.兒內(nèi)科門診,河北唐山 063003

支氣管哮喘是兒童常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病,以反復(fù)發(fā)作的喘息、胸悶、咳嗽、呼吸困難為主要表現(xiàn),臨床上容易被誤診為急性支氣管炎、上呼吸道感染,從而干擾治療,不利于預(yù)后[1]。目前,臨床主要治療方案為通過(guò)抗炎治療控制哮喘,主要包括吸入性糖皮質(zhì)激素(ICS)、長(zhǎng)效吸入型β2受體激動(dòng)藥、白三烯調(diào)節(jié)劑等,其中ICS是控制患兒哮喘最有效的藥物之一[2]。ICS主要包括布地奈德、氟替卡松、倍氯米松等,不同藥物用藥的安全性、經(jīng)濟(jì)學(xué)、有效性存在一定程度差異,影響長(zhǎng)期規(guī)律用藥的依從性[3]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)藥物基因?qū)W研究尋找與ICS安全用藥、療效相關(guān)的基因多態(tài)性,可指導(dǎo)臨床個(gè)性化的精準(zhǔn)治療,從而提高長(zhǎng)期用藥的依從性和療效[4-5]。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體1(CRHR1)基因多態(tài)性已被證實(shí)是哮喘兒童ICS治療效果的影響因素[6],其與ICS長(zhǎng)期安全用藥的關(guān)系尚不明確,因此本次研究通過(guò)對(duì)哮喘患兒CRHR1基因rs242941位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析,試圖從分子水平研究該基因位點(diǎn)的多態(tài)性與ICS安全用藥的關(guān)系,進(jìn)而為臨床個(gè)性化治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年10月至2020年10月本院收治的100例哮喘兒童作為研究對(duì)象,均接受糖皮質(zhì)激素治療及常規(guī)對(duì)癥治療,男性58例、女性42例;病程為2～10個(gè)月。研究對(duì)象基于肺通氣功能和哮喘癥狀評(píng)分分為輕度62例(主要癥狀為自覺(jué)癥狀輕微,僅走路快時(shí),感到輕微氣促,吸入支氣管擴(kuò)張劑后峰流速80%)、中度38例(主要癥狀為自覺(jué)呼吸急促,活動(dòng)后更明顯,心跳加快,交流時(shí)使用短語(yǔ),情緒焦慮煩躁,有明顯的哮鳴音,可見(jiàn)三凹征)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)制定的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];(2)年齡 5～14歲,臨床癥狀為咳嗽、胸悶、發(fā)作性喘息,肺部可聞及哮鳴音;(3)心肌酶譜、心電圖檢查正常;(4)家長(zhǎng)同意參與本研究,且患兒能遵醫(yī)囑完成治療療程。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)過(guò)敏性疾病、感染等引發(fā)的咳嗽、胸悶,重癥哮喘;(2)入組前1個(gè)月應(yīng)用相關(guān)藥物;(3)心、肝、腎等重要臟器功能障礙;(4)精神意識(shí)障礙,免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病,對(duì)試驗(yàn)藥物存在禁忌證。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(批件號(hào)2020-026-001)。

1.2方法 入組患兒均接受霧化吸入布地奈德(廠家:英國(guó)AstraZeneca公司,規(guī)格:2 mL/1 mg) 治療,200 μg/次,2次/天,或者霧化吸入丙酸氟替卡松(廠家:英國(guó)葛蘭素史克公司,規(guī)格:125 μg/60撳) 治療,2撳/次,2次/天,或者霧化吸入倍氯美松雙丙酸酯(廠家:Chiesi Farmaceutici S.p.A.,規(guī)格:125 μg/60撳) 治療,2撳/次,2次/天,共治療12周。同時(shí),接受常規(guī)對(duì)癥治療,包括持續(xù)吸氧、控制感染、解痙平喘、祛痰、營(yíng)養(yǎng)支持等。

1.3基因檢測(cè) 基因檢測(cè):患兒入組后采集外周肘靜脈血(乙二胺四乙酸抗凝),采用DNA 抽提試劑盒(北京天根生化科技公司)提取全血基因組DNA,用瓊脂糖電泳(電泳儀廠家:北京六一儀器廠;型號(hào):DYY-10C型)、OneC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛世爾公司)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度,將DNA樣本稀釋至同一濃度,保存于4 ℃。

