缺氧誘導(dǎo)因子-1抑制劑與紫杉醇聯(lián)合使用治療大鼠卵巢癌的研究

李 欣,王 波,安仲武,李海英,薄維波,關(guān) 輝

連云港市東方醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇連云港 222000

機(jī)體的功能和生存依賴于細(xì)胞可獲得的充足的氧氣供應(yīng),動(dòng)物在有氧狀態(tài)下利用糖酵解、氧化磷酸化等途徑來分解體內(nèi)的糖。在這些過程中,氧被用作電子受體,低效的電子轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致氧物種的產(chǎn)生,電子逸出會(huì)導(dǎo)致超氧陰離子和/或羥基自由基的產(chǎn)生,這些物質(zhì)都被稱為活性氧物質(zhì)(ROS)[1]。研究表明,ROS的增加與電子傳遞鏈中生理氧分壓的偏離有關(guān)[2]。因此,通過動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制嚴(yán)格調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧濃度是非常必要的。所有實(shí)體腫瘤的特點(diǎn)都是缺氧,缺氧可通過病理性或非病理性條件在生物體中誘導(dǎo)應(yīng)激,后果包括DNA鏈斷裂、DNA氧化損傷以及阻礙細(xì)胞生長甚至細(xì)胞死亡[3]。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是一種異源二聚體蛋白,由缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1ɑ)和缺氧誘導(dǎo)因子-1β(HIF-1β)兩個(gè)亞基組成[4]。其中ɑ亞基為氧敏感亞基,受缺氧誘導(dǎo)因子脯氨酸羥化酶(PHD)的嚴(yán)格調(diào)控,PHD能夠羥基化ɑ亞基上的特定脯氨酸殘基,在缺氧過程中,PHD活性的降低穩(wěn)定了HIF-1ɑ,導(dǎo)致其移位到細(xì)胞核,與HIF-1β 結(jié)合形成復(fù)合物,該復(fù)合體與含有缺氧反應(yīng)元件的靶基因結(jié)合,激活不同信號(hào)通路的基因表達(dá)[5]。HIF-1可以被認(rèn)為是一種信使,它向細(xì)胞核遷移,激活對(duì)缺氧的轉(zhuǎn)錄反應(yīng),參與腫瘤的轉(zhuǎn)移、生長、發(fā)生、血管生成和侵襲等基因調(diào)控。在缺氧條件下,HIF-1α解離并在細(xì)胞內(nèi)快速積聚,然后移位到細(xì)胞核內(nèi),并與HIF-1α調(diào)控基因啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合。過表達(dá)的HIF-1α通過增強(qiáng)血管生成、侵襲和糖酵解等途徑促進(jìn)癌細(xì)胞存活。HIF-1α被認(rèn)為是控制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要因素,因此,抑制HIF-1α活性可能在癌癥治療中具有廣泛的臨床應(yīng)用[6-7]。紫杉醇是一種天然抗癌物,它能夠使微管蛋白和微管蛋白二聚體失去動(dòng)態(tài)平衡,促進(jìn)微管蛋白聚合,防止解聚,使微管穩(wěn)定,從而抑制癌細(xì)胞的有絲分裂,觸發(fā)癌細(xì)胞凋亡,進(jìn)而有效阻止癌細(xì)胞的增殖,起到抗癌作用,目前在臨床上已經(jīng)廣泛用于乳腺癌、卵巢癌的治療。LW6是新型的HIF-1抑制劑,抑制作用強(qiáng),因此選取該抑制劑。本研究將常規(guī)紫杉醇化療法與HIF-1抑制劑聯(lián)合使用,觀察其在荷實(shí)體瘤大鼠中的作用,以探討兩者聯(lián)合使用是否更有利于阻止腫瘤的進(jìn)展,為臨床治療腫瘤提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 40只雌性SPF級(jí)SD大鼠,日齡30～35 d,體重100～120 g,由連云港市東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化中心提供;卵巢癌NUTU-19細(xì)胞株購自上海美軒生物科技有限公司。

1.2主要試劑 紫杉醇注射液購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司;HIF-1抑制劑LW6購自北京百奧萊博科技有限公司;TNF 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、HIF-1 ELISA試劑盒購自上海江萊實(shí)業(yè)股份有限公司;10%中性甲醛購自北京索萊寶科技有限公司;組織RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒及PCR反應(yīng)液均購買于上海江萊實(shí)業(yè)股份有限公司。