根據(jù)GenBank、NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)尋找CRHR1基因序列號(hào),借助Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物,CRHR1基因rs242941基因位點(diǎn)引物序列:5′-ACCCAGTGCTGTTTCCTGAG-3′(上游),5′-TTGAGGCCCAGTGACACTTC-3′(下游)。PCR反應(yīng)體系共20.0 μL,包括3.5 μL BigDye sequencing Buffer,1.0 μL Ready Reaction Premix,0.5 μL Taq酶,2.0 μL DNA模版,上、下游引物各1.0 μL,無(wú)菌水定容至20.0 μL。借助熒光定量PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:96 ℃ 1 min預(yù)變性;96 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 4 min,共25個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,應(yīng)用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序,使用BLAST軟件同源性分析測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中已登陸的序列。

1.4觀察指標(biāo) 治療前、治療12周后分別測(cè)定肺通氣功能測(cè)定,包括第1秒用力呼氣容積(FEV1)、用力肺活量(FVC)及FEV1/FCV比值。評(píng)估哮喘控制測(cè)試評(píng)分(ACT評(píng)分)。記錄癥狀及體征完全消失所需天數(shù),以及治療期間不良反應(yīng)發(fā)生情況。

2 結(jié) 果

2.1CRHR1基因rs242941位點(diǎn)分布情況 CRHR1基因rs242941位點(diǎn)存在3種基因型:GG(72例)、GT(20例)、TT(8例),G和T等位基因頻率分別為82%和18%,該位點(diǎn)基因型的期望值、觀測(cè)值符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),表明樣本具有群體代表性,不存在選擇性偏移。

2.2不同基因型患兒基線資料比較 不同基因型患兒基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同基因型患兒基線資料比較

2.3不同基因型患兒治療效果比較 治療12周后不同基因型患兒的ACT評(píng)分、FEV1、FEV1/FCV與治療前比較均明顯提升,其中GG基因型患兒改善情況優(yōu)于GT+TT基因型,GG基因型患兒的癥狀及體征完全緩解時(shí)間明顯短于GT+TT基因型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同基因型患兒治療效果比較

2.4不同基因型患兒安全性比較 主要不良反應(yīng)為面色潮紅、皮膚過(guò)敏、咽部不適、聲音嘶啞,癥狀較輕,無(wú)需特殊處理,治療結(jié)束后1周內(nèi)自行消失,GG基因型不良反應(yīng)發(fā)生率低于GT+TT基因型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同基因型患兒安全性比較

2.5兩組臨床資料比較 研究對(duì)象根據(jù)不良反應(yīng)發(fā)生情況分為未見(jiàn)不良反應(yīng)組、不良反應(yīng)組。兩組CRHR1基因rs242941位點(diǎn)基因型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),兩組其他臨床資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 兩組臨床資料比較

2.6影響哮喘兒童ICS安全用藥的多因素分析 將上述各項(xiàng)指標(biāo)為協(xié)變量,以是否發(fā)生不良反應(yīng)為因變量,具體賦值為年齡、體重指數(shù)、平均病程:實(shí)際值賦值,性別:男=0,女=1,病情嚴(yán)重程度:輕度=0,重度=1,基因型:GG=0,TT或TG=1,不良反應(yīng):否=0,是=1。多因素Logistic回歸分析顯示,rs242941位點(diǎn)基因型多態(tài)性均是影響哮喘兒童ICS安全用藥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 影響ICS安全用藥的多因素 Logistic 回歸分析

3 討 論

支氣管哮喘的發(fā)生與免疫狀態(tài)、遺傳、環(huán)境等因素密切關(guān)聯(lián),目前常規(guī)治療為對(duì)癥治療,緩解哮喘發(fā)作,盡管常用藥物種類眾多,如糖皮質(zhì)激素、抗過(guò)敏藥物、β2受體激動(dòng)劑、抗膽堿藥等,但療效、安全性個(gè)體差異較大,因此研究相關(guān)機(jī)制對(duì)于指導(dǎo)用藥方案的制訂具有重要意義[8-9]。ICS是現(xiàn)階段長(zhǎng)期控制支氣管哮喘患兒哮喘的首選藥物,長(zhǎng)期用藥均存在嚴(yán)重不良反應(yīng),可引起局部刺激,出現(xiàn)輕微的血性分泌物,甚至可能出現(xiàn)與糖皮質(zhì)激素相關(guān)的全身反應(yīng)(皮疹、皮炎、血管性神經(jīng)水腫),從而影響治療的可及性[10]。目前認(rèn)為,遺傳背景不僅影響疾病的發(fā)生、發(fā)展,還能影響機(jī)體對(duì)ICS的應(yīng)答(治療作用、不良反應(yīng)等),且相關(guān)研究已證實(shí)決定糖皮質(zhì)激素遺傳通路的基因突變影響ICS的調(diào)控作用,這些通路包括糖皮質(zhì)激素的生成、活化、與受體結(jié)合、炎性調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄翻譯等。CRHR1屬于糖皮質(zhì)激素作用介導(dǎo)的受體,研究證實(shí)CRHR1基因多態(tài)性與ICS治療有效性存在相關(guān)性,如文獻(xiàn)[11-12]研究發(fā)現(xiàn)CRHR1基因rs1876828位點(diǎn)的多態(tài)性影響ICS療效,其中TT基因型的療效優(yōu)于GG基因型,表明研究基因多態(tài)性可指導(dǎo)用藥方案的選擇,從而提高治療效果。

本研究發(fā)現(xiàn),CRHR1基因rs242941位點(diǎn)存在3種基因型:GG(72例)、GT(20例)、TT(8例),且經(jīng)治療后GG基因型患兒的ACT評(píng)分、FEV1、FEV1/FCV改善情況優(yōu)于GT+TT基因型,GG基因型患兒的癥狀及體征完全緩解時(shí)間明顯短于GT+TT基因型,表明CRHR1基因rs242941位點(diǎn)基因多態(tài)性影響ICS治療有效性,其中GG基因型可增加治療效果。分析認(rèn)為,CRHR1上游是促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素,通過(guò)刺激促腎上腺皮質(zhì)激素的分泌而刺激皮質(zhì)醇的分泌,發(fā)揮良好的抗炎作用,其中GG基因型患兒對(duì)糖皮質(zhì)激素應(yīng)答較強(qiáng),促進(jìn)糖皮質(zhì)激素遺傳通路的信號(hào)傳遞[13],故而GG基因型患兒抗炎效果較佳,肺功能恢復(fù)情況較好。KIM等[14]研究發(fā)現(xiàn),慢性阻塞性肺部疾病中rs242941位點(diǎn)GG基因型對(duì)于吸入糖皮質(zhì)激素治療的應(yīng)答率明顯高于GT基因型,且FEV1改善效果較GT基因型更佳,結(jié)合本研究結(jié)果,進(jìn)一步證實(shí)rs242941位點(diǎn)基因多態(tài)性影響ICS治療有效性。

盡管布地奈德的非特異性抗炎及抑制變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)度明顯高于氫化可的松,可有效降低氣道高反應(yīng)性,小劑量霧化吸入能保證良好的治療效果,全身不良反應(yīng)少,但哮喘患兒長(zhǎng)期ICS時(shí)的用藥安全一直是臨床關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題[15]。本研究發(fā)現(xiàn),GG基因型不良反應(yīng)發(fā)生率低于GT+TT基因型,且通過(guò)Logistic回歸分析顯示,rs242941位點(diǎn)基因型多態(tài)性是影響患者用藥安全的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),表明CRHR1基因rs242941位點(diǎn)多態(tài)性可影響ICS治療的安全性,其中GG基因型作為保護(hù)因素,能明顯降低不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),利于ICS的長(zhǎng)期使用。CRHR1基因rs242941位點(diǎn)的G變異為T,該變異導(dǎo)致CRHR1基因功能下調(diào),降低了促腎上腺皮質(zhì)激素分泌,抑制機(jī)體受炎癥刺激而增加皮質(zhì)醇分泌的潛能,進(jìn)而增加氣道炎癥反應(yīng),影響治療的安全性,特別是大劑量長(zhǎng)期使用時(shí),均會(huì)增加全身作用發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[16-17]。因此,基因檢測(cè)可為個(gè)性化的抗哮喘治療提供指導(dǎo),是臨床藥師開(kāi)展個(gè)體化精準(zhǔn)藥學(xué)服務(wù)的切入點(diǎn),盡可能降低不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),及時(shí)控制哮喘,以期獲得更好的治療效果。此次研究存在一定局限性,單中心研究,納入例數(shù)較少,抽樣缺乏代表性,統(tǒng)計(jì)分析可能存在偏倚,同時(shí),對(duì)于CRHR1基因rs242941位點(diǎn)基因突變導(dǎo)致不良反應(yīng)增加的具體作用機(jī)制尚未完全明確,仍需通過(guò)機(jī)制研究進(jìn)行深入探討。

綜上所述,CRHR1基因rs242941位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘兒童ICS的療效及長(zhǎng)期用藥安全性密切關(guān)聯(lián),其中TT基因型患兒具有更高的ICS不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。