1.3方法

1.3.1構(gòu)建卵巢癌SD大鼠模型 將卵巢癌NUTU-19細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),通過離心法收集細(xì)胞,將收集后的細(xì)胞用完全培養(yǎng)液重懸,密度調(diào)節(jié)至2×107個(gè)/mL。取40只雌性SPF級(jí)SD大鼠,于右側(cè)腋窩皮下注射0.2 mL已預(yù)先準(zhǔn)備好的人卵巢腺癌NUTU-19腫瘤細(xì)胞懸液(約含2×107個(gè)活細(xì)胞),皮膚隆起為注射有效。在結(jié)節(jié)形成后每天用游標(biāo)卡尺記錄其最長徑(a)及最短徑(b),待出現(xiàn)大鼠體重減輕、毛發(fā)干枯、活動(dòng)能力下降,并且當(dāng)右下腋窩處腫瘤大小成長到0.4 cm×0.4 cm時(shí)認(rèn)為造模成功。

1.3.2分組及給藥 取造模成功的SPF級(jí)SD大鼠40只,分4組,每組10只,分別為模型對(duì)照組、常規(guī)化療組、HIF-1抑制劑組及聯(lián)合治療組,其中模型對(duì)照組腹腔注射生理鹽水,每天注射2次,每次0.2 mL,連續(xù)注射4 d,間隔3 d后,再連續(xù)注射4 d;常規(guī)化療組注射紫杉醇注射液,20 mg/kg,腹腔注射,每天注射2次,每次0.2 mL,連續(xù)注射4 d,間隔3 d后,再連續(xù)注射4 d;HIF-1抑制劑組注射HIF-1抑制劑LW6,2.5 mg/mL,腹腔注射,每次0.2 mL,連續(xù)注射4 d,間隔3 d后,再連續(xù)注射4 d;聯(lián)合治療組同時(shí)注射紫杉醇和LW6,紫杉醇及LW6給藥劑量同上,腹腔注射,每天注射2次,每次0.2mL,連續(xù)注射4 d,間隔3 d后,再連續(xù)注射4 d。

1.3.3檢測指標(biāo) (1)稱重。停藥后每天觀察大鼠的精神狀態(tài),每隔2天稱重1次,停藥1周后,處死大鼠,分離腫瘤組織,對(duì)腫瘤的重量進(jìn)行稱重統(tǒng)計(jì)。(2)TNF及HIF-1檢測。取腫瘤組織100 mg,按重量體積比加PBS 900 μL,通過研磨法制備成10%組織勻漿液,3 000 r/min,離心20 min,收集上清,凍存于-20 ℃冰箱備用,通過ELISA法檢測腫瘤壞死因子(TNF)和HIF-1水平。(3)HE-4及CA125水平檢測。心臟采血,收集血液,3 000 r/min,離心10 min,收集血清,保存到-20 ℃冰箱備用,通過化學(xué)發(fā)光法檢測大鼠血清中HE4、CA125水平。(4)原癌基因細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)量的檢測。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,利用熒光定量PCR技術(shù)檢測腫瘤組織中Cyclin D1、PCNA表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組荷卵巢癌大鼠腫瘤重量比較 模型對(duì)照組荷卵巢癌大鼠腫瘤重量為(0.91±0.06)g,常規(guī)治療組荷卵巢癌大鼠腫瘤重量為(0.68±0.03)g,HIF-1抑制劑組荷卵巢癌大鼠腫瘤重量為(0.49±0.03)g,聯(lián)合治療組荷卵巢癌大鼠腫瘤重量為(0.32±0.04)g,常規(guī)治療組荷卵巢癌大鼠腫瘤重量明顯低于模型對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);HIF-1抑制劑組及聯(lián)合治療組荷卵巢癌大鼠腫瘤重量明顯低于常規(guī)治療組及模型治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2兩組腫瘤組織中 TNF及HIF-1水平比較 常規(guī)治療組腫瘤組織中TNF 及HIF-1水平明顯低于模型對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);HIF-1抑制劑組和聯(lián)合治療組腫瘤組織中TNF 及HIF-1水平明顯低于模型對(duì)照組和常規(guī)治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);聯(lián)合治療組腫瘤組織中TNF 及HIF-1水平顯著低于HIF-1抑制劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組腫瘤組織中TNF、HIF-1水平比較

2.3各組大鼠血清中HE-4及CA125水平比較 常規(guī)治療組大鼠血清中HE4及CA125水平明顯低于模型對(duì)照組,HIF-1抑制劑組和聯(lián)合治療組HE4及CA125水平明顯低于模型對(duì)照組和常規(guī)治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);聯(lián)合治療組HE4及CA125水平明顯低于HIF-1抑制劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清中HE4及CA125水平比較

2.4各組大鼠血清中 Cyclin D1 及PCNA表達(dá)量比較 聯(lián)合治療組Cyclin D1及PCNA表達(dá)量明顯低于模型對(duì)照組及常規(guī)治療組和HIF-1抑制劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);常規(guī)治療組和HIF-1抑制劑組Cyclin D1 及PCNA表達(dá)量明顯低于模型對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中 Cyclin D1 及PCNA表達(dá)量比較

3 討 論

卵巢癌目前是女性癌癥相關(guān)死亡的第五大原因,卵巢癌在早期并無明顯癥狀,當(dāng)被確診時(shí)多為中晚期,錯(cuò)過了治療的最佳時(shí)間,因此病死率高[8]。由于確診困難,使得治療難度增加,因此需要在卵巢癌的治療上尋求新的突破。

有研究表明,缺氧是實(shí)體瘤的共同特征,在腫瘤的惡性病變中有著至關(guān)重要的作用,在缺氧的狀態(tài)下,HIF-1通過上調(diào)致癌基因的轉(zhuǎn)錄,在腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧和營養(yǎng)缺乏的條件中發(fā)揮關(guān)鍵作用,HIF-1的過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。本研究結(jié)果表明,HIF-1抑制劑組及聯(lián)合治療組荷卵巢癌大鼠腫瘤重量明顯低于模型組及常規(guī)治療組,說明抑制HIF-1的表達(dá),能夠抑制卵巢癌的進(jìn)展。聯(lián)合治療組荷卵巢癌大鼠腫瘤重量明顯低于HIF-1抑制劑組,說明HIF-1抑制劑及紫杉醇的聯(lián)合使用更有利于阻止卵巢癌的進(jìn)展。

此外,本研究結(jié)果顯示,常規(guī)治療組腫瘤組織中HIF-1水平明顯低于模型對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明在腫瘤組織中HIF-1確實(shí)過表達(dá),HIF-1參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。TNF 可通過與細(xì)胞膜表面的TNF受體直接結(jié)合介導(dǎo)對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用、抑制腫瘤細(xì)胞生長或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[10]。本研究常規(guī)治療組腫瘤組織中TNF水平明顯低于模型對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明隨著卵巢癌的進(jìn)展,TNF 水平逐步升高,與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。HIF-1抑制劑組和聯(lián)合治療組腫瘤組織中TNF水平明顯低于模型對(duì)照組和常規(guī)治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明HIF-1抑制劑組及聯(lián)合治療組干預(yù)了卵巢癌的發(fā)病過程,能夠抑制腫瘤組織的發(fā)生與發(fā)展。

HE4是參與精子成熟過程的蛋白酶抑制劑,有研究表明HE4在血清和組織中的高表達(dá)與多種癌癥類型有關(guān),這預(yù)示著HE4或許能夠?yàn)榕R床診斷及治療腫瘤提供參考[11]。CA125是腫瘤標(biāo)志物糖類抗原之一,能夠用于輔助診斷卵巢癌[12]。本研究卵巢癌模型大鼠HE4及CA125水平均呈高表達(dá),抑制HIF-1的表達(dá)后,HE4及CA125水平顯著降低,與紫杉醇聯(lián)合使用后,大鼠血清中的HE4及CA125水平降低更為顯著,表明抑制HIF-1的表達(dá)能夠有效控制卵巢癌的進(jìn)展,與紫杉醇聯(lián)合使用后,對(duì)卵巢癌的發(fā)展有更明顯的抑制作用。

有研究表明Cyclin D1及PCNA與卵巢癌進(jìn)展直接相關(guān),Cyclin D1能夠加速癌細(xì)胞周期,PCNA能夠加速DNA復(fù)制,共同促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]。本研究聯(lián)合治療組Cyclin D1及PCNA表達(dá)量明顯低于其他3組,表明HIF-1抑制劑及紫杉醇的聯(lián)合使用對(duì)腫瘤組織中的癌基因具有調(diào)控作用,能夠減少原癌基因的表達(dá),從而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。

綜上所述,抑制HIF-1的表達(dá)能夠抑制腫瘤的生長,降低腫瘤組織中TNF 的表達(dá),降低大鼠血清中HE4及CA125水平,同時(shí)也降低了Cyclin D1 及PCNA的表達(dá),而常規(guī)紫杉醇化療法與HIF-1抑制劑聯(lián)合使用,更有利于阻止卵巢癌的進(jìn)展,可為臨床治療卵巢癌提供新的思路。